專利名稱：一種微生物酶法拆分dl-半胱氨酸制備d-胱氨酸和l-色氨酸的方法
一種微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制備D-胱氨酸和L-色
氨酸的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領域，涉及通過微生物酶法拆分DL-半胱氨酸生產(chǎn)D-胱氨酸和L-色氨酸的方法。
背景技術(shù)：
胱氨酸是重要醫(yī)藥中間體，也常用于制備復方氨基酸口服制劑或輸液、染化劑、化 妝品、乳制品添加劑、油脂抗氧劑等；還可用于重金屬解毒劑、肝炎等藥物。胱氨酸具有促 進機體細胞氧化還原能力，增強白血球以防止病原菌感染，可用于治療白血球減少癥、冠心 病，防治脂肪肝、肝硬化，促毛發(fā)生長、防皮膚老化，也可用于傷寒痢疾、流感、氣喘、神經(jīng)痛、 濕疹及各種中毒等疾患的治療。D-胱氨酸為D-半胱氨酸的二聚體，通過還原手段可以有效獲得重要的藥物中間 體D-半胱氨酸。D-半胱氨酸是一種非天然氨基酸，可廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料 等行業(yè)，是手性藥物的重要中間體，如D-半胱氨酸是合成第三代頭孢菌素——頭孢米諾鈉 的重要原料，在7β位側(cè)鏈末端引入了 D-半胱氨酸，具有很強的殺菌作用，可以用于治療 呼吸道感染；由D-半胱氨酸衍生得到的D-青霉胺可作為解毒藥，用于重金屬的拮抗劑，也 用于類風濕性關節(jié)炎及慢性活動性肝炎等免疫性疾?。涣硗?，2-(2，4_ 二酚羥基)-4，5_ 二 氫噻唑_4 (S)-羧酸、N-乙酰-D-半胱氨酸、FK-228, N-(S)-3-烷基庚?；?D-R-谷氨酰 基_甘氨酰基-D-丙氨酸和阿奇霉素等系列藥物均以D-半胱氨酸為原料藥物。除此之外， D-半胱氨酸鹽還是大腸桿菌的強抑制劑，也可作為急性酒精中毒的緩解劑，同時也是一些 蛋白酶的抑制劑，在炎癥以及HIV治療等方面也具有一定療效，因此用途十分廣泛。D-半胱氨酸鹽酸鹽的制備工藝比較復雜，通常采用不對稱合成方法制備，反應步 驟多，生產(chǎn)控制難度大，需要使用價值昂貴的手性試劑；而酶法拆分反應條件溫和，選擇性 強，副反應少，收率高，光學純度高，是D-半胱氨酸的生產(chǎn)的有效方法。L-色氨酸是人和動物體內(nèi)的重要必需氨基酸，在醫(yī)藥、食品和飼料等領域均具有 非常廣泛的用途。近年來，由于飼料工業(yè)發(fā)展迅速，以及L-色氨酸在醫(yī)藥行業(yè)的用途不斷 擴大，國內(nèi)外對于L-色氨酸的需求量日益增加。但由于長期以來L-色氨酸的生產(chǎn)難度高、 價格昂貴，除醫(yī)藥用途外，L-色氨酸在其它領域均未能大量推廣應用。L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要有蛋白水解提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶法 合成法四種。其中，酶法合成法利用化學合成的前體物為原料，既充分發(fā)揮了有機合成技 術(shù)的優(yōu)勢，又具有產(chǎn)物濃度高、收率高、純度高、副產(chǎn)物少和精制操作容易等優(yōu)點。酶法合 成L-色氨酸的途徑主要涉及色氨酸合成酶(EC 4. 2. 1. 20)和色氨酸酶(EC 4. 1. 99. 1)，二 者均可催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸。由于吲哚對色氨酸合成酶具有強烈的抑制作 用，而色氨酸酶對吲哚則具有良好的穩(wěn)定性，所以近年來人們更為關注色氨酸酶在L-色氨 酸生物合成中的應用。色氨酸酶正常情況下分解L-色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨，但在高濃度丙酮酸和氨的條件下也能有效的催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸。該酶還能催化L-絲氨酸或 L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸。色氨酸酶催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸的途徑 中，由于底物吲哚對色氨酸酶抑制作用較弱，且丙酮酸價格不高，因而具有一定的實用性， 但該途徑是色氨酸水解的逆反應，要求底物濃度較高，反應平衡不易把握。而以L-絲氨酸 和吲哚為原料合成L-色氨酸的途徑中，由于底物L-絲氨酸的價格幾乎與L-色氨酸相當， 因此實用性不強。因此利用色氨酸酶催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸的途徑中，由 于底物L-半胱氨酸的生產(chǎn)成本較為低廉，因此該途徑具有重要的工業(yè)化應用價值。目前DL-半胱氨酸拆分主要是采用化學方法，化學拆分法是使外消旋體與手性試 劑作用生成非對映體，利用非對映體物理、化學性質(zhì)的差異而將它們分開。以DL-半胱氨酸 為原料，分別采用路線如下⑴以L-酒石酸為拆分劑，經(jīng)由2，2- 二甲基四氫噻唑-4-羧 酸不對稱轉(zhuǎn)化，生成D-2，2- 二甲基四氫噻唑-4-羧酸-L-酒石酸鹽，使其在水溶液中水解， 得到D-半胱氨酸。(2)以DL-半胱氨酸為原料，先制備D-4-四氫噻唑-4-羧酸，然后再使 其和羥胺反應得到半胱氨酸，之后利用優(yōu)先結(jié)晶的方法得到旋光異構(gòu)體。(3)以L-噻唑啉 羧酸為拆分劑，生成DL-半胱氨酸-噻唑啉羧酸鹽，利用優(yōu)先結(jié)晶的方法得到D-、L-半胱氨 酸_噻唑啉羧酸鹽，之后采用三乙胺處理可得到光學純度的D-和L-半胱氨酸。而化學拆 分方法具有步驟長，收率低，不利于環(huán)保的特點。
酶是有旋光性物質(zhì)，而且由于它化學反應的專一性，所以可以選擇適當?shù)拿缸鳛?外消旋體的拆分試劑。但往往在酶的作用下，對映體之一被消耗掉，這是這種方法的缺點。 2009年，焦慶才等(200910032018.9)以DL-半胱氨酸作為原料，將具有高活力L-色氨酸 酶的基因工程大腸桿菌的菌體細胞與含有DL-半胱氨酸的混合氨基酸或DL-半胱氨酸鹽酸 鹽的轉(zhuǎn)化液混合，30 45°C下進行酶促反應，然后用等電點結(jié)晶法或等電點結(jié)晶與離了交 換樹脂相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度D-半胱氨酸和L-色氨酸。而本發(fā)明利用 高效表達色氨酸酶的重組枯草芽胞桿菌的發(fā)酵液為酶源，酶法拆分DL-半胱氨酸制備D-胱 氨酸的同時將L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化為L-色氨酸，克服了采用菌體細胞溫度耐受性低，催化效率 低，產(chǎn)物中混雜有菌體細胞，分離純化繁瑣等缺點。本發(fā)明方法不但可以實現(xiàn)DL-半胱氨酸 的拆分和L-色氨酸的制備，而且發(fā)酵成本低，轉(zhuǎn)化效率高，分離效果好，具有良好的產(chǎn)業(yè)化 價值。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有DL-半胱氨酸拆分技術(shù)中存在的問題，提供一種微生物 酶法拆分DL-半胱氨酸生產(chǎn)D-胱氨酸和L-色氨酸的綠色轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明涉及基因工程菌枯草芽胞桿菌WB600-pWB980-tnaA發(fā)酵液為酶源，以底物 DL-半胱氨酸和吲哚出發(fā)，經(jīng)基因工程分泌表達的色氨酸酶直接催化拆分獲得D-半胱氨酸 及副產(chǎn)物L-色氨酸，并經(jīng)氧化和分離純化最終獲得產(chǎn)物D-胱氨酸和L-色氨酸的工藝路 線。本發(fā)明自行構(gòu)建了高效分泌型表達色氨酸酶的枯草芽胞桿菌基因工程菌株 WB600-pffB980-tnaA,即以大腸桿菌JM109菌株基因組DNA為模板，PCR擴增獲得色氨酸酶 基因(Genebank No. X15974. 1)，在枯草芽胞桿菌WB600中進行重組表達，優(yōu)化后的發(fā)酵液 重組表達的色氨酸酶活力可達1000U/mL以上。其中枯草芽胞桿菌受體菌株WB600以及對應的表達載體PWB980均為文獻報道和商業(yè)化可利用的表達體系。以上述重組菌株的發(fā)酵液為酶源，本發(fā)明建立了以DL-半胱氨酸和吲哚為底物， 經(jīng)酶促反應生物拆分DL-半胱氨酸生產(chǎn)D-胱氨酸和L-色氨酸的方法。
本發(fā)明提供的微生物酶法拆分DL-半胱氨酸生產(chǎn)D-胱氨酸和L-色氨酸的方法， 具體包括以表達色氨酸酶的基因工程重組菌的發(fā)酵液為酶源，酶促反應過程中，向反應體 系中加入底物DL-半胱氨酸用量為5g/L至50g/L ；底物吲哚用量為3g/L至30g/L ；輔酶磷 酸吡哆醛的用量為0. 05g/L至0. 25g/L。在40至60°C下，pH值為7至9，經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化反應 2至6h，產(chǎn)生D-半胱氨酸和L-色氨酸，進一步通入空氣氧化后得到D-胱氨酸。本發(fā)明分離拆分氧化后獲得的D-胱氨酸的純化方法是將上述反應液調(diào)節(jié)pH至 5. 0，對D-胱氨酸進行等電點沉淀。本發(fā)明所產(chǎn)生的L-色氨酸的分離純化方法是，等電點 沉淀后的上清液，采用S-8型大孔樹脂去除其中殘留的吲哚，再用NKA-II型大孔樹脂吸附 L-色氨酸，經(jīng)50%乙醇洗脫，減壓濃縮干燥，獲得L-色氨酸。在本發(fā)明實施例中，采用柱前衍生化HPLC法來測定D/L-半胱氨酸的含量， 衍生化試劑為Marfey試劑，即1_氟-2,4- 二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(l-fluoro-2, 4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide, FDAA)。它含有一個手性碳原子，在與含手性碳原 子的氨基酸反應時，由于空間位阻的影響，可以有效地抑制氨基酸發(fā)生消旋化反應，因此可 以將兩種不同構(gòu)型的同一氨基酸衍生為非對映異構(gòu)體，從而達到分離鑒定的目的。柱前衍 生化方法如下以100 μ L 10mmol/L Na2CO3溶液(pH9)溶解半胱氨酸，使其終濃度為10 40mmol/L，隨后加入到的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育Ih后，加入2N HCl 20 μ L 終止反應，20 μ L進樣用于HPLC分析。色譜條件C18色譜柱(Phenomenex Luna 5 μ，100Α， 250X4. 6mm)，以A相水(含0. 1 % TFA)、B相乙腈(含0. 1 % TFA)為流動相，梯度洗脫 0. Omin, 55% Affi ； 11. Omin，47% A相；室溫，檢測波長340nm，流速為lmL/min。連續(xù)進樣5 次，計算峰面積并取平均值，以D/L半胱氨酸濃度(X，mmol/L)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐 標繪制標準曲線。酶促反應所產(chǎn)生的D-半胱氨酸經(jīng)稀釋10倍后取100 μ L，按上述方法進 行衍生后，以HPLC測定，依據(jù)標準曲線進行精確定量。在本發(fā)明實施例中，采用高效液相色譜法來測定L-色氨酸的含量，具體方法 如下分別取50 200mg/L濃度的L-色氨酸標準液20 μ L進樣，色譜條件C18色譜 柱(Phenomenex Luna 5 μ，100Α, 250 X 4. 6mm)，流動相甲醇lmmol/L 磷酸 二氫鉀 (30 70)，室溫，檢測波長225nm，流速為lmL/min。連續(xù)進樣5次，計算峰面積并取平均值， 以L-色氨酸濃度(X，mg/L)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。酶促反應所產(chǎn) 生的L-色氨酸和精制后的L-色氨酸，經(jīng)高效液相色譜檢測后與標準曲線相比較即可進行 精確定量。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以底物吲哚和DL-半胱氨酸出發(fā)，利用高效表達色氨 酸酶的枯草芽胞桿菌WB600-pWB980-tnaA的發(fā)酵液為酶源，酶法拆分DL-半胱氨酸生產(chǎn) D-胱氨酸和L-色氨酸。由于采用發(fā)酵液直接進行酶法拆分，溫度耐受性好，催化效率高，產(chǎn) 物中不含有菌體細胞，分離純化簡單，而且發(fā)酵成本低，因此本發(fā)明在D-胱氨酸和L-色氨 酸的工業(yè)化生產(chǎn)領域具有良好的產(chǎn)業(yè)化價值。
圖1 :D_半胱氨酸標準曲線A =FDAA衍生的D-半光氨酸標準品色譜圖；B =D-半胱氨酸定量分析標準曲線；1 衍生試劑FDAA ；2 =FDAA-D-半胱氨酸圖2 :L-色氨酸標準曲線A =L-色氨酸標準品色譜圖；B =L-色氨酸定量分析標準曲線圖3 色氨酸酶專一性分析A =DL-半胱氨酸標準準品衍生色譜圖；B =L-色氨酸衍生色譜圖；C 反應液衍生色 譜圖；1 衍生試劑FDAA ；2 =FDAA-D-半胱氨酸；3 =FDAA-L-半胱氨酸；4 =FDAA-L-色氨酸圖4 重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液為酶源的轉(zhuǎn)化條件分析A 反應時間與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；B pH 與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；C 反應溫度與與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；D 輔酶PLP與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；E 底 物吲哚與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；F 底物DL-半胱氨酸與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系圖5 =D-胱氨酸的純度分析1 衍生試劑 FDAA ；2 =FDAA-D-胱氨酸
圖6 :L_色氨酸純化及純度分析A 洗脫曲線；B 純度分析圖。
具體實施方式實施例1基因工程菌枯草芽胞桿菌的構(gòu)建及色氨酸酶的高效表達根據(jù)大腸桿菌K12菌株的色氨酸酶基因序列，設計色氨酸酶基因上游引物Pl 5，-CCG AAGCTT ATG GAA AAC TTT AAA CAT CTC C-3，和下游引物P2 5'-CCC GGA TCC TFA AAC TFCTTT CAG TTT TGC GG-3，，以大腸桿菌JM109菌株的基因組DNA為模板，PCR擴增獲 得色氨酸酶基因，并分別構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pWB980-tnaA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600，構(gòu)建得到色氨酸酶基因工程菌株。將陽性重組菌株接種于4mL含有卡那霉素20 μ g/mL的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，隨 后以2%轉(zhuǎn)接量接入50mL含有卡那霉素20 μ g/mL的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)24h， 離心去除菌體，取上清液，測定相應的色氨酸酶活力，每毫升發(fā)酵液的酶活力可達510U。實施例2柱前衍生HPLC法測定D/L-半胱氨酸的含量柱前衍生化方法如下以100 μ L 10mmol/L Na2CO3溶液(pH9)溶解半胱氨酸，使其 終濃度為10 40mmol/L，隨后加入到1 %的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育Ih后，加入 2NHC1 20 μ L終止反應，20 μ L進樣用于HPLC分析。色譜條件C18色譜柱(Phenomenex Luna 5 μ，100Α，250X4. 6mm)，以 A 相水(含 0. 1% TFA)、B 相乙腈(含 0. 1% TFA)為流動相，梯 度洗脫0. Omin, 55% Affi ； 11. Omin，47% A相；室溫，檢測波長340nm，流速為lmL/min。連 續(xù)進樣5次，計算峰面積并取平均值，以D-半胱氨酸濃度(X，mmol/L)為橫坐標，峰面積(Y) 為縱坐標繪制標準曲線。酶促反應所產(chǎn)生的D-半胱氨酸經(jīng)稀釋10倍后取100 μ L，按上述方法進行衍生后，以HPLC測定，依據(jù)標準曲線進行精確定量。如圖1。實施例3
HPLC法測定L-色氨酸的含量精確配置50 200mg/L濃度的L-色氨酸標準液，分別取20 μ L進樣，采用HPLC法 測定L-色氨酸的含量。色譜條件C18色譜柱(Phenomenex Luna 5 μ，100Α，250 X 4. 6mm)， 流動相甲醇O.OOlmol/L磷酸二氫鉀(30 70)，室溫，檢測波長225nm，流速為lmL/min。 連續(xù)進樣5次，計算峰面積并取平均值，以L-色氨酸濃度(X，mg/L)為橫坐標，峰面積(Y) 為縱坐標繪制標準曲線。酶促反應所產(chǎn)生的L-色氨酸和精制后的L-色氨酸，經(jīng)高效液相色譜檢測后與標 準曲線相比較即可進行精確定量。如圖2。實施例4色氨酸酶發(fā)酵將實施例1中的重組枯草芽孢桿菌接種于4mL含有卡那霉素20 μ g/mL的LB培養(yǎng) 基中過夜培養(yǎng)，隨后以2%轉(zhuǎn)接量接入120mL含有卡那霉素20 μ g/mL的新鮮LB培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)12h ；最后將該種子全部接種于6升發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵12h，發(fā)酵培養(yǎng)基配方 為0. 5%可溶性淀粉、酵母粉、0.4%玉米漿。收集發(fā)酵液過濾去除菌體，得重組枯草芽 孢桿菌發(fā)酵液。測定相應的色氨酸酶活力，每毫升發(fā)酵液的酶活力可達1020U。實施例5色氨酸酶專一性分析以上述實例4中重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液為酶源，在每升發(fā)酵液中加入底物 DL-半胱氨酸的加入量為IOg ；底物吲哚用量為5g ；輔酶磷酸吡哆醛的量為0. Ig ；轉(zhuǎn)化溫度 為45°C ；轉(zhuǎn)化pH值為8 ；轉(zhuǎn)化時間為3h。采用上述的HPLC方法檢測D-半胱氨酸和L-色 氨酸的含量，以確定色氨酸酶的底物專一性。結(jié)果如圖3所示，催化反應后的反應液中幾乎沒有L-半胱氨酸色譜峰，取而代之 的是相對應的L-色氨酸峰，同時D-半胱氨酸幾乎沒有損失，證明該色氨酸酶具有較好的專一性。實施例6以枯草芽孢桿菌發(fā)酵液為酶源，考察L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化率以上述實例4中重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液為酶源，分別在每升發(fā)酵液中加入底 物DL-半胱氨酸的加入量為5 50g ；底物吲哚用量為3 30g ；輔酶磷酸吡哆醛的量為 0. 05g 0. 25g ；轉(zhuǎn)化溫度為20 60°C ；轉(zhuǎn)化pH值為6 10 ；轉(zhuǎn)化時間為1 6h。(以上 各參數(shù)具體取值如圖4中各點所示，此處略)考察不同的轉(zhuǎn)化條件對L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的 影響，并采用實施例3中的方法檢測L-色氨酸的含量。圖4A 考察反應溫度與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；底物DL-半胱氨酸用量為25g ； 底物吲哚用量為IOg ；輔酶磷酸吡哆醛的量為0. Ig ；轉(zhuǎn)化PH值為7 ；轉(zhuǎn)化時間為2h。圖4B 考察pH與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；底物DL-半胱氨酸用量為25g ；底物 吲哚用量為IOg ；輔酶磷酸吡哆醛的量為0. Ig ；轉(zhuǎn)化溫度為50°C ；轉(zhuǎn)化時間為2h。圖4C 考察反應時間與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；底物DL-半胱氨酸用量為25g ； 底物吲哚用量為IOg ；輔酶磷酸吡哆醛的量為0. Ig ；轉(zhuǎn)化溫度為50°C ；轉(zhuǎn)化pH值為8。
圖4D 考察輔酶PLP與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；底物DL-半胱氨酸用量為25g ；底物吲哚用量為IOg ；轉(zhuǎn)化溫度為50°C ；轉(zhuǎn)化pH值為8 ；轉(zhuǎn)化時間為3h。圖4E 考察底物吲哚與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；底物DL-半胱氨酸用量為25g ；輔酶磷酸吡哆醛的量為0. 15g ；轉(zhuǎn)化溫度為50°C ；轉(zhuǎn)化pH值為8 ；轉(zhuǎn)化時間為3h。圖4F 考察底物DL-半胱氨酸與L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的關系；底物吲哚用量為15g ；輔酶磷酸吡哆醛的量為0. 15g ；轉(zhuǎn)化溫度為50°C ；轉(zhuǎn)化pH值為8 ；轉(zhuǎn)化時間為3h。實施例7以枯草芽孢桿菌發(fā)酵液為酶源，酶促反應生產(chǎn)D-半胱氨酸和L-色氨酸根據(jù)實施例6確定的拆分條件，以上述實例4中重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液為酶源， 在1升發(fā)酵液中加入磷酸吡哆醛0. 15g，吲哚15g，DL-半胱氨酸20g，反應溫度50°C，pH8， 轉(zhuǎn)化時間3h，進行DL-半胱氨酸的拆分。過濾后得酶促反應后的轉(zhuǎn)化液，其中D-半胱氨酸 含量為IOg ；產(chǎn)生的L-色氨酸產(chǎn)量為16. 4g，底物DL-半胱氨酸中的L-半胱氨酸的摩爾轉(zhuǎn) 化率為97. 3%，吲哚的摩爾轉(zhuǎn)化率為62. 7%。實施例8D-胱氨酸的氧化與分離將實施例7的轉(zhuǎn)化液中通入空氣，攪拌下氧化20h，調(diào)pH至D-胱氨酸的等電點 5. 0，在此條件下析出D-胱氨酸結(jié)晶，過濾收集沉淀，約獲得9. 27g D-胱氨酸晶體，采用與 實施例2相同的方法進行檢測，產(chǎn)物D-胱氨酸純度達到98. 6%。如圖5。實施例9L-色氨酸的分離純化收集實施例8中等電點沉淀后的轉(zhuǎn)化液，直接上樣于S-8型大孔樹脂柱 (40X2. 6cm)，流速1. 5mL/min,以吸附溶液中殘留的吲哚，流出液再上樣于NKA-II大孔樹 脂柱(40X2. 6cm)，流速1. OmL/min，用水充分洗滌后以50%乙醇洗脫，洗脫速度lmL/min。 收集洗脫液，并檢測洗脫液中L-色氨酸的含量，合并L-色氨酸洗脫峰，經(jīng)過減壓濃縮干燥 處理后獲得L-色氨酸白色粉末15. 24g，采用實施例3的高效液相色譜檢測，產(chǎn)物純度達到 98. 9%。如圖 6。
權(quán)利要求
一種微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制備D-胱氨酸和L-色氨酸的方法，其特征在于該方法包括以表達色氨酸酶的基因工程重組菌的發(fā)酵液為酶源，以DL-半胱氨酸和吲哚為底物，在40至60℃下，pH值為7至9，經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化反應2至6h，產(chǎn)生D-半胱氨酸和L-色氨酸，進一步氧化后得到D-胱氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述重組色氨酸酶基因工程菌的發(fā)酵液 的宿主菌為枯草芽胞桿菌WB600，表達載體為分泌型pWB980-tnaA重組表達載體，重組色氨 酸酶菌體細胞的發(fā)酵液中表達有高活性的色氨酸酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于以所述的重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液為酶 源，在每升發(fā)酵液中底物DL-半胱氨酸的加入量為5至50g ；底物吲哚用量為3至30g ；輔酶 磷酸吡哆醛的量為0. 05g至0. 25g。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于每升發(fā)酵液中，底物DL-半胱氨酸的用量 優(yōu)選為20g ；底物吲哚用量優(yōu)選為15g ；輔酶磷酸吡哆醛的優(yōu)選用量為0. 15g ；優(yōu)選轉(zhuǎn)化溫 度為50°C ；優(yōu)選轉(zhuǎn)化pH值為8 ；優(yōu)選轉(zhuǎn)化時間為3h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于D-胱氨酸的純化方法是酶促轉(zhuǎn)化液通 入空氣氧化5至24h，使產(chǎn)生的D-半胱氨酸氧化為D-胱氨酸，再調(diào)節(jié)pH為5使D-胱氨酸 等電點結(jié)晶析出，收集沉淀得D-胱氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于L-色氨酸的純化方法是，權(quán)利要求5等電 點結(jié)晶后的上清液，采用S-8型大孔樹脂去除其中殘留的吲哚，再采用NKA-II型大孔樹脂 吸附L-色氨酸，經(jīng)50%乙醇洗脫、減壓濃縮干燥，獲得L-色氨酸。
全文摘要
一種微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制備D-胱氨酸和L-色氨酸的方法。本發(fā)明利用高效表達色氨酸酶的重組枯草芽胞桿菌的發(fā)酵液為酶源，以DL-半胱氨酸和吲哚為底物，經(jīng)酶促反應拆分DL-半胱氨酸產(chǎn)生D-半胱氨酸和L-色氨酸。酶促反應液通過氧化使D-半胱氨酸氧化為D-胱氨酸，再調(diào)節(jié)pH為5等電點結(jié)晶析出D-胱氨酸，收集沉淀得D-胱氨酸。L-色氨酸純化方法是，采用S-8型大孔樹脂去除上述等電點結(jié)晶后的上清液中殘留的吲哚，再采用NKA-II型大孔樹脂吸附其中的L-色氨酸，經(jīng)50％乙醇洗脫、減壓濃縮干燥，獲得L-色氨酸；本發(fā)明提供了一種新的D-胱氨酸和L-色氨酸的綠色生產(chǎn)工藝路線。
文檔編號C12R1/125GK101812488SQ20101003135
公開日2010年8月25日 申請日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日 公開號201010031351.0
發(fā)明者侯潔, 張奇, 張璽, 段靜靜, 白芳, 高智慧, 黎霞 申請人:天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司