專利名稱：一種制備同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種制備同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的 方法。
背景技術(shù)：
在傳統(tǒng)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中，往往借助真核表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)，通過分子生物 學(xué)手段將目的基因片段連接到真核啟動(dòng)子下游，整合到細(xì)胞基因組中后能指導(dǎo)外源基因表 達(dá)，該方法在基因表達(dá)及功能的研究中有著極其廣泛的應(yīng)用，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法每次轉(zhuǎn)基因 只整合一個(gè)目的基因，進(jìn)而制備表達(dá)一個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如果涉及制備多基因轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物，則需單獨(dú)制備相應(yīng)的單基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，然后通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物間的交配等方法制備 轉(zhuǎn)多基因動(dòng)物的后代，這種制備多基因動(dòng)物的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且耗費(fèi)高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備轉(zhuǎn)基因胚胎的方法。本發(fā)明提供的制備轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A均 導(dǎo)入目的胚胎中，得到轉(zhuǎn)基因胚胎。上述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第1360-2658位；上述 人粘病毒抗性基因A的核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第3803-5791位。上述植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A具體可以是通過核苷酸序列如序列表中 序列1所示的DNA片段導(dǎo)入胚胎中。上述胚胎為原核期胚胎。上述胚胎為除人以外的任何一種動(dòng)物的胚胎，具體可以是豬、牛、羊、貓、狗、兔或 鼠的胚胎。本發(fā)明的又一目的在于提供一種培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法是將上述的制備轉(zhuǎn)基因胚胎的方法所制備 的轉(zhuǎn)基因胚胎移植到雌性的目的動(dòng)物的體內(nèi)，得到能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。上述目的動(dòng)物可為除人以外的任何一種動(dòng)物，具體可以是豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠。本發(fā)明利用構(gòu)建的同時(shí)表達(dá)植酸酶和人粘病毒抗性基因的真核表達(dá)載體 pcDNA-appA-MxA，利用顯微注射法制備了含雙基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基 因A(MxA))的轉(zhuǎn)基因豬。能同時(shí)檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因豬種同時(shí)整合雙基因本發(fā)明的載體顯著優(yōu) 勢(shì)表現(xiàn)在一次轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)多基因的同時(shí)表達(dá)，為制備轉(zhuǎn)聯(lián)合基因動(dòng)物等提供一種便捷的手 段。


圖1 擴(kuò)增appA凝膠電泳圖。
圖 2 :pcDNA-appA 質(zhì)粒圖譜。圖3 擴(kuò)增MxA凝膠電泳圖。圖 4 :pcDNA-MxA 質(zhì)粒圖譜。圖 5 :pcDNA-appA-MxA 質(zhì)粒圖譜。圖6 顯微注射AMP基因后胚胎定量檢測(cè)appA及MxA的表達(dá)。圖7 :AMP轉(zhuǎn)基因豬PCR檢測(cè)外源基因。圖8 :AMP轉(zhuǎn)基因豬SOUTHERN BLOT檢測(cè)外源基因。
圖9 定量檢測(cè)appA及MxA的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)基因胚胎的制備一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建實(shí)施例1、表達(dá)雙基因的載體的構(gòu)建1、單基因表達(dá)載體基本構(gòu)件的獲得(1)真核表達(dá)載體pcDNA-appA的制備以大腸桿菌DH5 a (購(gòu)自北京全式金公司， 貨號(hào)CD201)為模板，以表1中列舉的擴(kuò)增appA的引物擴(kuò)增植酸酶基因(appA)片段。反應(yīng) 體系為反應(yīng)體系為 50ii l，5ii L 10XBuffer,8 u L 2. 5mM dNTPU U L 20 ii M 引物 appA-Ll、 luL 20 ii M弓丨物appA-Rl (弓丨物序列見表1)、0. 5 y L5U/ u L高保真Tag聚合酶，2 yl大腸 桿菌DH5a做模板，加超純水至50iiL(高保真酶購(gòu)自大連寶生物，貨號(hào)DR010A)。PCR擴(kuò) 增程序98°C 10s,68°C 2min，循環(huán)30次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(如圖 1所示)。PCR產(chǎn)物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用 Hindlll、EcoR I雙酶切純化產(chǎn)物；同時(shí)用Hindlll、EcoR I雙酶切pcDNA3. 1 (+)載體(購(gòu) 自invitrogen公司)；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的載體連接(連接酶購(gòu)自promega公司， 貨號(hào)M1804)；按公司要求操作步驟轉(zhuǎn)化DH5 a (購(gòu)自北京全式金公司，貨號(hào)CD201)感受態(tài) 大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；挑單菌落接種于液體LB培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，部分菌液送公司測(cè)序(invitrogen北京公司)；選取測(cè)序結(jié)果表明含有appA (核 苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第1360-2658位所示)的載體，提取質(zhì)粒備用，將該 測(cè)序表明正確的質(zhì)粒命名為pcDNA-appA(質(zhì)粒圖譜如圖2所示)。 (2)真核表達(dá)載體pcDNA-MxA的制備 以人cDNA (提取人的離體血液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄而來)為模板，以表1中列舉的 擴(kuò)增MxA的引物擴(kuò)增人粘病毒抗性基因A (MxA)片段。反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為50ia，5i!L 10 XBuffer,8 u L 2. 5mM dNTPU U L 20 ii M 引物 Mx_Ll、1 ii L 20 ii M 引物 Mx_Rl (序列見表 1)、0. 5 u L5U/ u L高保真Tag聚合酶，lOOng人cDNA為模板，加超純水至50 y L(高保真酶 購(gòu)自大連寶生物，貨號(hào)DR010A)。PCR擴(kuò)增程序98°C 10s，68°C 2min，，循環(huán)30次。PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖3)。
PCR產(chǎn)物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用 Hindlll、EcoR I雙酶切純化產(chǎn)物；同時(shí)用Hindlll、EcoR I雙酶切pcDNA3. 1 (+)載體(購(gòu) 自invitrogen公司)；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的載體連接(連接酶購(gòu)自promega公司， 貨號(hào)M1804)；按公司要求操作步驟轉(zhuǎn)化DH5 a (購(gòu)自北京全式金公司，貨號(hào)CD201)感受態(tài) 大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠板，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；挑單菌落接種于液體LB培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，部分菌液送公司測(cè)序(invitrogen北京公司)；選取測(cè)序結(jié)果表明含有MxA片段 (核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第3803-5791位所示)的載體，提取質(zhì)粒備用，將 該測(cè)序表明正確的質(zhì)粒命名為pcDNA-MxA(質(zhì)粒圖譜如圖4所示)。2、雙基因表達(dá)載體AMP構(gòu)建以上述pCDNA-appA(質(zhì)粒圖譜如圖2所示)為模板，以表1所列的引物擴(kuò)增表1 所列的相應(yīng)構(gòu)件。5iiL 10XBuffer,8 u L 2. 5mM dNTPU U L 20 ii M 引物 CMV-appA-Ll、 luL 20 ii M 弓丨物 CMVappA-Rl (序列見表 1)、0. 5 u L5U/ P L 高保真 Tag 聚合酶，lOOng pcDNA-appA質(zhì)粒，加超純水至50 P L (高保真酶購(gòu)自大連寶生物，貨號(hào)DR010A)。PCR擴(kuò)增 程序98°C 10s,68°C 3min，循環(huán)30次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn) 物部分測(cè)序(invitrogen公司)；表明擴(kuò)增得到的CMV-appA-BGH pA片段(核苷酸序列如 序列表中序列1的自5'端第618-2977位所示)；CMV-appA_BGH pA片段由依次串連的CMV 啟動(dòng)子、appA和BGH終止子組成；其中CMV啟動(dòng)子(核苷酸序列如序列表中序列1的自5' 端第671-1358位所示)、appA(核苷酸序列如序列表中序列1的自5'端第1360-2658位 所示)和BGH終止子(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第2735-2959位所示)。上述PCR產(chǎn)物CMV-appA-BGH pA片段用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操 作步驟見公司試劑盒)，用Mlu I酶切純化產(chǎn)物；同時(shí)用Mlu I單酶切pcDNA-MxA質(zhì)粒；將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的載體連接(連接酶購(gòu)自promega公司，貨號(hào)M1804)；按公司要求操 作步驟轉(zhuǎn)化DH5ci (購(gòu)自北京全式金公司，貨號(hào)CD201)感受態(tài)大腸桿菌；菌液涂瓊脂糖凝膠 板，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液PCR檢測(cè)插入片段中CMV-appA-BGH pA片段(擴(kuò)增體系同上擴(kuò)增CMV-appA-BGH pA片段部分(引物見表1)，其中模板改為菌液 2微升)，結(jié)果有對(duì)應(yīng)的CMV-appA-BGH pA片段擴(kuò)增條帶，將上述兩樣的部分菌液送公司測(cè) 序(invitrogen北京公司)；結(jié)果表明獲得含有CMV-appA-BGH pA片段和MxA表達(dá)盒的重 組表達(dá)載體，將該載體命名為pcDNA-appA-MxA，簡(jiǎn)稱為AMP。AMP的質(zhì)粒圖譜如圖5所示。測(cè)序表明，AMP具有序列表中序列1的核苷酸序列，其序列中含有appA表達(dá)盒和 MxA表達(dá)盒。其中appA表達(dá)盒由依次串聯(lián)的CMV啟動(dòng)子(核苷酸序列如序列表中序列1的自 5'端第671-1358位所示)、appA(核苷酸序列如序列表中序列1的自5'端第1360-2658位 所示)和BGH終止子(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第2735-2959位所示)組成； MxA表達(dá)盒由依次串聯(lián)的CMV啟動(dòng)子(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第3114-3802 位所示)、MxA(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第3803-5791位所示)和BGH終止 子(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第5868-6092位所示)組成。二、轉(zhuǎn)基因胚胎的制備1、將步驟一得到的 pcDNA-appA-MxA 用 Seal (購(gòu)自 fermentas 公司，貨號(hào) ER0431)
5及Smal (購(gòu)自fermentas公司，貨號(hào)ER0661)雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收6. 9Kb大小的 條帶，稀釋成5ng/ia。測(cè)序表明，該6. 9Kb大小的條帶的核苷酸序列如序列表中序列1所
7J\ o將上述6. 9Kb大小的線性化片段利用顯微注射的方法注射到豬的原核期胚胎中， 得到轉(zhuǎn)基因胚胎，在NCSU 23培養(yǎng)基中(購(gòu)自millipore公司，貨號(hào)MR-182-D)培養(yǎng)至8細(xì) 胞期。2、轉(zhuǎn)基因胚胎檢測(cè)取其中部分胚胎的基因組DNA直接作為模板，按照ProtoScript M-MuLV TaqRT-PCR試劑盒(購(gòu)自NEB公司，貨號(hào)E6400S)操作說明(引物為表1所列舉的appA及 MxA的定量PCR檢測(cè)引物)，直接檢測(cè)胚胎中appA(引物是表1中的appA-RTLl和appA-RTRl)及 MxA(引物是表 1 中的 hMxl-RTLl 和 hMxl-RTRl)。PCR 反應(yīng)體 系為 50 u l,5u L10XBuffer,8 u L2. 5mM dNTPU U L20 ii M 上游引物、1 ii L20yM 下游引物、 0. 5 u L5U/ u L高保真Tag聚合酶，加超純水至50 u L，以獲得的小豬基因組DNA為待檢測(cè)模 板，PCR擴(kuò)增程序95°C 5min ；94°C 20s，退火溫度56°C，72°C lm，循環(huán)30次，最后72°C延伸 5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出分別能擴(kuò)增出appA、MxA基因的， 結(jié)果表明，所檢測(cè)的24個(gè)胚胎中，第13和第17號(hào)胚胎檢測(cè)出能同時(shí)表達(dá)appA基因及MxA 基因(圖6)。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備一、制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物按實(shí)施例1中方法制備的轉(zhuǎn)基因胚胎，體外發(fā)育到8細(xì)胞期，然后將在體外通過陰 道子宮頸移植到發(fā)情同步的母豬子宮角經(jīng)過培養(yǎng)得到38個(gè)轉(zhuǎn)基因豬。二、轉(zhuǎn)基因豬的整合檢測(cè)1、PCR 檢測(cè)利用appA和MxA定量檢測(cè)引物(見表1)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因豬基因組DNA中相應(yīng)基因的 整合檢測(cè)上述轉(zhuǎn)基因豬中外源基因的整合情況。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增體系同實(shí)施例1的步驟二的轉(zhuǎn)基因胚胎檢測(cè)相同，篩選出分 別能擴(kuò)增出appA和MxA基因的豬(圖7)(圖中，+ 陽(yáng)性對(duì)照，pcDNA-appA-Mx質(zhì)粒為模 板；-陰性對(duì)照，正常豬DNA為模板；1-23 為不同轉(zhuǎn)基因后代豬擴(kuò)增條帶)。從圖7的上圖中可見1_23號(hào)豬中3、6、11、17、20、22號(hào)豬基因組DNA能擴(kuò)增出 355bp左右的條帶，條帶和預(yù)期擴(kuò)增的appA條帶一致；從圖7的下圖可見1_23號(hào)豬中豬中 3、6、11、17、20、22號(hào)豬基因組DNA能擴(kuò)出325bp條帶和預(yù)期擴(kuò)增的MxA條帶一致。擴(kuò)增產(chǎn) 物測(cè)序表明擴(kuò)增出的片段的核苷酸序列均正確。2、southen 雜交檢測(cè)分別以表1中appA和MxA的定量PCR檢測(cè)引物為引物，按照試劑盒操作說明書體 系加樣；PCR 運(yùn)行程序如下:95°C 5min，94°C 45S，56°C lmin，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)后 72°C延 伸10min(探針標(biāo)記試劑盒購(gòu)自innogen-cn公司，貨號(hào)DDLK_010)，得到兩個(gè)PCR產(chǎn)物。分別以上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物為探針進(jìn)行southen雜交檢測(cè)，雜交前在95°C變性5分 鐘后立即冰水中放置10分鐘備用；大量抽提步驟1中鑒定過的編號(hào)為3、6、11、17、20、22 號(hào)轉(zhuǎn)基因豬的豬耳組織DNA，用Hindlll及Not I雙酶切基因組，濃縮基因組酶切產(chǎn)物至300ng/ul ；于瓊脂糖凝膠電泳分離各酶切片段，每孔上樣50微升；然后使DNA原位變 性后轉(zhuǎn)移到帶正電荷尼龍膜上。按照試劑盒操作說明進(jìn)行預(yù)雜交、雜交及X-光片曝光檢測(cè) 雜交信號(hào)(購(gòu)自innogen-cn公司，貨號(hào)DI⑶-210)。檢測(cè)結(jié)果(圖8)表明，southern雜 交檢測(cè)的編號(hào)為3、6、11、17、20、22號(hào)轉(zhuǎn)基因豬中整合了 appA基因和MxA基因。三、RT-PCR檢測(cè)分別從步驟二中篩出的編號(hào)為3、6、11、17、20、22號(hào)轉(zhuǎn)基因豬的豬耳靜脈采集100 微升血液，按照天根血液總RNA提取試劑盒(貨號(hào)DP433)操作說明，提取各組細(xì)胞總RNA ； 按照T0Y0B0反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)FSK-100)，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.分別以上述的cDNA為模板，用表1中appA和MxA定量PCR檢測(cè)引物，進(jìn)行半定量 PCR檢測(cè)appA和MxA，其中以豬GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參(引物見表1)，PCR反應(yīng)體系為50 yl， 5u L10X Buffer,8 u L 2. 5mM dNTPU U L 20 ii M 上游引物、1 ii L 20yM 下游引物(擴(kuò)增 appA.MxA及豬GAPDH的引物分別見表1)、0. 5 u L5U/ u L高保真Tag聚合酶，lOOng模板，加 超純水至50ii L。PCR擴(kuò)增程序95°C5min ；94°C 20s，退火溫度 56°C，72°C lm，，最后 72°C延伸 5min， 內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增時(shí)23個(gè)循環(huán)，其他模板擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖9)。半定量結(jié)果表明，3、20號(hào)豬 均能檢測(cè)到MxA和appA的表達(dá)，說明對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因豬能同時(shí)表達(dá)MxA及appA基因。表1 本發(fā)明中用于擴(kuò)增載體構(gòu)件的引物表1 本發(fā)明中用于擴(kuò)增載體構(gòu)件的引物
序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
<120> 一種制備同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法
<160>1
<210>1
<211>6915
<212>DNA
<213>1
<400>1actcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgt60
caatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaac120
gttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac180
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8
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1權(quán)利要求
一種制備轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A均導(dǎo)入目的胚胎中，得到轉(zhuǎn)基因胚胎。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表 中序列1的自5’端第1360-2658位；所述人粘病毒抗性基因A的核苷酸序列如序列表中序 列1的自5，端第3803-5791位。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A 是通過核苷酸序列如序列表中序列1所示的DNA片段導(dǎo)入胚胎中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎為原核期胚胎。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎為豬、牛、羊、貓、狗、兔 或鼠的胚胎。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，是將權(quán)利要求1-5中任一所述的方法制備的轉(zhuǎn)基因胚 胎移植到雌性的目的動(dòng)物的體內(nèi)，得到能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述目的動(dòng)物為豬、牛、羊、貓、狗、兔或鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。本發(fā)明還公開了一種制備轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，上述制備轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，是將植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A均導(dǎo)入目的胚胎中，得到轉(zhuǎn)基因胚胎。將轉(zhuǎn)基因胚胎移植到雌性的目的動(dòng)物的體內(nèi)，即可得到表達(dá)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的顯著優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在一次轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)多基因的同時(shí)表達(dá)，為制備轉(zhuǎn)聯(lián)合基因動(dòng)物等提供一種便捷的手段。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101851637SQ201010034318
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者唐中林, 崔文濤, 李奎, 楊述林, 樊俊華, 牟玉蓮, 白立景, 鞠輝明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所