專利名稱：玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批 式補料發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
“玫瑰孢鏈霉菌”(拉丁名稱為“Str印tomyces roseosporus”)是一種鏈霉菌 屬的放線菌，其生長指數(shù)增長后期到穩(wěn)定期合成的達托霉素(英文名“daptomycin”)為 N-癸酰-L-色氨酰-L-天冬酰胺酰-L-天冬氨酰-L-蘇氨酰甘氨酰-L-鳥氨酰-L-D-天 冬氨酰-D-丙氨酰-L-天冬氨酰甘氨酰-D-絲氨酰-threo-3-甲基-L-谷氨酰-3-丙氨酸 ε 1-內(nèi)酯，是由一個十碳烷側(cè)鏈與一個環(huán)狀β氨基酸肽鏈N-末端的色氨酸連接而成，是一 種大環(huán)內(nèi)酯類新型抗生素。達托霉素是一種鈣離子依賴型的抗生素，在鈣離子存在的條件下，達托霉素將以 非共價鍵的形式結(jié)合到細胞膜蛋白上，細胞膜上的達托霉素結(jié)合蛋白(DBPs)為其作用靶 位，達托霉素可擾亂細胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運，從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的磷壁(酸)脂質(zhì) (LTA)的生物合成，改變細胞質(zhì)膜的性質(zhì)；另外，它還能通過破壞細菌的細胞膜，使其內(nèi)容 物外泄而達到殺滅細菌的目的。也有報道是其與細胞膜的結(jié)合，導致膜電位的降低，從而破 壞胞內(nèi)RNA和DNA的合成，最終抑制細菌生長。達托霉素由于獨特的結(jié)構(gòu)特征和作用機理， 對于耐藥菌，如耐萬古霉素的腸球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽類敏感的金 葡菌(GISA)，凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)的感染具顯著 的治療效果。是繼萬古霉素之后一種新型的抗生素，在治療皮膚感染和心膜炎方面有著顯 著的療效。2003年和2006年達托霉素(Daptomycin，LY146032)先后被美國FDA和了歐洲 藥品評價署(EMEA)的認證和批準上市。盡管國內(nèi)已經(jīng)有生產(chǎn)達托霉素的菌種，以初步實現(xiàn) 中試生產(chǎn)，但是沒有經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，達托霉素的產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本很高，因此優(yōu)化達托霉素 發(fā)酵工藝，進一步提高達托霉素的產(chǎn)量，具有重要意義。分批式補料發(fā)酵，可在發(fā)酵中后期為菌體生長提供碳源和代謝產(chǎn)物前提，解除菌 體生長中后期的碳源氮源耗盡而產(chǎn)生的菌體死亡和自溶，提高菌體活性，延長菌體的穩(wěn)定 生長期。在發(fā)酵中后期添加目的代謝物前提，解除前提供應瓶頸，有利于其高效合成。分段 控制發(fā)酵條件，嚴格控制菌體的生長期和次級代謝產(chǎn)物和合成，使發(fā)酵有利于次級代謝產(chǎn) 物合成而不是生長是發(fā)酵工藝優(yōu)化的主要方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵工藝依此法可以有效的提高達托霉素的產(chǎn)量。本發(fā)明的一種玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵工藝方法，包括 以下過程(1)在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Str印tomyces reseosporus斜面孢子用無菌水制成孢子懸液( ο8個孢子/ml)；然后取0. 5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的 250毫升的搖瓶中，28°C 32°C，180 220rpm搖床中培養(yǎng)48小時，作為發(fā)酵種子液；(2)然后以1 % 4%的接種量，接種到7. 5L裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中；從0到30h，控制pH6. 5，溶氧45%，有利于菌體的快速生長；從30h到144h，控制pH7. 0，溶氧30%使菌體生長快速進入穩(wěn)定期，有利于達托霉素的合成；在30h以0. 10mL/h的速度開始流加1 1的癸酸和油酸甲酯溶液，為達托霉素合 成提供癸酸前體，同時油酸甲酯起到消泡劑的作用；在96h開始補加甘油，流速為0. 25mL/L -h,以甘油作為菌體后期的主要碳源，使菌 體的穩(wěn)定期延長，從而延長達托霉素合成時間，提高達托霉素的合成效率。本發(fā)明的種子液體培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為糊精lg，葡萄糖0. 5g，蛋白胨0. 5g， 酵母浸粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05，CaCO3 0. 02g，溶解到 IL 蒸餾水中， 初始pH7.0。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為葡萄糖1. Og/L，糊精3g/L，干酪素1. Og/ L，花生餅粉 0. 6g/L，L-天冬素 0. 12g/L，K2SO4 0. 6g/L，初始 pH7. 0。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明的方法在成本不變的情況下，可使達托霉素的產(chǎn)量提 高4倍以上，且發(fā)酵過程易于控制，因此具有極好的產(chǎn)業(yè)應用推廣價值。


圖1 實施例1產(chǎn)量曲線圖；圖2 實施例2產(chǎn)量曲線圖；圖3 實施例3產(chǎn)量曲線圖；圖4:實施例4產(chǎn)量曲線圖.
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Str印tomyces reseosporus斜面孢子用無菌水制成孢 子懸液。然后取0. 5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中， 30°C，180 220rpm搖床中培養(yǎng)48小時。然后以的接種量，接種到7. 5L自動發(fā)酵罐中。 其中發(fā)酵培養(yǎng)基組分(葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生餅粉0.6g/L，L-天 冬素 0. 12g/L，K2SO4 0. 6g/L，初始 ρΗ7· 0。)然后，30°C，通氣量控制 0. 8v/v/m，發(fā)酵 144 小 時。通過HPLC監(jiān)測發(fā)酵液中的達托霉素濃度。達托霉素發(fā)酵單位為41 士0.6mg/L提高到 了 ；如圖1所示。實施例2在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Str印tomyces reseosporus斜面孢子用無菌水制成孢 子懸液。然后取0. 5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中， 300C，180 220rpm搖床中培養(yǎng)48小時。然后以4%的接種量，接種到7. 5L自動發(fā)酵罐中。 其中發(fā)酵培養(yǎng)基組分(葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生餅粉0. 6g/L，L-天冬素 0. 12g/L,K2SO4 0. 6g/L，初始 pH7. 0。)然后，32°C，在 0 30h，控制 pH6. 5，溶氧 45% ； 30h 144h，控制pH7. 0，通氣量控制0. 8v/v/m,發(fā)酵144小時。通過HPLC監(jiān)測發(fā)酵液中的 達托霉素濃度。達托霉素發(fā)酵單位為85士0.8mg/L比提高到了實施例1產(chǎn)量提高2倍.如 圖2所示。實施例3在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Str印tomyces reseosporus斜面孢子用無菌水制成孢子懸液。然后取0. 5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中， 30°C，180 220rpm搖床中培養(yǎng)48小時。然后以3%的接種量，接種到7. 5L自動發(fā)酵罐中。 其中發(fā)酵培養(yǎng)基組分(葡萄糖1. Og/L,糊精3g/L，干酪素1. Og/L,花生餅粉0. 6g/L，L-天冬 素 0. 12g/L，K2SO4 0. 6g/L，初始 pH7. 0。)然后，28°C，在 0 30h，控制 ρΗ6· 5，溶氧 45%，； 30h 144h，控制ρΗ7· 0，通氣量控制0. 8v/v/m, 30h時以0. 10mL/h的速度開始流加1 1 的癸酸和油酸甲酯溶液發(fā)酵144小時。通過HPLC監(jiān)測發(fā)酵液中的達托霉素濃度。達托霉 素發(fā)酵單位為110士0. 8mg/L比提高到了實施例1產(chǎn)量提高2. 68倍.如圖3所示。實施例4在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Str印tomyces reseosporus斜面孢子用無菌水制成孢 子懸液。然后取0. 5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中， 300C，180 220rpm搖床中培養(yǎng)48小時。然后以4%的接種量，接種到7. 5L自動發(fā)酵罐中。 其中發(fā)酵培養(yǎng)基組分(葡萄糖1. 0g/L,糊精3g/L，干酪素1. 0g/L,花生餅粉0. 6g/L，L-天冬 素 0. 12g/L，K2SO4 0. 6g/L，初始 pH7. 0。)然后，30°C，在 0 30h，控制 ρΗ6· 5，溶氧 45%，； 30h 144h，控制ρΗ7· 0，通氣量控制0. 8v/v/m, 30h時以0. 10mL/h的速度開始流加1 1 的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h開始補加甘油，流速為0. 25mL/L *h，發(fā)酵144小時。通過 HPLC監(jiān)測發(fā)酵液中的達托霉素濃度。達托霉素發(fā)酵單位為185士0.8mg/L比提高到了實施 例1產(chǎn)量提高4. 5倍.如圖4所示。本發(fā)明并不局限于實例中所描述的技術(shù)，它的描述是說明性的，并非限制性的，本 發(fā)明的權(quán)限由權(quán)利要求所限定，基于本技術(shù)領(lǐng)域人員依據(jù)本發(fā)明所能夠變化、重組等方法 得到的與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)，都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵工藝方法，其特征包括以下過程(1)在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用無菌水制成孢子懸液(108個孢子/ml)；然后取0.5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中，28℃～32℃，180～220rpm搖床中培養(yǎng)48小時，作為發(fā)酵種子液；(2)然后以1％～4％的接種量，接種到7.5L裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中；從0～30h，控制pH 6.5，溶氧45％，有利于菌體的快速生長；從30h～144h，控制pH 7.0，溶氧30％使菌體生長快速進入穩(wěn)定期，有利于達托霉素的合成。
2.如權(quán)利要求1所述的玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵工藝方法， 其特征是在30h以0. 10mL/h的速度開始流加1 1的癸酸和油酸甲酯溶液，為達托霉素合 成提供癸酸前體，同時油酸甲酯起到消泡劑的作用。
3.如權(quán)利要求1所述的玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵工藝方法， 其特征是在96h開始補加甘油，流速為0. 25mL/L -h,以甘油作為菌體后期的主要碳源，使菌 體的穩(wěn)定期延長，從而延長達托霉素合成時間，提高達托霉素的合成效率。
4.權(quán)利要求1所述的玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵工藝方法，其 特征是所述的種子液體培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為糊精lg，葡萄糖0. 5g，蛋白胨0. 5g，酵母 浸粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20 0. 05，CaCO3 0. 02g，溶解到 IL 蒸餾水中，初始 pH 7. 0。
5.如權(quán)利要求1所述的玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵工藝方法， 其特征發(fā)酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為葡萄糖1. Og/L,糊精3g/L，干酪素1. Og/L,花生餅粉 0. 6g/L，L-天冬素 0. 12g/L，K2SO4 0. 6g/L，初始 pH 7. 0o
全文摘要
本發(fā)明涉及玫瑰孢鏈霉菌高效生產(chǎn)達托霉素的分批式補料發(fā)酵方法。在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；然后用0.5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中，28℃～32℃，180～220rpm搖床中培養(yǎng)48小時；然后以1％的接種量，加到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的自動7.5LDE發(fā)酵罐中；添加0.5～30毫克每升的輔因子亞鐵血紅素或甲酰四氫葉酸或吡哆醛磷酸VB6的一種或其組合；在28℃～32℃，通氣量控制0.8～1.2v/v/m，pH6.5～7.5發(fā)酵90～144小時。利用本發(fā)明的方法來調(diào)節(jié)生物酶活，使通向達托霉素合成的胞內(nèi)代謝流增大，從而提高達托霉素產(chǎn)量，本法操作簡單，成本低廉，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)玫瑰孢鏈霉菌，達托霉素的發(fā)酵單位可比對照提高0.24～4.6倍。
文檔編號C12P21/02GK101824452SQ20101003135
公開日2010年9月8日 申請日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者宇光海, 賈曉強, 聞建平 申請人:天津大學