專利名稱：一種酯酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酯酶及其編碼基因。
背景技術(shù)：
酯酶^steraseE. C. 3. 1. 1. 1)是自然界中常見的酯水解酶類，普遍存在于動物、 植物和微生物，其中微生物來源的酯酶種類最為豐富。不同來源的酯酶基因差別大，同源性 不高但在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上具有極高的相似性既α/β折疊酶結(jié)構(gòu)，催化反應(yīng)機(jī)理都遵循 絲氨酸水解酶的反應(yīng)機(jī)制，既催化結(jié)構(gòu)域包含絲氨酸-組氨酸-谷氨酸(或天冬氨酸)三聯(lián) 體活性中心結(jié)構(gòu)并在絲氨酸活性位點(diǎn)附近存在絲氨酸水解酶的特征保守序列G-X-S-X-G。 酯酶和脂肪酶在結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理上具有極高的相似性，其主要區(qū)別酯酶主要是水解短鏈 水溶性酯底物，催化過程中遵循典型米氏酶動力學(xué)方式；而脂肪酶能夠催化水解疏水性長 鏈脂肪酸脂底物，并且在催化過程中表現(xiàn)界面活性；在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上脂肪酶往往具有一個(gè) 用移動的蓋子結(jié)構(gòu)(lid)。微生物來源的酯酶種類最為繁多，根據(jù)的它們的氨基酸序列相似性和基本生物學(xué) 特性，Arpigny于1999年將其系統(tǒng)劃分為8個(gè)大的家族；其中家族一為脂肪酶，家族二到八 為酯酶。幾年來隨著大量新的酯酶基因的發(fā)現(xiàn)，又增添了以Wia27為代表的第九家族和以 EstD為代表的第十酯酶家族。酯酶/脂肪酶由于其蛋白分子穩(wěn)定、催化反應(yīng)簡單、不依賴輔助因子、底物范圍廣 等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于食品加工、洗滌劑，醫(yī)藥化妝品、化合物制備等行業(yè)。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)全 球工業(yè)酶產(chǎn)值在2004達(dá)到了 20億，并以每年4% -5%的數(shù)率在增長，其中脂肪酶類的使用 占總用酶頻率的10%。近年來隨著手性化合物在制藥、農(nóng)藥、香料、液晶、功能性高分子等工 業(yè)中廣泛的應(yīng)用，酯酶對手性化合物拆分的特性更加凸現(xiàn)出來。相比于脂肪酶，酯酶在手性 拆分上表現(xiàn)著更顯著的效果，例如利用酯酶NP對手性萘普生進(jìn)行拆分可以得到99%光學(xué) 純的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%的對應(yīng)體產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酯酶及其編碼基因。本發(fā)明提供的酯酶(EstOF4，又名0F4511)，來自Alkaliphilic Bacilluspseudofirmus 0F4，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有酯酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列1所示的蛋白由246個(gè)氨基酸殘基組成。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且具有酯酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有酯酶活性的蛋白的 DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所 述基因插入pET28a質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權(quán)利要求5所述重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到的。
7.一種制備酯酶的方法，是培養(yǎng)權(quán)利要求4或6所述的重組菌，得到酯酶。
8.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對。
9.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4、5或6所述重組表達(dá)載 體、所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌中的任意一種在降解硝基苯酚酯中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用權(quán)利要求1所述蛋白降解所述硝基苯 酚酯時(shí)，溫度為30-60°C，pH為7. 0-10. 5 ；所述硝基苯酚酯為如下任意一種對硝基苯酚乙 酸酯、對硝基苯酚丙酸酯、對硝基苯酚丁酸酯、對硝基苯酚己酸酯、對硝基苯酚辛酸酯、對硝 基苯酚癸酸酯和對硝基苯酚月桂酸酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酯酶及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。所述蛋白的編碼基因、以及含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白、所述基因、所述重組表達(dá)載體、所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均可應(yīng)用于降解硝基苯酚酯。本發(fā)明的蛋白可應(yīng)用于食品加工、洗滌劑，醫(yī)藥化妝品、化合物制備等行業(yè)。
文檔編號C12N1/00GK102127526SQ20101003421
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者薛燕芬, 饒朗, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所