專利名稱：：一種培育轉(zhuǎn)基因動物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種轉(zhuǎn)基因動物的方法。
背景技術(shù)：
：植酸(phytate)，又名肌醇六磷酸，是一個含有六個磷酸基團的環(huán)狀化合物，一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。在ra較大的范圍內(nèi)帶負(fù)電荷，具有極強的螯合能力，可以與鈣、鎂、鉀、鈉、鋅、鐵、銅、錳等礦物質(zhì)形成不溶性的植酸鹽絡(luò)合物。在低ra值時還可以與蛋白質(zhì)分子的堿性基團結(jié)合，絡(luò)合蛋白質(zhì)，抑制消化酶如胃蛋白酶、淀粉酶、胰蛋白酶的活性。在自然界，禾谷類、蘭科類和油料作物中約有18%88%的磷以植酸的形式貯存。單胃動物和人缺少分解植酸的酶而不能利用該種形式的磷，為了滿足動物正常的生長、代謝需要，必須在動物的飼料中添加無機磷，這不僅造成了磷源的浪費，而且植酸磷隨動物的糞便排出體外造成環(huán)境的磷污染。目前實際應(yīng)用的植酸酶均來源于微生物。由于植酸酶在天然菌株中的產(chǎn)量很低以及酶本身一些性質(zhì)和酶制劑加工工藝的限制導(dǎo)致植酸酶在工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用中出現(xiàn)一系列問題。來源于埃氏大腸桿菌的植酸酶是目前發(fā)現(xiàn)的活性最高的植酸酶，比目前應(yīng)用的曲霉來源植酸酶高出30倍。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種培育轉(zhuǎn)基因胚胎的方法。本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將植酸酶基因?qū)肽康呐咛ブ?，得到轉(zhuǎn)基因胚胎。上述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。上述植酸酶基因是通過重組表達載體導(dǎo)入胚胎中的；所述重組表達載體是將核苷酸序列如序列表中序列l(wèi)所示的基因插入pcDNA3.1(+)的多克隆位點間得到的重組表達載體。上述胚胎為原核期胚胎。上述胚胎可為除人以外的任何一種動物的胚胎，具體可為豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠的胚胎。本發(fā)明的又一目的在于提供一種培育轉(zhuǎn)基因動物的方法。本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因動物的方法是將上述培育轉(zhuǎn)基因胚胎的方法獲得的轉(zhuǎn)基因胚胎移植到雌性的目的動物的體內(nèi)，得到磷利用率高于所述目的動物的轉(zhuǎn)基因動物。上述目的動物可為除人以外的任何一種動物，具體可為豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠。實驗證明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因胚胎能表達即pA基因，本發(fā)明培育的轉(zhuǎn)基因動物能檢測到植酸酶的活性，具有可以水解植酸及其鹽，釋放出動物可利用的磷，使提高磷的利用率，降低糞磷含量。本發(fā)明將植酸酶基因構(gòu)建到真核表達載體中，制備出能表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因動物，能大大提高動物體內(nèi)的磷利用效率，可以水解植酸及其鹽，釋放出動物可利用的磷，使3提高磷的利用率，降低糞磷含量；同時提高鈣、鋅、鐵、錳、鎂、銅等無機營養(yǎng)離子以及能量、蛋白質(zhì)和氨基酸的可利用性，消除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，減少磷在環(huán)境中的排泄由此降低了農(nóng)業(yè)負(fù)擔(dān)并減緩水生環(huán)境的富營養(yǎng)化同時降低日糧中無機磷添加量(磷作為一種不可再生資源)緩解我國磷資源缺乏。圖1為PCR擴增appA產(chǎn)物電泳圖，其中左邊是擴增的appA產(chǎn)物，右邊是marker。圖2為pcDNA-即pA質(zhì)粒圖譜。圖3為細(xì)胞中appA表達水平。圖4為細(xì)胞中植酸酶活性。圖5為胚胎內(nèi)植酸酶基因表達檢測，其中M為marker,1_24為不同的轉(zhuǎn)基因胚胎的植酸酶基因表達檢測。圖6為即pA轉(zhuǎn)基因鼠PCR檢測外源基因。圖7為即pA轉(zhuǎn)基因鼠SOUTHERNBLOT檢測外源基因。圖8為半定量檢測appA表達電泳圖。圖9為糞便中總磷含量比較。圖10為糞便中無機磷含量比較。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、轉(zhuǎn)基因胚胎的制備—、目的基因(植酸酶基因(即pA)片段)的克隆以大腸桿菌DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)的基因組DNA為模板，以表1所示的a卯A-Ll(上游引物)和卿A-R1(下游引物)為引物的引導(dǎo)下，進行PCR擴增。反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為50ii1，5iiL10XBuffer、8iiL2.5mMdNTP、liiL20iiM引物即pA-Ll、liiL20iiM引物即pA-Rl(引物序列見表1)、0.5iiL5U/yL高保真Tag聚合酶，2iil大腸桿菌DH5a的基因組DNA做模板，加超純水至50yL(高保真Tag酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴增程序:98。C10s，68。C2min，循環(huán)30次。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖1所示，擴增得到1299bp的片段，經(jīng)測序表明該片段具有序列表中序列1所示的核苷酸。表1、本發(fā)明中使用的引物4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>二、轉(zhuǎn)基因胚胎的獲得1、重組表達載體的獲得將上述步驟一中得到的PCR產(chǎn)物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用HindIII、EcoRI雙酶切純化產(chǎn)物；同時用HindIII、EcoRI雙酶切pcDNA3.1(+)載體(后簡稱pcDNA載體)(購自invitrogen公司)；然后將酶切純化后PCR擴增產(chǎn)物和酶切后的載體用連接酶(連接酶購自promega公司，貨號M1804)連接；按公司要求操作步驟轉(zhuǎn)化DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)感受態(tài)大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；挑單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，部分菌液送公司測序(invitrogen北京公司)；選取測序結(jié)果表明含有即pA(核苷酸序列如序列表中序列1所示)的載體，命名為pcDNA-即pA(質(zhì)粒圖譜如圖2所示)。2、獲得轉(zhuǎn)基因胚胎將上述步驟二中步驟1得到的pcDNA-即pA質(zhì)粒用Seal酶切使之線性化，再將線性的pcDNA-即pA基因片段利用傳統(tǒng)原核期胚胎顯微注射法注射入原核期的小鼠胚胎，得到轉(zhuǎn)基因胚胎。然后在M16培養(yǎng)基中(購自sigma公司，貨號M7292)，培養(yǎng)至桑葚胚。取桑葚胚的胚胎直接做模板，按照ProtoScriptM-MuLVTaqRT-PCR試劑盒(購自NEB公司，貨號E6400S)的操作說明，直接檢測胚胎中即pA的表達(檢測即pA引物為表l所示的即pA-RTLl和即pA-RTRl)。檢測結(jié)果如圖5所示，表明所檢測的24個胚胎中，第6、10、16號胚胎能表達appA基因。實施例2、轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及檢測分析—、轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得1、制備轉(zhuǎn)基因小鼠重復(fù)實施例1中得到的轉(zhuǎn)基因胚胎的步驟，在線性的pcDNA-即pA基因片段注射入原核期的小鼠胚胎后，在M16培養(yǎng)基中(購自sigma公司，貨號M7292)，培養(yǎng)至2細(xì)胞期，用檢卵針將胚胎進行輸卵管切口移植，將發(fā)情同步的假孕雌鼠用846合劑(購自長春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)O.125ml腹腔注射將其麻醉。剪背部毛酒精消毒后，在最后肋骨下方lcm、脊柱左側(cè)0.5cm處剪開皮膚，引出卵巢、輸卵管、子宮，找到輸卵管膨大部并觀察其走向，先用沖胚針頭在囊膜無或少血管分布處穿一小洞，再將吸卵管通過囊膜上的小洞輕輕送進輸卵管口在膨大部上端2030枚2細(xì)胞胚胎吹入適齡代母輸卵管中。移植完畢后，將卵巢、輸卵管、子宮復(fù)位，最后縫合創(chuàng)口。產(chǎn)下56只小鼠。2、陽性轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測鑒定l)PCR檢測將上述步驟1中產(chǎn)下的56只小鼠分別提取基因組DNA，然后以該基因組DNA為模板進行PCR檢領(lǐng)"以分析轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA中相應(yīng)基因的整合情況。PCR反應(yīng)體系為50ii1，5iiL10XBuffer、8iiL2.5mMdNTP、liiL20iiMappA-RTLl、liiL20yM即pA-RTL1、0.5yL5U/yL高保真Tag聚合酶，100ng的模板，加超純水至50iiL。PCR擴增程序95。C5min;94。C20s，退火溫度56°C，72°Clmin，循環(huán)30次，最后72t:延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖6所示，(圖6中，M為marker,+:陽性對照，pcDNA-即pA質(zhì)粒DNA為模板；-:陰性對照，正常鼠DNA為模板；K為空白未加模板)；1-16:為轉(zhuǎn)基因后代鼠擴增條帶)，由圖6可知l-16號泳道鼠基因組中能擴增出393bp左右的條帶(1-16號泳道依次代表的鼠號是2，4，5，13，17，19，20，22，23，32，35，42，43，47，52，55)，和預(yù)期擴增的即pA條帶一致；擴增產(chǎn)物送公司測序和序列表中序列1所示的appA序列一致。2)southern雜交檢領(lǐng)lj以表1中a卯A定量檢測引物即pA-RTLl和即pA-RTRl為引物，以pcDNA-即pA為模板，按照試劑盒(探針標(biāo)記試劑盒購自i皿ogen-cn公司，貨號DDLK-010)操作說明書體系加樣；PCR運行程序如下95。C5min，94°C45S，56。Clmin，72。Clmin，30個循環(huán)后72。C延伸10min。得到的PCR產(chǎn)物作為探針進行southen雜交檢測。雜交前在95t:變性5分鐘后立即冰水中放置10分鐘備用；大量抽提上述步驟1)驗證過的PCR篩出的陽性鼠(鼠號分別是2，4，5，13，17，19，20，22，23，32，35，42，43，47，52,55)小鼠尾組織DNA，用HindIII及NotI雙酶切基因組，濃縮基因組酶切產(chǎn)物為300ng/P1;于1%瓊脂糖凝膠電泳分離各酶切片段，每孔上樣50微升；然后使DNA原位變性后轉(zhuǎn)移到帶正電荷尼龍膜上。按照試劑盒操作說明進行預(yù)雜交、雜交及x-光片曝光檢測雜交信號(購自innogen-cn公司，貨號DIGD-210)。檢測結(jié)果如圖7(K為空白未加模板;+:陽性對照，pcDNA-即pA質(zhì)粒DNA為模板；-:陰性對照，正常鼠DNA為模板)所示，結(jié)果表明，PCR檢測陽性鼠樣，southern雜交檢測相應(yīng)鼠樣能檢測出相應(yīng)條帶，說明1_16號樣品所代表的轉(zhuǎn)基因鼠(H6號泳道依次代表的鼠號是2，4，5，13，17，19，20，22，23，32，35，42，43，47，52，55))均為appA基因整合鼠。3)RT-PCR檢測a、cDNA的制備從上述步驟2)鑒定篩出的1-16號陽性轉(zhuǎn)基因小鼠尾部，分別采集100微升血液，按照天根血液總RNA提取試劑盒的(貨號DP433)操作說明，提取各組細(xì)胞的總RNA;按照T0Y0B0反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號FSK-IOO)，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。b、PCR檢測以上述步驟a中制備的cDNA為模板，以即pA-RTLl和a卯A-RTRl為引物擴增，同時以小鼠beta-actin基因為內(nèi)參(表1中引物actin-RTLl和actin-RTRl)，進行半定量PCR測定，PCR反應(yīng)體系為50iil，5iiL10XBuffer、8iiL2.5mMdNTP、liiL20iiM上游引物、liiL20iiM下游引物、0.5iiL5U/yL高保真Tag聚合酶，lOOng模板，加超純水至50pL。PCR擴增程序95。C5min;94。C20s，退火溫度56°C，72°Clm，最后72。C延伸5min，內(nèi)參beta-actin擴增時23個循環(huán)，其他模板擴增32個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物用1.2X瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖8(k為不含模板的加樣體系、M為marker、1-16號泳道依次代表的鼠號是2，4，5，13，17，19，20，22，23，32，35，42，43，47，52，55的不同轉(zhuǎn)基因小鼠)所示，半定量PCR檢測結(jié)果表明，2，5，7，10，15號泳道樣品(依次代表的鼠號為4，17，20，32，52號轉(zhuǎn)基因鼠)能擴增出陽性條帶，說明對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠能表達appA基因。二、轉(zhuǎn)基因小鼠的磷利用率檢測將上述步驟一中步驟2的3)檢測的能表達即pA基因的5只轉(zhuǎn)基因鼠分為轉(zhuǎn)基因鼠組，另外取5只正常飼養(yǎng)的非轉(zhuǎn)基因鼠為正常鼠組，分別收集兩組鼠的糞便，測定糞便中有機磷及總磷含量(方法同，賀淹才，彭益強；《畜禽飼料和糞便的含磷量檢測》[D];廣東飼料；2001年第8巻第4期)，每組實驗重復(fù)3次。測定結(jié)果表明正常鼠組和轉(zhuǎn)基因鼠組糞便中有機磷占總糞便分別為0.323%，0.242%，兩組差異顯著(P〈0.05)(如圖9所示)；正常鼠組和轉(zhuǎn)基因鼠組糞便中總磷含量分別為1.754%，1.569%，兩組差異顯著(P<0.05)(如圖10所示)。實施例3、即pA在動物細(xì)胞中表達的機理研究—、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立1、豬PK15細(xì)胞系細(xì)胞的獲得從液氮中取出裝有豬PK15細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)的凍存小管，立即投入37-4(TC的溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解；在l-2min內(nèi)完成復(fù)溫；將細(xì)胞懸液移入無菌的離心管，加入5mL培養(yǎng)液，輕輕吹勻；將細(xì)胞懸液800-1000r/min離心5min，棄上清；向含有細(xì)胞沉淀的離心管加入lmL完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入適量的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后分成兩組(轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染pcDNA-即pA組)，每組3個重復(fù)。2、獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系將實施例1得到的pcDNA-即pA質(zhì)粒用Seal大量酶切線性化后，QIAGEN純化試劑盒膠回收線性化片段，產(chǎn)物終濃度為500ng/ul用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的具體步驟為轉(zhuǎn)染前1天，向每孔含10%胎牛血清(購自GIBCO公司，貨號21640-079)的500iiLDMEM高糖培養(yǎng)基(購自GIBCO公司，貨號12100_046)的24孔板中分別接種0.5-2X105個豬PK15細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前達到90-95%的匯合；用50yL的無血清、無抗生素的培養(yǎng)基分別稀釋0.8g待轉(zhuǎn)染DNA(其中，轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒組使用Seal線性化的pcDNA，轉(zhuǎn)染pcDNA-即pA組使用Seal線性化的pcDNA-即pA質(zhì)粒)，并溫和地混勻；使用前將脂質(zhì)體溫和搖勻，將2iiLlipefectaminTM-2000加入50iiL的無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基(購自GIBCO公司，貨號12100-046)并輕輕混勻，于室溫孵育5min;5min后，分別將50L的各組DNA稀釋液加入50yL的脂質(zhì)體稀釋液，輕輕混勻并于室溫放置20min;將100yL的DNA脂質(zhì)體混合物加入到準(zhǔn)備好的孔內(nèi)，輕輕來回晃動培養(yǎng)板，將其置于37°C、飽和濕度、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于4-6h后用完全培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，在后代培養(yǎng)中，于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入G418(購自Gibco，貨號11811-023)，篩選兩周。分別得到轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染pcDNA-即pA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。二、檢測分析1、即pA表達水平檢測l)cDNA的制備按照試劑盒(購自北京天跟公司，貨號DP430)操作說明，提取上述轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染pcDNA-即pA組細(xì)胞的總RNA;按照T0Y0B0反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自T0Y0B0公司，貨號FSK-IOO)，將提取的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA。2)熒光定量PCR檢測以上述步驟l)中制備的cDNA為模板，以豬GAPDH基因為內(nèi)參(如表l所示，引物為mGAPDH-Ll和mGAPDH-Rl)，進行熒光定量PCR測定appA(a卯A引物為表1所示的即pA-RTLl和即pA-RTRl)表達量，上樣體系按照ABI定量試劑說明書上樣，反應(yīng)體系為20ii1，10iiL2XMixturer(TAKARA，貨號DRR041A)、1iiL20iiM上游引物、1PL20iiM下游引物、l微升cDNA，加超純水至20iiL。PCR擴增程序95。C5min;94。C20s，退火溫度56°C，72°Clm，循環(huán)40次，最后72。C延伸5min。熒光定量檢測結(jié)果如圖3所示，進行即pA表達水平檢測時，以轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒對照組為基準(zhǔn)，轉(zhuǎn)pcDNA-即pA組合的表達水平分別是對照組的32.27倍。(圖3中縱坐標(biāo)是定量PCR儀顯示的格式，以logl。值為單位，各組的值為每組目的基因的表達水平和內(nèi)參的表達水平的比值。以對照組細(xì)胞相應(yīng)基因表達為參照基數(shù)o，其余各組表達水平值為對照組相應(yīng)基因表達的倍數(shù))。2、植酸酶活性的測定收集上述步驟一中步驟2得到的轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pcDNA-即pA質(zhì)粒組細(xì)胞，利用反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞，離心、收集細(xì)胞上清即為酶粗提液，粗酶液經(jīng)5倍稀釋后，測定稀釋液中的細(xì)胞植酸酶活性。植酸酶活性的測定采用鉬酸銨顯色法，參照程海娜等(程海娜；《黑曲霉植酸酶菌株選育及其酶的分離純化和性質(zhì)研究》[D];湖南師范大學(xué)；2003年)方法進行。實驗3次重復(fù)，對照組(即轉(zhuǎn)染空pcDNA質(zhì)粒組)的lml稀釋液中細(xì)胞植酸酶活力分別為0.082單位、0.075單位及0.088單位，轉(zhuǎn)染pcDNA-即pA質(zhì)粒組的lml稀釋液中細(xì)胞植酸酶活力分別為0.239單位、0.221單位及0.244單位。如圖4所示，實驗組植酸酶活性是對照組平均2.88倍。1個單位的植酸酶活指lmin內(nèi)從植酸鈉中分解出其lpmol的無機磷。序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所8〈120〉一種培育轉(zhuǎn)基因動物的方法〈160>1〈210>1〈211>1299〈212>DNA〈213>±矣氏大腸桿菌(Escherichiacoli)〈400〉1tctteatcccatttttetctcttctgattccgtteaccccgcaatctgca60ttcgctcagagtgagccggagctg皿gctgg腿gtgtggtgattgtcagtcgtcatggt120gtgcgtgctcc皿cc皿ggccacgcaactgtcaccccagacgcatggcca180acctggccggtea皿ctgggttggctgacaccgcgcggtggtgagcteatcgcctetctc240ggacattecc皿cgccagcgtctggtegccg3Cgg3ttgCgggctgcccg300cagtctggtc郷tcgcgattettgctgatgtcgacgagcgtecccgtea皿C3ggCg皿360gccttcgccgccgggctggcacctgactgtgc皿teaccgtecatecccaggcagatecg420tccagtcccgatccgttettteatcctcte皿皿ctggcgtttgccaactggateacgcg■皿cgtgactgacgcgatcctC3gC3gggC3gg郷gt咖ttgctgacttteccgggcat540CggC皿3Cggcgtttcgcgaactgg皿cgggtgctteattttccgcaatcaaacttgtgc600ctteaacgtgcga皿gctgttcatteacgcaggcatteccatcggaactc660皿ggtgagcgccgacaatgtctcatteaccggtgcggt皿gcctcgcatc皿tgctgacg720aagatetttctcctgcaaca3gC3C3ggg3atgccggagccggggtgggg皿gg3tC3CC780gattcacacc3gtgg皿C3Ccttgcteagtttgcateacgcgcaattttetttgttecaa840cgcacgccagaggttgcccgcagccgcgccaccccgttettegatttgatC皿g3C3gCg■ttgacgccccatccaccgca皿皿C3ggCgtetggtgtgacattecccacttcagtgctg960tttetcgccgg3cacgatectaatctggca皿tctcggcggcgractggagctc皿ctgg1020acgcttcccggtcagccgg3taacacgccgcc郷tggtg雄tggtgtttg雄gctgg1080cgtcggcteaccagtggattcaggtttcgctggtcttccagactttecag1140c卿tgcgtgate皿3cgccgctgtcatteaatecgccgcccgg卿ggtg皿actgacc1200ctggc郷atgtga卿gcg朋3tgCgC3gggcatgtgttcgttggcaggttttecgc朋1260atcgtg朋tgaccggcgtgcagtttgtea1299權(quán)利要求一種培育轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將植酸酶基因?qū)肽康呐咛ブ校玫睫D(zhuǎn)基因胚胎。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述植酸酶基因是通過重組表達載體導(dǎo)入胚胎中的；所述重組表達載體是將核苷酸序列如序列表中序列1所示的基因插入pcDNA3.1(+)的多克隆位點間得到的重組表達載體。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎為原核期胚胎。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎為豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠的胚胎。6.—種培育轉(zhuǎn)基因動物的方法，是將權(quán)利要求1-5中任一所述的方法制備的轉(zhuǎn)基因胚胎移植到雌性的目的動物的體內(nèi)，得到磷利用率高于所述目的動物的轉(zhuǎn)基因動物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述目的動物為豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種培育轉(zhuǎn)基因動物的方法。本發(fā)明還提供一種培育轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，該培育轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將植酸酶基因?qū)肽康呐咛ブ?，得到轉(zhuǎn)基因胚胎。將上述的轉(zhuǎn)基因胚胎移植到假孕雌性動物的體內(nèi)，得到轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因胚胎能表達appA基因，本發(fā)明培育的轉(zhuǎn)基因動物能表達植酸酶的活性，具有可以水解植酸及其鹽，釋放出動物可利用的磷，使提高磷的利用率，降低糞磷含量。文檔編號C12N5/10GK101775370SQ20101003420公開日2010年7月14日申請日期2010年1月13日優(yōu)先權(quán)日2010年1月13日發(fā)明者唐中林,崔文濤,李奎,楊述林,牟玉蓮,白立景,鞠輝明申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所