專利名稱：山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應(yīng)用，是一種利用微生物
黑曲霉降低山葡萄酒中酒石酸含量的方法，屬于食品加工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
山葡萄產(chǎn)于我國(guó)東北地區(qū)，與歐亞種釀酒葡萄相比存在較大差異，其含糖量很低， 一般為130 150g/L，而含酸量卻很高，其成熟果實(shí)的可滴定酸含量就在15 25g/L(以酒 石酸計(jì))之間。但是正常干型葡萄酒要求酸度在8g/L左右。而目前針對(duì)山葡萄酒的降酸 問(wèn)題還未提出有效的解決方法，因此，山葡萄酒的降酸方法有待進(jìn)一步提高。
傳統(tǒng)的降酒石酸方法是通過(guò)物理方法和化學(xué)方法處理達(dá)到降酸目的，但傳統(tǒng)的方 法需要借助冷凍設(shè)備及需要消耗大量的酒石酸鉀，能源消耗和生產(chǎn)成本較大，并且口感不 協(xié)調(diào)，降酸幅度達(dá)不到理想標(biāo)準(zhǔn)。雖然隨著現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，目前 研究出了針對(duì)蘋果酸的微生物降酸方法，而利用生物技術(shù)降低酒石酸在目前卻沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應(yīng)用，其采用 生物技術(shù)篩選能降解酒石酸的微生物——黑曲霉菌，并利用該微生物降低山葡萄酒中的酒 石酸含量，確定最佳的降酸參數(shù)，以解決葡萄酒中酒石酸的生物降解問(wèn)題，從而達(dá)到降酸的 目的，更好地控制并且容易操作，能更好地改善山葡萄酒的品質(zhì)。 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應(yīng) 用，其特征在于降解山葡萄酒中酒石酸的有效菌為黑曲霉，具體的篩選方法如下采集葡 萄園土壤和生產(chǎn)酒石酸工廠附近的土壤的土樣2g定量加到盛有100mL無(wú)菌生理鹽水的三 角瓶中，并加入8 12粒無(wú)菌玻璃珠(直徑為3 5mm)，充分振蕩后靜置，取上清液再分別 加入到以濃度為2g/L的酒石酸為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為28t:，160r/min，搖床振蕩培養(yǎng)，以72h為一個(gè)周期，每個(gè)周期結(jié)束后，按照以上的操作， 依次將所培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基中，同時(shí)酒石酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/ L逐漸遞增到10g/L ;再通過(guò)初篩和復(fù)篩后選出對(duì)酒石酸具有較好降酸效果的菌種黑曲霉；
將篩選得到的降酸菌——黑曲霉用平板劃線法進(jìn)行多次分離純化后，挑取單菌落 接入到Y(jié)EPD斜面培養(yǎng)基上于2『C培養(yǎng)72h后fC保存。
降酸應(yīng)用過(guò)程如下 將山葡萄原料進(jìn)行破碎后加入0. 05%的果膠酶和100mg/L的S02，浸汁12小時(shí)后 用汁渣分離機(jī)進(jìn)行分離壓榨出汁，澄清后進(jìn)行降酸發(fā)酵，在30 35t:條件下接入降酒石酸 有效菌——黑曲霉后再對(duì)葡萄汁進(jìn)行澄清處理，酒精發(fā)酵是在20 25t:條件下接入釀酒 酵母菌，酒精發(fā)酵結(jié)束后再進(jìn)行澄清、分離，最后進(jìn)入陳釀工序。 菌種鑒定通過(guò)對(duì)篩選后的菌落形態(tài)、個(gè)體顯微形態(tài)和分子生物進(jìn)行鑒定，如圖1 所示，對(duì)所篩選出的具有較高降酸效果的菌株F1進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、顯微形態(tài)觀察、生理
3生化試驗(yàn)鑒定以及分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)。最終通過(guò)鑒定試驗(yàn)確定篩選所得到的具有降酒 石酸能力的菌株(命名為F1)屬于曲霉屬[Aspergillus Micheli ex Fr.]中的黑曲霉組 [A. niger]。
不同因素對(duì)菌株F1降解酒石酸情況的影響考慮的因素主要有接種量、溫度、酒
石酸濃度、通氣量和菌齡；其中溫度和接種量對(duì)降酸率的影響較為明顯。產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)菌株耐酒精度4%以上；菌株耐S02濃度為400mg/L ;酒石酸降解率
50%以上，可適應(yīng)山葡萄酒的降酸要求。
檢測(cè)方法酸度檢測(cè)采用氫氧化鈉滴定法(以酒石酸計(jì))。 本發(fā)明的積極效果是采用微生物——黑曲霉降解葡萄酒中的酒石酸，是在35t:溫 度下靜止培養(yǎng)3d后，降酸率能達(dá)到70%以上，該菌株具有較高的耐S02能力，對(duì)酒精的耐受 性能達(dá)到4%以上，該黑曲霉采用巴氏殺菌的方式在65t:、30min或85t:、5min即可達(dá)到殺 菌的目的，并且通過(guò)毒性鑒定試驗(yàn)確定該黑曲霉菌株無(wú)任何毒副作用，可以運(yùn)用到葡萄酒 的生產(chǎn)工藝中；與以往的物理降酸方法和化學(xué)降酸方法相比，它不需要采用任何特殊設(shè)備 及原料，成本低，降酸操作過(guò)程容易控制，也不會(huì)向葡萄酒中引入其他金屬離子，且降酸率 較高。試驗(yàn)得出將菌齡為4d的菌種以4X的接種量(孢子液濃度為8X106個(gè)/ml)接入到 以酒石酸為唯一碳源的培養(yǎng)液中，在35t:、160r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4d后，其降酸 率能達(dá)到89%。


圖1為本發(fā)明篩選得到的10株菌株對(duì)酒石酸的降解率的比較圖表；
圖2為本發(fā)明的溫度對(duì)降解率的影響圖；
圖3為本發(fā)明的接種量對(duì)降解率的影響；
圖4為本發(fā)明的通氣量對(duì)降解率的影響；
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述
實(shí)施例1 :
1、菌種篩選； (1)富集培養(yǎng)將采集的樣品定量加到無(wú)菌生理鹽水中，加數(shù)粒玻璃珠，充分振蕩 后靜置取上清液分別加入到以酒石酸(酒石酸濃度為2g/L)為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基 中，28t:，160r/min，搖床振蕩培養(yǎng)72h。 72h為一個(gè)周期，每個(gè)周期結(jié)束后，按照以上的操 作，依次將所培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)多次。同時(shí)酒石酸濃度 由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L。 (2)初篩在富集培養(yǎng)后取一定量的富集菌液，用生理鹽水稀釋到10—5，選擇10—3、 10—4、 10—5稀釋度，分別吸取0. 5mL稀釋液涂布于含酒石酸濃度為10g/L的瓊脂平板培養(yǎng)基 上，2『C恒溫培養(yǎng)72h。將所得的典型單菌落點(diǎn)植于分離培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)。
(3)復(fù)篩將初篩所得到的單菌落用平板劃線法進(jìn)行多次分離純化，挑取單菌落 接入YEPD斜面培養(yǎng)基于28。C培養(yǎng)72h后4。C保存。
2、菌種鑒定
(1)菌落形態(tài)觀察；將分離出的菌株分別接種于各種類型的培養(yǎng)基上，在3(TC下 培養(yǎng)3-4d，對(duì)形成的菌落進(jìn)行特征觀察并記錄。
(2)顯微形態(tài)觀察；采用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。
(3)生化試驗(yàn)鑒定；對(duì)篩選出的菌株做淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、M R試驗(yàn)、硝
酸鹽還原試驗(yàn)等各種生化鑒定試驗(yàn)，觀察菌株對(duì)各種碳源和氮源的利用情況。 (4)分子生物學(xué)鑒定；測(cè)定該菌株的ITS保守序列組成，并與Genbank中的相關(guān)
序列進(jìn)行比對(duì)，以確定該菌的具體種類。結(jié)果得出該菌株的ITS基因序列與黑曲霉的同
源性和相似性分別為98%、99%，可鑒定該菌株為半知菌類[F皿gi Imperfecti]、曲霉屬中的黑曲霉組[A. niger]。 3、菌種特性 (1)菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定；將菌株以相同的接種量接入多瓶相同體積的培養(yǎng)液 中，在30°C ， 160r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每隔24h取出三瓶培養(yǎng)液過(guò)濾菌絲體并稱量菌絲體 干重，取其平均值以確定菌株的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果得到該菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為4 6d。
(2)最適生長(zhǎng)溫度；將菌株以相同的接種量接入多瓶相同體積的培養(yǎng)液中，分別 在18"、2(TC、25t:、28t:、3(rC、35t:的條件下160r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每個(gè)溫度做三個(gè)處 理，培養(yǎng)3d后過(guò)濾稱量菌絲體干重，結(jié)果得出該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為30°C 。
(3)最適生長(zhǎng)pH值；將菌株以相同的接種量分別接入pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、 4. 0、4. 5、5. 0的相同體積培養(yǎng)液中，在30°C， 160r/min條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每個(gè)酸度做三 個(gè)處理，培養(yǎng)3d后過(guò)濾稱量菌絲體干重，結(jié)果得到該菌株的最適宜生長(zhǎng)pH為3. 0。
(4)最適生長(zhǎng)通氣量；將菌株以相同的接種量分別接入到50、100、150、200、250、 300、350mL的液體培養(yǎng)基中，在30°C ， 160r/min條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每個(gè)通氣量做三個(gè)處 理，培養(yǎng)3d后過(guò)濾稱量菌絲體干重，結(jié)果得出該菌株的最適生長(zhǎng)通氣量為300ml 。。
4、菌種耐受性試驗(yàn) (1)耐S02試驗(yàn)；S02添加劑為固體偏重亞硫酸鉀，其理論S02含量為57% 。將純化 的菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后分別接種到S02濃度為50 500mg/L不等的固體培養(yǎng)基上，3(TC恒 溫培養(yǎng)，得出該菌株能耐受的S02濃度為400mg/L。 (2)菌種耐酒精試驗(yàn)；將純化的菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后接種到含1%無(wú)水乙醇的 lOOmL液體培養(yǎng)基中，于30°C 、 160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72h后，在依次轉(zhuǎn)入無(wú)水乙醇含量分 別為2%、3%、4%、5% (體積比)的裝有100mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在相同條件 下培養(yǎng)，得出該菌株對(duì)酒精的耐受情況能達(dá)到4%以上。
5、降解參數(shù)測(cè)定 (1)不同接種量對(duì)降酸效果的影響；將培養(yǎng)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的Fl孢子用無(wú)菌水洗下 制成孢子液后，分別以1 % 、2 % 、3 % 、4 % 、5 % 、6 %的接種量接種到以酒石酸為唯一碳源的 培養(yǎng)液中，于30°C 、 160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4d后，采用氫氧化鈉滴定法測(cè)降酸量，結(jié)果得到 當(dāng)接種量為4% (孢子液濃度為8X106個(gè)/ml)時(shí)，降酸效果明顯。 (2)不同菌齡對(duì)降酸效果的影響；將培養(yǎng)3d、4d、5d、和6d的菌種Fl以相同的接種 量接入到以酒石酸為唯一碳源的培養(yǎng)液中，于3(TC、160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4d后，采用氫 氧化鈉滴定法測(cè)降酸量，結(jié)果得到菌齡為4d的菌株降酸效果好。 (3)不同溫度對(duì)降酸效果的影響；如圖2所示，將菌種Fl以相同的接種量接種到以酒石酸為唯一碳源的培養(yǎng)液中，分別在20°C 、25°C 、28°C 、30°C 、35°C和37°C的溫度下培
養(yǎng)4d后，采用氫氧化鈉滴定法測(cè)降酸量，結(jié)果得到在35t:條件下降酸幅度大。 (4)不同酒石酸濃度對(duì)降酸效果的影響；如圖3所示，將菌種Fl以相同的接種量
接種到以酒石酸為唯一碳源的培養(yǎng)液中，酒石酸濃度分別為lg/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、
llg/L和13g/L，于30°C、160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4d后，采用氫氧化鈉滴定法測(cè)降酸量，結(jié)
果得到酒石酸濃度的大小對(duì)該菌株的降酸效果無(wú)明顯影響。 (5)不同通氣量對(duì)降酸效果的影響；如圖4所示，將菌種F1以1ml的接種量分別接 種到以酒石酸為唯一碳源裝液量分別為50ml、 100ml、 150ml、200ml、250ml、300ml和350ml 的液體培養(yǎng)基中，于30°C 、 160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4d后，采用氫氧化鈉滴定法測(cè)降酸量，結(jié) 果得出菌株在通氣量為100ml的條件下降酸效果好。
權(quán)利要求
一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于降解山葡萄酒中酒石酸的有效菌為黑曲霉，具體的篩選方法如下采集葡萄園土壤和生產(chǎn)酒石酸工廠附近的土壤的土樣2g定量加到盛有100mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，并加入8～12粒無(wú)菌玻璃珠(直徑為3～5mm)，充分振蕩后靜置，取上清液再分別加入到以濃度為2g/L的酒石酸為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃，160r/min，搖床振蕩培養(yǎng)，以72h為一個(gè)周期，每個(gè)周期結(jié)束后，按照以上的操作，依次將所培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基中，同時(shí)酒石酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L；再通過(guò)初篩和復(fù)篩后選出對(duì)酒石酸具有較好降酸效果的菌種黑曲霉；將篩選得到的降酸菌——黑曲霉用平板劃線法進(jìn)行多次分離純化后，挑取單菌落接入到Y(jié)EPD斜面培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)72h后4℃保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所示的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于所述 的降酸應(yīng)用過(guò)程如下將山葡萄原料進(jìn)行破碎后加入0. 05%的果膠酶和100mg/L的S(^，浸汁12小時(shí)后用 汁渣分離機(jī)進(jìn)行分離壓榨出汁，澄清后進(jìn)行降酸發(fā)酵，在30 35t:條件下接入酒石酸降解 菌一一黑曲霉后再對(duì)葡萄汁進(jìn)行澄清處理，酒精發(fā)酵是在20 25t:條件下接入釀酒酵母 菌，酒精發(fā)酵結(jié)束后再進(jìn)行澄清、分離，最后進(jìn)入陳釀工序。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所示的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于所述 的初篩過(guò)程如下在富集培養(yǎng)后取一定量的富集菌液，用生理鹽水稀釋到10—5，選擇10一3、 10—4、 10—5稀釋度，分別吸取0. 5mL稀釋液涂布于含酒石酸濃度為10g/L的瓊脂平板培養(yǎng)基 上，2『C恒溫培養(yǎng)72h。將所得的典型單菌落點(diǎn)植于分離培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所示的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于所述 的復(fù)篩過(guò)程如下將初篩所得到的單菌落用平板劃線法進(jìn)行多次分離純化，挑取單菌落接 入YEPD斜面培養(yǎng)基于28。C培養(yǎng)72h后4。C保存。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所示的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于所述 的菌種鑒定方法如下(1) 菌落形態(tài)觀察；將分離出的菌株分別接種于各種類型的培養(yǎng)基上，在3(TC下培養(yǎng) 3-4d，對(duì)形成的菌落進(jìn)行特征觀察并記錄。(2) 顯微形態(tài)觀察；采用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。(3) 生化試驗(yàn)鑒定；對(duì)篩選出的菌株做淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、硝酸鹽 還原試驗(yàn)等各種生化鑒定試驗(yàn)，觀察菌株對(duì)各種碳源和氮源的利用情況。(4) 分子生物學(xué)鑒定；測(cè)定該菌株的ITS保守序列組成，并與Genbank中的相關(guān)序 列進(jìn)行比對(duì)，以確定該菌的具體種類。結(jié)果得出該菌株的ITS基因序列與黑曲霉的同源 性和相似性分別為98%、99%，可鑒定該菌株為半知菌類[Fungi Imperfecti]、曲霉屬 [AspergillusMicheli ex Fr.]中的黑曲霉組[A. niger]。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應(yīng)用，其特征在于采集葡萄園土壤和生產(chǎn)酒石酸工廠附近的土壤的土樣加到無(wú)菌生理鹽水中，加入玻璃珠，充分振蕩后靜置，取上清液再分別加入到以濃度為2g/L的酒石酸為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃，160r/min，搖床振蕩培養(yǎng)，以72h為一個(gè)周期，每個(gè)周期結(jié)束后，按照以上的操作，依次將所培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基中，同時(shí)酒石酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L；再通過(guò)初篩和復(fù)篩后選出對(duì)酒石酸具有較好降酸效果的菌種黑曲霉；其不需要特殊設(shè)備及原料，成本低，降酸操作過(guò)程容易控制，且降酸率能達(dá)到89％。
文檔編號(hào)C12R1/685GK101735957SQ201010030818
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者文連奎, 王治同, 趙薇, 邊忠博 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)