專利名稱：建蘭花葉病毒外殼蛋白基因的表達(dá)及其抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的領(lǐng)域?yàn)樯锛夹g(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種建蘭花葉病毒外殼蛋白基因
的表達(dá)及其抗體制備方法。
背景技術(shù)：
建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)是嚴(yán)重危害世界各地蘭科植物的主要病毒之一。建蘭花葉病毒粒子為線狀，大小約為475nmX 13nm或?yàn)?90nmX 13nm，CymMV基因組核酸為一條線狀正鏈ssRNA。研究發(fā)現(xiàn)建蘭花葉病毒常與齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, 0RSV)形成復(fù)合感染，使蘭花葉片形成不規(guī)則的褪綠條紋、圓斑、環(huán)斑甚至壞死等癥狀，導(dǎo)致植物生長不良、花小而少，花期縮短，使蘭花的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值大為下降，近年來，隨著蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，該病毒在全球范圍內(nèi)廣為傳播，給蘭花種植業(yè)造成極大的損失，在我國海南、廣東、浙江、江蘇、云南等地也有該病毒的報道。因而迫切需要建立快速、準(zhǔn)確、簡單方便的檢測方法，為該病毒病的診斷和防治，脫毒種苗的生產(chǎn)提供技術(shù)支撐和物質(zhì)支持。由于建蘭花葉病毒常常與齒蘭環(huán)斑病毒形成復(fù)合感染，故很難通過分離純化病毒來制備高質(zhì)量的抗體，本專利通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CymMV的外殼蛋白，并利用純化的蛋白免疫兔子、羊、BALB/C鼠來制備該病毒的多抗血清和單克隆抗體，并建立了檢測CymMV的免疫捕獲RT-PCR及ELISA的方法。為該病毒病的診斷、分子研究、抗病育種和脫毒苗的培育提供技術(shù)支持。本專利運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)建蘭花葉病毒外殼蛋白，并用表達(dá)的蛋白制備CymMV特異性抗體，從而使建立的檢測CymMV免疫捕獲RT-PCR及ELISA血清學(xué)方法具有準(zhǔn)確性、易標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模等特點(diǎn)。這些檢測方法為該病毒病的診斷和防治、脫毒種苗和抗病育種服務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種建蘭花葉病毒外殼蛋白基因的表達(dá)及其抗體制備方法。
建蘭花葉病毒外殼蛋白基因的表達(dá)方法包括如下步驟 1)根據(jù)GenBank中的編碼CymMV外殼蛋白基因的全長序列設(shè)計(jì)引物，上游弓|物CP-F為5' -CGGGATCCATGGGAGAGCCCACTCCA-3'，下游引物CP-R為5' -CGGTCGACTTATTCAGTAGGGGGTGCAG-3'，上游引物下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物下劃線處為Sal I酶切位點(diǎn)，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。
2)利用Trizol試劑提取建蘭花葉病毒蘭花病葉的總RNA ; 3)RT-PCR克隆CymMV外殼蛋白基因用下游引物按照RevertAid 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成CymMV外殼蛋白基因第一鏈cDNA進(jìn)行，利用上述設(shè)計(jì)的一對引物，以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆CymMV外殼蛋白基因； 4)CymMV外殼蛋白基因按正確的讀碼框插入到原核表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建成重組原核表達(dá)載體pET-32a-CP ;
3
5)將重組載體pET-32a-CP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株；6)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4-6h，離心收集菌體，菌體經(jīng)超聲波破碎，收集上清用Ni+NTA
親和層析柱純化目的蛋白。 建蘭花葉病毒抗體的制備方法包括如下步驟 1)用權(quán)利要求1所述方法表達(dá)的建蘭花葉病毒外殼蛋白免疫BALB/C鼠、羊和兔子制備多克隆抗體； 2)取免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇融合劑下融合，HAT
篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗CymMV病毒的陽性孔； 3)用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并
分泌抗CymMV特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞； 4)雜交瘤細(xì)胞注射入BALB/C鼠腹腔制備單抗腹水； 5)用間接ELISA所述的方法鑒定制備單克隆抗體僅與CymMV病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與其它植物病毒沒有任何免疫反應(yīng)。 所述用權(quán)利要求1方法表達(dá)的建蘭花葉病毒外殼蛋白作為免疫原。所述用于田間CymMV檢測、進(jìn)出口 CymMV檢疫、病毒分子研究及為抗病育種和脫毒苗的培育服務(wù)。所述的用于田間CymMV檢測的方法為免疫捕獲RT-PCR、 ACP-EL ISA 、 DAS-EL ISA或TAS-ELISA。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn) 1)提供一種建蘭花葉病毒外殼蛋白基因的表達(dá)及其抗體制備的方法。該專利方法制備的建蘭花葉病毒外殼蛋白含量高、純度好，制備的抗體特異性強(qiáng)、靈敏度高、質(zhì)量好；利用制備的抗體建立的免疫捕獲RT-PCR、ELISA方法能夠高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測CymMV ;
2)利用本發(fā)明所制備的抗體建立的檢測CymMV方法，不需要昂貴的電子顯微鏡設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，且費(fèi)用低； 3)利用本發(fā)明所制備的抗體，為該病毒病的診斷、抗病育種和脫毒苗的培育提供物質(zhì)支持。


圖1RT-PCR擴(kuò)增CymMV外殼蛋白基因。1 :健康蘭花葉子RT-PCR結(jié)果；2、3 :RT-PCR擴(kuò)增感染CymMV蘭花病葉產(chǎn)物； 圖2重組蛋白的SDS-PAGE分析，M :中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ;1 :誘導(dǎo)后含
pET-32a空載體的宿主菌；2、3 :未純化的重組蛋白；4、5 :純化的重組蛋白； 圖3IC-RT-PCR方法檢測CymMV病毒，1-4 :CymMV感病蘭花；5 :健康蘭花。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明制備了含量高、純度好的建蘭花葉病毒外殼蛋白，制備了特異性強(qiáng)、靈敏度高、質(zhì)量好的CymMV抗體，利用制備的抗體建立的免疫捕獲RT-PCR、 ELISA方法能夠高度特異、準(zhǔn)確、靈敏、快速檢測CymMV，可為蘭花脫毒鑒定和抗病育種提供有力的技術(shù)和產(chǎn)品支持，對該病毒病的綜合防治提供直接的理論依據(jù)和技術(shù)保障，同時可應(yīng)用于進(jìn)出口檢驗(yàn)、檢疫等方面。 —、CymMV外殼蛋白基因的克隆
根據(jù)GenBank中的編碼CymMV外殼蛋白基因的全長序列設(shè)計(jì)引物，上游引物
CP-F為5' -CGGGATCCATGGGAGAGCCCACTCCA-3'，下游引物CP-R為5' -CGGTCGA￡TTATTCAGTAGGGGGTGCAG-3'，上游引物下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物下劃線處為Sal I酶切位點(diǎn)，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)合成。利用Trizol試劑提取病樣的總RNA，第一鏈cDNA的合成按照RevertAidTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，即模板RNA 2iU，下游引物liil， RNase Free H2o 9iU。混合后70。C下5min，取出置冰上3-5min ;加入4ii 15XRT Buffer, 2 yl dNTP Mix, 1 ii 1 Rnasin Inhibitor,混合后37°C下5min ;加入1 ii 1 Reverse Transcriptase,混合后42。C下反應(yīng)lh，70。C下10min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下預(yù)變性94°C 3min，變性94°C 45s，退火54°C 40s，延伸72°C 40s，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后延伸72°C 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8X瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并用PCR凝膠回收試劑盒(AxyGEN)回收DNA片段，具體操作參考試劑盒說明書進(jìn)行。將回收的目的基因片段與克隆載體PMD-18T vector連接，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-CP，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5a的感受態(tài)細(xì)胞中，用質(zhì)粒提取試劑盒(AxyGEN)提取重組質(zhì)粒，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，并通過測序驗(yàn)證重組克隆載體pMD18-T-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框的正確性，序列分析軟件為DNAstar、 NCBI-BLAST，所用的數(shù)據(jù)庫為GeneBank。通過RT-PCR方法擴(kuò)增得到如圖1所示約670bp大小的CymMV外殼蛋白基因。序列測定和GenBankBLAST分析表明，克隆到的基因是CymMV外殼蛋白基因。將克隆產(chǎn)物割膠回收后連接到pMD_18T克隆載體上，經(jīng)PCR和酶切鑒定得到陽性克隆pMD18-T-CP。 二、 CymMV外殼蛋白基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其誘導(dǎo)表達(dá)、純化
重組質(zhì)粒pMD18-T-CP中CP基因片段經(jīng)Sal I和BamH I雙酶切后定向插入經(jīng)同樣酶切的pET-32a表達(dá)載體中。PCR、酶切篩選陽性克隆，并通過測序驗(yàn)證重組原核表達(dá)載體pET-32a-CP中所攜帶外殼蛋白基因序列未突變且讀碼框正確。將重組載體pET-32a-CP和pET-32a空載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，挑取單菌落接種到含氨卞青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37t:培養(yǎng)過夜，按l : IOO的比例將培養(yǎng)物接種于含氨卞青霉素抗性的新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D600 " 0. 5加入終濃度為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心收集菌體。部分菌體加入1 X SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水中處理5-10min， 12000rpm離心后取上清lOiil進(jìn)行12. 5% SDS-PAGE電泳分析，并用6XHis單克隆抗體進(jìn)行Western-blot鑒定。其余菌體經(jīng)超聲波破碎，收集上清按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行用Ni+NTA親和層析柱純化目的蛋白。并用TPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，在約為45kDa處出現(xiàn)一較高濃度的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，與預(yù)計(jì)的融合蛋白大小相一致(圖2A)， Ni+NTA親和層析柱純化回收液的SDS-PAGE電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅在45kDa處有一條明顯條帶(圖2)。進(jìn)一步利用6XHis標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，該表達(dá)的重組蛋白和20kDa空載體蛋白均能與6XHis單克隆抗體起特異性反應(yīng)，表明CymMV的外殼蛋白基因已經(jīng)在大腸桿菌BL21 (DE3)中融合表達(dá)，并成功進(jìn)行純化。
三、表達(dá)蛋白的多抗血清制備 純化的表達(dá)重組蛋白經(jīng)PBS透析后取約300 ii g的抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，對雄性新西蘭大白兔進(jìn)行背部脊柱兩側(cè)以及腹股溝和腋窩兩側(cè)進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射免疫。18天后進(jìn)行二免，二免的免疫劑量為200iig，并與弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行皮下注射。以后每隔18天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫不加佐劑，并采用大腿肌注的方式免疫。每次免疫后7天取少量血清，用間接ELISA測定抗體的效價，當(dāng)間接ELISA效價達(dá)到1 : 100000以上時，取血并分離獲得血清100毫升，抗血清于-8(TC冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 四、CymMV單克隆抗體的制備方法
1.免疫動物 用原核表達(dá)的CymMV外殼蛋白免疫四周齡體重18_20g BALB/C雌性小鼠lmg/ml提取CymMV外殼蛋白0. 5_0. 7ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射O. 2-0. 3ml每只，間隔3-4周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0. 2-0. 3ml每只，共加強(qiáng)免疫2次，用加倍劑量的抗原進(jìn)行末免，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
2.細(xì)胞融合 取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10 : 1的比例，在無血清的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50% PEG(聚乙二醇，Sigma)作為融合劑，在37t:下水浴下加入0. 5_0. 7ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT篩選培養(yǎng)基(Sigma)懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，371:，5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。
3.雜交瘤細(xì)胞、陽性孔的篩選及其克隆 細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT篩選培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5% -50%時，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲250多個對CymMV有反應(yīng)的陽性孔，陽性率為40% 。選擇8個呈強(qiáng)陽性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得1A12、6C7和16E2共3株能分泌抗CymMV的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)6個月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，3株細(xì)胞株均能良好生長，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
4.單克隆抗體的特異性檢測 用建蘭花葉病毒(CymMV)、齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)、香石竹斑駁病毒(CarMV)、甘蔗花葉病毒(SCMV)、蕪菁花葉病毒(TuMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、蠶豆萎蔫病毒1(BBWV-l)、蠶豆萎蔫病毒2(BBWV-2)、香石竹環(huán)斑病毒(CaRSC)、馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)病葉汁包被ELISA反應(yīng)板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對照，用間接ELISA法，分別測定3株單抗的特異性反應(yīng)。間接ELISA方法具體為上述病葉汁分別用包被液稀釋成20倍(W/V)后100u1/孔包被ELISA板，4t:過夜或37t: 2小時，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1_10%的脫脂奶粉或1-3%BSA或3-6X牛血清封閉30-60min ;加入單抗100u1/孔，37°C 1_2小時；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)100ul/孔，37t: 1-2小時，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取0D405的值，以與陰性0D值比值大于2. l為陽性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株單抗對CymMV有特異性反應(yīng)，而與CymMV、 0RSV、 CarMV、 TMV、 ToMV、 CMV、 SCMV、 PVY、 PVX、 BBWV1 、 BBWV2、 TuMV、CaRSC其他病毒均無特異性反應(yīng)。
5.單克隆抗體腹水制備及純化 取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5ml降植烷(Sigma) ， 7-10天后腹腔注入5-10X 105個雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000-5000rpm離心3_5min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0. 06M KM. 8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4t:澄清1小時，12000rpm離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4t:放置2小時，3000-5000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4。C流動透析24小時后即獲純化的腹水抗體，-7(TC保存。 6.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定 將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG， IgG" IgG2a， IgG2b、IgG3，IgM抗體，作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果為，單抗的類型及亞類均為IgGl，3株單克隆抗體的輕鏈均為k鏈。用常規(guī)間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，結(jié)果為上述3株腹水效價均在10—6以上。 7.AP-抗CymMV單克隆抗體結(jié)合物的制備 將30mg AP禾P 1. Omg純化的單克隆抗體混勻于0. 5ml PBS(O. 01mol/l、ra7.2)，加入戊二醛至終濃度為0.2%，于室溫下溫和攪拌2小時。反應(yīng)物中加入10mMTris-HCL(pH8. O，O. 15M NaCl，l匪MgC12)至lml，然后用上述Tris-HCL緩沖液于4C流動透析24小時。透析以后的產(chǎn)物即為AP-單克隆抗體結(jié)合物，結(jié)合物中加入滅菌甘油至50% (V/V)，于-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 8.單克隆抗體識別位點(diǎn)分析 3ug/ml抗原(提純CymMV外殼蛋白)100ul/孔于96孔ELISA板中，4。C包被過夜；用PBST洗滌三次，2% BSA 150u1/孔37°C ，封閉1小時，加一種單抗腹水50ul及AP標(biāo)記的另一種單抗50ul， 37°C 1小時；PBST洗滌三次后加硝基苯磷酸鹽底物100ul/孔，37°C 20分鐘，0D4。5測定吸收值。以單抗腹水對同一 AP標(biāo)記的單抗抑制為100%，以已知無關(guān)單抗腹水對標(biāo)記單抗的抑制為陰性對照，計(jì)算各單抗間的抑制率。即抑制率為(l-測定值OD/陰性對照值OD)XIOO。抑制率> 75%為相關(guān)，> 50%為不完全相關(guān)，< 50%為不相關(guān)，< 25%為完全不相關(guān)，結(jié)果表明3株抗CymMV單抗識別3個不相關(guān)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
9.用單抗建立間接抗原包被ELISA(ACP-ELISA)方法檢測病毒
ACP-ELISA方法的操作步驟 (1)用碳酸鹽緩沖液(pH9. 6)30倍稀釋的病葉汁液100u1/孔加入ELISA板，CY匪V病葉為陽性對照，相應(yīng)健葉為陰性對照，37t: 2h，或4t:過夜；
(2) PBST洗滌后用5 %脫脂奶粉封閉30min ;
(3)單抗腹水5000倍稀釋后100u1/孔，37°C lh ; (4) PBST洗滌后加入5000倍稀釋的AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG結(jié)合物(Sigma) ， lOOul/孔，37。C，lh ; (5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物lOOul/孔，室溫30min ; (6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽性，或用酶聯(lián)免疫檢測儀測0D405
值，以P/N > 2. 1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。 ACP-ELISA方法檢測靈敏度檢測 單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對病葉從1 : 5至2560作倍比稀釋，提純病毒(5mg/l)從l : 1000至l : 500000作倍比稀釋，分別以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對照，進(jìn)行上述ACP-ELISA方法檢測。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對1 : 5 500倍稀釋的病葉汁液均呈陽性反應(yīng)，即對檢測病葉的靈敏度可達(dá)到1 : 500， ACP-ELISA方法對純病毒的檢測靈敏度可達(dá)2ng/ml，每孔的病毒絕對量檢測為0. 2ng。表現(xiàn)ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。 10. CymMV的單抗DAS-ELISA檢測方法 1)抗CymMV的一株單抗5000倍稀釋100ul/孔包被聚苯乙烯板，37t:，2-4h或4t:，過夜； 2) PBST洗滌三次后加1-10 %的脫脂奶粉或1-3 % BSA或3-6 %牛血清封閉200ul/孔于37。C封閉30-60min 3)加入檢測樣品lOOul/孔。以CymMV為陽性對照，以相應(yīng)的健康樣品作陰性對照，37。C l-2h ; 4) PBST洗滌后加入10000倍稀釋堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記另一單抗結(jié)合物lOOul/孔，37。C l_2h 5) PBST洗滌后加PNPP底物于室溫顯色5-30min， 2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽性或用680型酶聯(lián)免疫檢測儀測405nm的OD值，以P/N>2. l作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
DAS-ELI SA方法檢測靈敏度檢測 對病葉從l : 5至5120作倍比稀釋，提純病毒(5mg/l)從l : IOOO至I : 1024000作倍比稀釋，分別以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對照，進(jìn)行上述DAS-ELISA方法檢測。結(jié)果表明DAS-ELISA方法對1 : 5 1000倍稀釋的病葉汁液均呈陽性反應(yīng)，即對檢測病葉的靈敏度可達(dá)到l : 1000， DAS-ELISA對純病毒的檢測靈敏度可達(dá)0.2ng/ml，每孔的病毒絕對量檢測為0. 02ng。表現(xiàn)DAS-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。
11. CymMV的TAS—ELISA檢測方法
11. 1. TAS-ELISA方法的操作流程 1)將抗原核表達(dá)的外殼蛋白的兔多抗血清lOOul/孔包被聚苯乙烯板，37t:，2-4h
或4t:，過夜； 2) PBST洗滌三次后加1-10 %的脫脂奶粉或1-3 % BSA或3-6 %牛血清封閉200ul/孔于37。C封閉30-60min 3)加入檢測樣品lOOul/孔。以CymMV為陽性對照，以相應(yīng)的健康樣品作陰性對照，37。C l-2h ; 4)洗滌后用封閉液稀釋的單抗腹水lOOul/孔，37°C l_2h 5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗結(jié)合物(Sigma) lOOul/孔，37°C l_2h 6) PBST洗滌后加PNPP底物于室溫顯色5-30min， 2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽性或用680型酶聯(lián)免疫檢測儀測405nm的OD值，以P/N>2. l作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。 11. 2. TAS-ELISA檢測方法最適條件的確定 采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向加多抗血清用包被緩沖液從1 : 100至1 : 102400倍比稀釋；CymMV lug/ml ;縱向加用PBST緩沖液從1 : 5至1 : 2048000倍
8比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)記的兔抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說明書稀釋，1 : 10000倍；按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果為CymMV的兔抗血清最適稀釋度均為1 : 6000 ;1A12、6C7和16E2的最適稀釋度分別為1 : 8000， 1 : 10000， 1 : 6000， 1 : 6000。
11. 3. TAS-ELISA方法檢測靈敏度的確定 在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將lug/ml的CymMV用含1_3% BSA的PBST倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELI SA測定，結(jié)果為TAS-ELI SA檢測3株單抗的靈敏度均在0. Olng以上，說明本方法具有很好的靈敏度。
12.上述ELISA方法的田間檢測CymMV的應(yīng)用 利用制備的抗體建立的上述ELISA方法對田間蘭花進(jìn)行檢測。在浙江麗水地區(qū)蘭花上采收呈病毒癥狀的病樣，作l : 30倍稀釋，然后進(jìn)行上述ELISA檢測，用健株汁液作陰性對照，接種CymMV的汁液作陽性對照。檢測結(jié)果表明，蘭花上CymMV的帶毒率很高，31. 2%樣品呈陽性，與電鏡觀察檢測結(jié)果一致，這表明所制備的抗體和建立的上述ELISA方法能很好的用于田間CymMV的檢測，同時，明確了 CymMV病毒是田間蘭花上流行的主要病毒種類。13.免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄PCR(Immunoc即ture RT-PCR， IC-RT-PCR)檢測CymMV
以上游引物CP-F : 5 ' -CGGGATCCATGGGAGAGCCCACTCCA-3 '，下游引物CP-R : 5 '-CGGTCGACTTATTCAGTAGGGGGTGCAG-3'為引物。200 ii 1的抗體(多抗1 : 500倍稀釋，單抗l : 200倍稀釋)包被PCR管，37t:孵育2h;移去包被液，用PBST洗3次，每次3min;加入200ii L病葉汁液上清(lg鮮葉+2mL 0. 02mol/L PBS， pH 7. 2研磨，3000r/min離心2min)，以健康和感染CymMV的蘭花葉片分別作為陰性和陽性對照，37。C孵育2h或4°C過夜；移去抗原液，用PBST洗3次，ddH20洗1次，洗畢作短暫離心，吸去管底余液；往管中加入ddH2019iiL、5XRT buffer 8iiL、10mmo/L dNTP 4 ii L、 lOOmmol/L DTT 4yL、20iimol/L3' primer L、稍離心混勻后置94。C變性4min，迅速置冰上3min ;往管中加入AMV (200U/ ii L， Promega) 2 ii L、 RNasin (20U/ ii L， Promega) 1 ii L，反應(yīng)總體積40 ii L，禾肖離心混勻后置42。C反轉(zhuǎn)錄lh ;取10iiL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加入10XPCR buffer 5 y L、 10mmol/Ld證liiL、20iimol/L 5'primer 1 ii L、20 ii mol/L 3' primer 1 ii L、Taq plus IDNA聚合酶(5U/ ii L， Sangon) 0. 5 y L、 ddH20 31. 5 y L，反應(yīng)總體積50 y L，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性3min ;94。C變性45s， 54。C退火40s， 72。C延伸40s， 30循環(huán)，最后一次循環(huán)后，72t:補(bǔ)平延伸10min ;PCR結(jié)束后，取5 y L反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳及擴(kuò)增的DNA片段核酸測序驗(yàn)證IC-RT-PCR檢測結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示用CymMV外殼蛋白的特異性引物可以從CymMV感染蘭花葉片的液汁中擴(kuò)增到大小約為670bp的特異性條帶，與預(yù)期的外殼蛋白基因條帶大小一致，而健康蘭花的液汁中未能擴(kuò)增到任何條帶(圖3)。擴(kuò)增到的基因割膠回收后進(jìn)一步測序表明，擴(kuò)增到的DNA片段是CymMV的外殼蛋白基因。
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權(quán)利要求
一種建蘭花葉病毒外殼蛋白基因的表達(dá)方法，其特征在于包括如下步驟1)根據(jù)GenBank中的編碼CymMV外殼蛋白基因的全長序列設(shè)計(jì)引物，上游引物CP-F為5′-CGGGATCCATGGGAGAGCCCACTCCA-3′，下游引物CP-R為5′-CGGTCGACTTATTCAGTAGGGGGTGCAG-3′，上游引物下劃線處為BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物下劃線處為SalI酶切位點(diǎn)；2)利用Trizol試劑提取建蘭花葉病毒蘭花病葉的總RNA；3)RT-PCR方法克隆CymMV外殼蛋白基因用下游引物按照RevertAidTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成CymMV外殼蛋白基因第一鏈cDNA，利用上述設(shè)計(jì)的一對引物，以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆CymMV外殼蛋白基因；4)CymMV外殼蛋白基因按正確的讀碼框插入到原核表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建成重組原核表達(dá)載體pET-32a-CP；5)將重組載體pET-32a-CP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)菌株；6)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-6h，離心收集菌體，菌體經(jīng)超聲波破碎，收集上清用Ni+NTA親和層析柱純化目的蛋白。
2. —種建蘭花葉病毒抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟1) 用權(quán)利要求1所述方法表達(dá)的建蘭花葉病毒外殼蛋白免疫BALB/C鼠、兔子或羊動物制備多克隆抗體；2) 取免疫BALB/C鼠的脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗CymMV病毒抗體的陽性孔；3) 用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗CymMV特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；4) 雜交瘤細(xì)胞注射入BALB/C鼠腹腔制備單抗腹水；5) 用間接ELISA方法鑒定制備單克隆抗體僅與CymMV病毒有特異性免疫反應(yīng)，而與其它植物病毒沒有任何免疫反應(yīng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蘭花建蘭花葉病毒抗體的制備方法，其特征在于用權(quán)利要求1所述方法表達(dá)的建蘭花葉病毒外殼蛋白作為免疫原。
4. 一種如權(quán)利要求2所述方法制備的CymMV病毒抗體的用途，其特征在于用于田間CymMV檢測、進(jìn)出口 CymMV檢疫、病毒分子研究及為抗病育種和脫毒苗的培育服務(wù)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種CymMV病毒抗體的用途，其特征在于所述的用于田間CymMV檢測的方法為免疫捕獲RT-PCR、 ACP-ELISA、 DAS-ELISA或TAS-ELISA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)外殼蛋白基因的表達(dá)及其抗體制備方法。利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)建蘭花葉病毒的外殼蛋白，用原核表達(dá)的建蘭花葉病毒外殼蛋白免疫兔子、BALB/C鼠制備其多抗血清，利用雜交瘤技術(shù)制備其單克隆抗體，并用制備的抗體建立了檢測CymMV高度特異性、靈敏性和正確性的的免疫捕獲RT-PCR及ELISA方法。為該病毒病的診斷、抗病育種和脫毒苗的培育提供技術(shù)支持。本發(fā)明提供的建蘭花葉病毒外殼蛋白基因的表達(dá)及其抗體制備方法為建蘭花葉病毒的快速檢測診斷、分型和分子生物學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，為該蘭花病毒病的防治打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/40GK101748136SQ20101003969
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者吳建祥, 孟春梅, 洪健 申請人:浙江大學(xué)