專(zhuān)利名稱(chēng)：一種可高效清除環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因矮牽牛的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可高效清除苯、甲苯等環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因矮牽牛的培育方法。
(二)
背景技術(shù)：
苯和甲苯在油漆、染色劑、粘合劑、墻紙、地毯、合成纖維、清潔劑和一些有機(jī)溶劑 等化工原料中廣泛使用，是室內(nèi)環(huán)境污染的主要危害氣體之一；此外，在圖文傳真機(jī)、電腦 終端機(jī)和打印機(jī)使用過(guò)程中也產(chǎn)生苯和甲苯的污染，煙草的煙霧和汽油的尾氣中也含有 苯和甲苯，而苯和甲苯具有極強(qiáng)的致癌性(王桂華，周中平，傅立新.《室內(nèi)空氣中苯和甲 苯濃度分布特征調(diào)查》.上海環(huán)境科學(xué)，2003，22(12) :977-978,982 ;沈?qū)W優(yōu)，羅曉璐，朱 利中.《空氣中揮發(fā)性有機(jī)化合物的研究進(jìn)展》.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2001,28(5): 547-556)。對(duì)于室內(nèi)苯和甲苯等污染物造成的空氣污染，人們通常采取的方法是開(kāi)窗通風(fēng) 換氣，但由于裝修、辦公和起居生活產(chǎn)生的苯、甲苯等污染物都是緩慢長(zhǎng)期釋放的(莊曉 虹，胡筱敏，孫承智.《室內(nèi)空氣中揮發(fā)性有機(jī)物的釋放特征分析》.環(huán)境污染與防治，2008， 30(12) :102-105)，其對(duì)入住的戶主危害性極大。 利用植物凈化空氣化學(xué)污染是一種經(jīng)濟(jì)、有效、非破壞型的環(huán)境污染修復(fù)方式。 植物凈化化學(xué)性大氣污染的主要過(guò)程是持留和去除，持留過(guò)程涉及植物截獲、吸附和滯留 等，去除過(guò)程包括植物吸收、降解、轉(zhuǎn)化、同化和超同化等，而且這項(xiàng)技術(shù)更容易與環(huán)境融 為一體，種下的花草更能滿足綠化和審美的要求。(李長(zhǎng)閣，于濤，傅樺，趙同科.《轉(zhuǎn)基 因植物修復(fù)重金屬污染土壤研究進(jìn)展》.土壤，2007，39(2) :181-189 ;廖曉勇，陳同斌，閻 秀蘭，聶燦軍.提高植物修復(fù)效率的技術(shù)途徑與強(qiáng)化措施.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(6): 881-892)。但遺憾的是，只有部分自然存在的植物對(duì)空氣污染物具有一定的分解凈化功 能，并且其效率非常低。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為提高植物的環(huán)境修復(fù)能力提供了基礎(chǔ)(胡光珍，王 幼芳，何玉科.轉(zhuǎn)基因植物對(duì)有機(jī)污染物的吸收、轉(zhuǎn)化和降解.植物生理與分子生物學(xué) 學(xué)報(bào)，2005，31 (4) :340-346。 Van Aken B. Transgenic plants for phytoremediation: helpingnature to clean 卯 environmental pollution. Trends Biotechnol，2008， 26(5) :225-227)。細(xì)胞色素P4502E1是哺乳動(dòng)物肝臟中存在的一種分解酶，在動(dòng)物體內(nèi) 對(duì)有機(jī)環(huán)境污染物具有很強(qiáng)的特異性分解功能(Gonzalez FJ. The2006Bernard B. Brodie Award Lecture CYP2E 1. Drug Metab Dispos，2007，35(1) :1-8。 Lee SS， Buters JT， Pineau T， Femandez-SalgueroP， Gonzalez FJ. Role of CYP2E1 in the h印atotoxicity of acetaminophen. J Biol Chem，1996，271 (20) :12063-12067)。 另一方面，矮牽牛(Petunia hybrida)是多年生草本花卉，被譽(yù)為"花壇花卉之 王"。它既可以地栽布置花壇；又適宜盆植吊植、美化陽(yáng)臺(tái)居室，深受人們喜愛(ài)，在世界各地 廣泛種植。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種可高效清除苯、甲苯等環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因矮牽牛的培育
3方法。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 —種可高效清除環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因矮牽牛的培育方法，所述方法包括 (1)將含有CYP2E1基因(GenBank登記號(hào)M15061)的質(zhì)粒導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌
(Agrobacterium rhizogenes)，篩選得到抗性菌落；CYP2E1基因是P450酶基因家族中的成
員之一，在哺乳動(dòng)物肝臟組織中特異性表達(dá)，其編碼蛋白在代謝小分子有機(jī)污染物中起重
要作用。 (2)步驟(1)抗性菌落的單克隆菌液侵染帶有傷口的野生型矮牽牛(Petunia hybrida)葉片，培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因毛狀不定根； (3)步驟(2)轉(zhuǎn)基因毛狀不定根在含芐氨基嘌呤1.0mg/L的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得 愈傷組織，愈傷組織在含芐氨基嘌呤1. Omg/L+ a -萘乙酸0. 4mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得叢 生芽，叢生芽在含a-萘乙酸O. lmg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因矮牽牛的再生植株。
所述含有CYP2E1基因的質(zhì)?？勺孕袠?gòu)建，采用現(xiàn)有已知質(zhì)粒，本發(fā)明中，所述質(zhì) 粒為質(zhì)粒pSLD50-6，由美國(guó)華盛頓大學(xué)Doty教授惠贈(zèng)。 本發(fā)明中，所述發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌K599 。發(fā)根農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性菌， 能侵染大多數(shù)的雙子葉植物、少數(shù)單子葉植物及個(gè)別的裸子植物，誘發(fā)被感染植物的受傷 部位長(zhǎng)出毛狀根。 所述環(huán)境污染物是指苯或其衍生物，優(yōu)選的，所述環(huán)境污染物為苯或甲苯。
具體的，所述步驟(1)為在發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)細(xì)胞中加入pSLD50-6的純化 質(zhì)粒DNA，混勻后冰上放置10min，置于液氮速凍5min， 28。C水浴熱激5min，加入LB液體培 養(yǎng)基于28t:振蕩培養(yǎng)2h后，取菌液涂布于含卡那霉素50mg/L+鏈霉素50mg/L的LB固體培 養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)48h后，篩選得到抗性菌落。 具體的，所述步驟(2)為抗性菌落經(jīng)活化培養(yǎng)后，在含卡那霉素50mg/L+鏈霉素 50mg/L的MS液體培養(yǎng)基中28t:下振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 4 0. 6，離心，收集的菌體細(xì)胞 經(jīng)清洗后進(jìn)行浸染操作；將帶有傷口的野生型矮牽牛的葉片預(yù)培養(yǎng)于含乙酰丁香酮20mg/ L的MS液體培養(yǎng)基3d后，用收集的抗性菌落的菌體細(xì)胞侵染8min，再轉(zhuǎn)入含乙酰丁香酮 20mg/L的MS液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)3d，經(jīng)含頭孢霉素500mg/L的MS液體培養(yǎng)基清洗后轉(zhuǎn)入含 芐氨基嘌呤1. 0mg/L+卡那霉素50mg/L+頭孢霉素500mg/L的MS液體培養(yǎng)基中，長(zhǎng)出不定根 后，將不定根轉(zhuǎn)入含頭孢霉素500mg/L+卡那霉素50mg/L的MS液體培養(yǎng)基中除菌和繁殖， 獲得轉(zhuǎn)基因毛狀不定根。 本發(fā)明首先將含有CYP2E1基因的載體pSLD50-6和含有對(duì)照GUS基因的載體 pKH200分別轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因法獲得轉(zhuǎn)CYP2E1和對(duì)照GUS基因的 轉(zhuǎn)基因毛狀不定根，毛狀不定根在MS+BA 1. Omg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織 在MS+BA l.Omg/L+NAA 0. 4mg/L培養(yǎng)基上獲得叢生芽，叢生芽在MS+NAA 0. lmg/L培養(yǎng)基上 再生植株。經(jīng)過(guò)PCR分析，再生植株含有目的基因和rolB基因。隨機(jī)選取3株轉(zhuǎn)CYP2E1基 因的再生植株、1株轉(zhuǎn)GUS基因的對(duì)照植株和l株野生型(非轉(zhuǎn)基因)植株分別提取植株總 RNA，用GAPDH基因做內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)CYP2E1基因的再生植株中， 外源CYP2E1基因均高效表達(dá)，含GUS基因的對(duì)照植株和野生型植株則沒(méi)有檢測(cè)到CYP2E1 的表達(dá)信號(hào)。利用氣相色譜定量分析轉(zhuǎn)基因再生株系對(duì)苯和甲苯的吸收情況，結(jié)果(r2>0. 99，p < 0. 05)顯示在含有5mL MS液體基本培養(yǎng)基的20mL的有機(jī)物分析瓶中，同時(shí)加入 42. 5 ii g苯和15 ii g甲苯，6天后0. 75g鮮重的轉(zhuǎn)CYP2E1基因的再生植株材料，對(duì)苯的吸收 率達(dá)59. 03%、對(duì)甲苯的吸收率達(dá)75. 74%，轉(zhuǎn)CYP2E1基因的再生植株在清除環(huán)境中的苯、 甲苯的能力極顯著地提高；而對(duì)照轉(zhuǎn)GUS基因的植株和野生型植株對(duì)苯和甲苯的吸收無(wú)明 顯變化。 本發(fā)明的有益效果主要提現(xiàn)在本發(fā)明獲得的矮牽?？捎糜谇宄覂?nèi)苯和甲苯等 空氣污染物，十分有利于人民的身心健康，有利于提高人民的生活品質(zhì)，有利于生態(tài)環(huán)境建 設(shè)。
(四)


圖1為質(zhì)粒pSLD50-6圖譜； 圖2矮牽牛轉(zhuǎn)CYP2E1基因的不定根和再生植株；A :誘導(dǎo)出的不定根；B :不定根誘 導(dǎo)的愈傷組織；C :再生植株；D :自然生長(zhǎng)的再生植株； 圖3矮牽牛轉(zhuǎn)CYP2E1基因再生植株的PCR鑒定；A :CYP2E1基因擴(kuò)增結(jié)果(1 :野生 型發(fā)根農(nóng)桿菌K599自身攜帶的Ri質(zhì)粒；2 :組織培養(yǎng)再生的植株；3 9 :轉(zhuǎn)CYP2E1基因植 株)；B :rolB基因擴(kuò)增結(jié)果(1 :質(zhì)粒pSLD50_6 ;2 :組織培養(yǎng)再生的植株；3 9 :轉(zhuǎn)CYP2E1 基因植株)；圖4為熒光定量RT-PCR分析CYP2E1基因在轉(zhuǎn)CYP2E1基因、轉(zhuǎn)GUS基因和野 生型(非轉(zhuǎn)基因)植株中表達(dá)情況； 圖5為氣相色譜分析轉(zhuǎn)CYP2E1基因、轉(zhuǎn)GUS基因、野生型(非轉(zhuǎn)基因)矮牽牛植 株對(duì)苯的分解吸收情況； 圖6為氣相色譜分析轉(zhuǎn)CYP2E1基因、轉(zhuǎn)GUS基因、野生型(非轉(zhuǎn)基因)矮牽牛植 株對(duì)甲苯的分解吸收情況；
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此 實(shí)施例1 :
1.材料與方法
1. 1材料 矮牽牛(Petunia hybrida)品種為QLOl，利用離體葉片組織培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。 野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599由杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，含 CYP2El基因的質(zhì)粒pSLD50-6(質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1)以及對(duì)照含GUS基因的質(zhì)粒pKH200均由美 國(guó)華盛頓大學(xué)Doty教授惠贈(zèng)。 1. 2質(zhì)粒pSLD50-6和pKH200導(dǎo)入野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599 利用凍融法將質(zhì)粒pSLD50-6和pKH200分別轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，即在 100ii LK599感受態(tài)細(xì)胞中加入約0. 1 ii g純化質(zhì)粒DNA，混勻后在冰上放置10min，置于液氮 速凍5min，立即用28。C水浴熱激5min，加入500 y L LB液體培養(yǎng)基，在28。C緩慢振蕩培養(yǎng) 2h。取100 ii L菌液分別涂布于LB+Km(卡那霉素)50mg/L+Str (鏈霉素)50mg/L固體培養(yǎng) 基上，2『C培養(yǎng)約48h篩選抗性菌落。
1. 3矮牽牛轉(zhuǎn)基因不定根的誘導(dǎo)和植株再生 參考王琳和向太和的方法(王琳，向太和.《矮牽牛F3' ，5' H全長(zhǎng)cDNA的克隆及 花特異啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建》.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2009，17(4) :358-364)，利用改 良的葉盤(pán)法對(duì)矮牽牛葉片外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即發(fā)根農(nóng)桿菌K599/pSLD50-6或pKH200 于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L平板中劃線28。C活化后，挑取單克隆于LB+Km 50mg/L+Str 50mg/L液體培養(yǎng)基中28 。C ， 200r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取lmL菌液移入50mL的MS+Km 50mg/ L+Str 50mg/L液體培養(yǎng)基中28°C ， 200r/min培養(yǎng)至0D6。。為0. 5左右，離心管收集菌液并用 MS液體培養(yǎng)基懸浮清洗3次。在無(wú)菌條件下侵染事先預(yù)培養(yǎng)于MS+As (乙酰丁香酮)20mg/ L3d帶有傷口的葉片8min，轉(zhuǎn)入MS+As 20mg/L固體培養(yǎng)基共培養(yǎng)3d后，經(jīng)MS+Cef (頭孢霉 素)500mg/L液體培養(yǎng)基清洗3次后轉(zhuǎn)入MS+6-BA 1. Omg/L+Km 50mg/L+Cef500mg/L的篩選 培養(yǎng)基中。待長(zhǎng)出不定根后，將不定根轉(zhuǎn)入MS+Cef500mg/L+Km 50mg/L培養(yǎng)基中除菌和繁 殖。 根據(jù)CYP2E1基因(GenBank登記號(hào)M15061)禾P GUS基因(GenBank登記號(hào) AF354045)設(shè)計(jì)引物CYP2E1-P1:5' -TGAAGGGTGTGCAGCCGATGACAA-3'
CYP2E1-P2:5' -CATCGGGAATCTTCTCCAGTTGG-3'，
GUS-P1:5' -CTGCGACGCTCACACCGAT-3'，
GUS-P2:5' -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3'; 同時(shí)，參考王琳和向太和的方法(王琳，向太和.《矮牽牛F3' ，5' H全 長(zhǎng)cDNA的克隆及花特異啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建》.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2009， 17(4) :358-364)，禾U用弓|物rolB—Pl :5 ' -GCCAGCATTTTTGGTGAACT—3 '禾P rolB—P2 : 5' -CTGGCCCATCGTTCTAAAAAA-3'對(duì)獲得的CYP2E1基因和GUS基因的不定根的基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。 除菌繁殖后的不定根在MS+BA 1. Omg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織在 MS+BA 1. Omg/L+NAA 0. 4mg/L培養(yǎng)基獲得叢生芽，叢生芽在MS+NAA 0. lmg/L培養(yǎng)基上再生 根獲得完整植株。此外，同不定根的方法對(duì)再生植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。
1. 4矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株CYP2E1基因的熒光定量RT-PCR分析 提取植株總RNA，用Fermentas公司試劑盒RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，熒光定量PCR擴(kuò)增試劑為T(mén)aKaRa公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix。 根據(jù)矮牽牛GAPDH基因序列(GenBank登記 號(hào)GQ122207)設(shè)計(jì)弓|物，GAPDH-F:5 ' -AGCAAGGCAGTTAGTGGTGCA-3 ' 和GAPDH-R : 5 ' -TTGTGATCTCCGCTCCTAGCA-3 '，擴(kuò)增結(jié)果作為內(nèi)參。根據(jù)CYP2E1基因 序歹lj 設(shè)計(jì)弓l 物，CYP2E l-F:5 ' -ATTCCCAAGTCCTTTGGCAGG-3 ' ;CYP2E 1-R : 5' -TGTGGTTCAACAGCATCTCCC-3'，進(jìn)行CYP2E1基因的定量分析。用Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀型進(jìn)行擴(kuò)增，熒光定量PCR條件是起始95 °C 2min，隨后95 °C 30s、 59°C 30s、72。C 20s進(jìn)行40循環(huán)，結(jié)束后在4。C保存。參考schmittgen和Livak的方法計(jì)算 相對(duì)表達(dá)量=2-(cT處理-CT內(nèi)參)(Schmittgen TD，Livak KJ. Analyzing real-timePCR data by the comparative C(T)method. Nat Protoc，2008，3 (6) :1101-1108)。
1. 5矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株對(duì)苯和甲苯吸收能力的氣相色譜分析
在20mL的揮發(fā)性有機(jī)物分析瓶(VOA(volatile organic analysis)vial)內(nèi)盛放 5mL MS液體基本培養(yǎng)基，滅菌。在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌切取稱(chēng)量相同質(zhì)量(0.75g)的轉(zhuǎn)基因 無(wú)菌苗植株、對(duì)照無(wú)菌植株的葉莖放入VOAvial中，并設(shè)置空白對(duì)照瓶(僅有培養(yǎng)基而無(wú) 植物材料)，用塑料膜封口 ，放入組織培養(yǎng)室的搖床上，100r/min， 22 24°C ，光照16h/d。 ld后，用微量加樣器向VOA vial中加入42. 5iig苯、15iig甲苯，用帶放氣閥的瓶蓋封口， 繼續(xù)在上述的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。平衡培養(yǎng)2h后，用氣密性氣體取樣器進(jìn)行第1次取樣，用 Aglient型號(hào)為6890N的氣相色譜儀，色譜柱型號(hào)為DB-624(30mX0. 53mmX3. Oum)進(jìn)行檢 測(cè)。檢測(cè)條件為進(jìn)樣口溫度為20(TC，檢測(cè)組溫度25(TC，分流比為5 : l，用N2以4. OmL/ min恒流洗脫，柱溫60。C，5min，并以20°C /min升到200。C并保持5min，頂空80。C，30min。 隨后2d(48h) 、4d(96h)和6d(146h)分別取樣進(jìn)行氣相色譜分析。
2.結(jié)果與分析 2. 1矮牽牛轉(zhuǎn)基因不定根和再生植株的獲得 矮牽牛無(wú)菌苗離體葉片在發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后10d左右，切口邊緣長(zhǎng)出白色小突 起；15d左右，切口邊緣長(zhǎng)出明顯可見(jiàn)的白色不定根(圖2A);而未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的外 植體未見(jiàn)根的生成。待不定根長(zhǎng)到5cm左右，切成兩段，培養(yǎng)在無(wú)任何植物激素的MS+Cef 500mg/L+Km 50mg/L上除菌。在該培養(yǎng)基上不定根生長(zhǎng)旺盛，15 20d即可形成大量毛狀分 枝的不定根。除菌后的轉(zhuǎn)基因不定根在MS+BA 1.0mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15d左右不定根出現(xiàn) 綠色愈傷組織(圖2B)。愈傷組織在MS+BA 1. Omg/L+NAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上45d左右，綠色 愈傷組織分化出叢生芽，叢生芽在MS+NAA 0. lmg/L培養(yǎng)基上再生出根而形成完整植株(圖 2C)，且植株在形態(tài)上表現(xiàn)出矮生和叢生分枝狀。 根據(jù)CYP2E1基因序列設(shè)計(jì)的引物CYP2E1-P1和CYP2E1-P2對(duì)轉(zhuǎn)CYP2E1基因植株 和質(zhì)粒pSLD50-6均擴(kuò)增出410bp的條帶；而組織培養(yǎng)再生的植株未能擴(kuò)增出任何條帶。根 據(jù)rolB基因序列設(shè)計(jì)的引物rolB-Pl和rolB-P2對(duì)隨機(jī)選取的7個(gè)轉(zhuǎn)CYP2E1基因和野生 型發(fā)根農(nóng)桿菌K599自身攜帶的Ri質(zhì)粒均擴(kuò)增出約500bp大小的條帶，而組織培養(yǎng)再生的 植株未能擴(kuò)增出條帶。圖3)。 2. 2轉(zhuǎn)CYP2E1基因矮牽牛植株熒光定量RT-PCR 在隨機(jī)選取的3株轉(zhuǎn)CYP2E1基因的再生植株、1株轉(zhuǎn)GUS基因的對(duì)照植株和1株野 生型(非轉(zhuǎn)基因)植株中，用GAPDH基因做內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)CYP2E1 基因的再生植株中，外源CYP2E1基因均高效表達(dá)，含GUS基因的對(duì)照植株和野生型植株則 沒(méi)有檢測(cè)到CYP2E1的表達(dá)信號(hào)(圖4)。 2. 3轉(zhuǎn)CYP2E1基因矮牽牛植株對(duì)苯和甲苯的分解吸收能力 利用氣相色譜定量分析轉(zhuǎn)基因再生株系對(duì)苯和甲苯的吸收情況，結(jié)果(r2 > 0. 99，p < 0. 05)顯示在含有5mL MS液體基本培養(yǎng)基的20mL的有機(jī)物分析瓶中，同時(shí)加入 42. 5 ii g苯和15 ii g甲苯，6d后0. 75g鮮重的轉(zhuǎn)CYP2E1基因的再生植株材料對(duì)苯的吸收率 達(dá)59. 03%、對(duì)甲苯的吸收率達(dá)75. 74%，分析瓶中苯和甲苯的含量顯著地下降；而對(duì)照轉(zhuǎn) GUS基因的植株和野生型植株對(duì)苯和甲苯的吸收無(wú)明顯變化(圖5和6)。
3.結(jié)論 植物在近地表大氣污染物的清除中起著重要作用，利用植物凈化空氣污染是一種 經(jīng)濟(jì)、有效、非破壞型的環(huán)境污染修復(fù)方式；而且這項(xiàng)技術(shù)更容易與環(huán)境融為一體，種下的花草更能滿足綠化和審美的要求。但遺憾的是只有部分自然存在的植物對(duì)空氣污染物具有 一定的分解凈化功能，并且其效率非常低。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為提高植物的環(huán)境修復(fù)能力提供了 g石出。 CYP2E1基因是P450酶基因家族中的成員之一，在哺乳動(dòng)物肝臟組織中特異性表 達(dá)，其編碼蛋白在代謝小分子有機(jī)污染物中起重要作用。 本發(fā)明成功地通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將細(xì)胞色素P4502E1酶基因(CYP2E1) 轉(zhuǎn)入矮牽牛中，獲得CYP2E1基因高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，具有高效清除苯和甲苯的能力。 本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)CYP2E1基因花卉矮牽牛，在生產(chǎn)上具有實(shí)用性，這為利用花卉園藝植物降 低室內(nèi)空氣中苯和甲苯的污染提供了一條新途徑。此外，本發(fā)明使用的是發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基 因法，獲得的轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)上表現(xiàn)出矮生和叢生分枝狀，因此也有利于選育出新異形 態(tài)的矮牽牛育種材料。
SEQUENCE LISTING
〈110〉杭州師范大學(xué) 〈120〉 一種可高效清除環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因矮牽牛的培育方法
〈130〉
〈160>10 〈170>PatentIn version 3. 4 〈210>1 〈211>24 〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220〉 〈223〉人工序列 〈400〉 1 tgaagggtgt gcagccgatg acaa 24 〈210>2 〈211>23 〈212>DNA 〈213〉Unknown 〈220〉 〈223〉人工序列 〈400>2 catcgggaat cttctccagt tgg 23 〈210>3 〈211>19 〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220〉 〈223〉人工序列
〈400>3 ctgcgacgct cacaccgat 19 〈210>4 <211>24 〈212>DNA 〈213〉Unknown 〈220> <223>人工序列 〈400>4 tcaccgaagt tcatgccagt ccag 24 〈210>5 <211>20 〈212>DNA 〈213〉Unk麗n 〈220〉 <223>人工序列 〈400>5 gccagcattt ttggtgaact 20 〈210>6 〈211>21 〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220> 〈223>人工序列 〈400>6 ctggcccatc gttctaaaaa a 21 〈210>7 〈211>20〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220> 〈223>人工序列 〈400>7 agcaaggcag ttagtggtgc 20 〈210>8 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉Unknown 〈220>:0122] :0123]
〈223〉人工序列
<400>8
:0124]
ttgtgatctc cgctcctagc a
:0125] 〈210>9
:0126] <211>21
:0127] 〈212>DNA
:0128] 〈213>Unknown
:0129] 〈220〉
:0130] 〈223>人工序列
:0131] 〈400〉9
:0132] attcccaagt cctttggcag g 21
:0133] 〈210>10
:0134] 〈211〉21
:0135] 〈212>DNA
:0136] 〈213>Unknown
:0137] 〈220〉
:0138] 〈223>人工序列
:0139] 〈400〉 10
:0140] tgtggttcaa cagcatctcc c 21
10
權(quán)利要求
一種可高效清除環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因矮牽牛的培育方法，所述方法包括(1)將含有CYP2E1基因的質(zhì)粒導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)，篩選得到抗性菌落；(2)步驟(1)抗性菌落的單克隆菌液侵染帶有傷口的野生型矮牽牛(Petuniahybrida)葉片，培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因毛狀不定根；(3)步驟(2)轉(zhuǎn)基因毛狀不定根在含芐氨基嘌呤1.0mg/L的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得愈傷組織，愈傷組織在含芐氨基嘌呤1.0mg/L+α-萘乙酸0.4mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得叢生芽，叢生芽在含α-萘乙酸0.1mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因矮牽牛的再生植株。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含有CYP2E1基因的質(zhì)粒為質(zhì)粒 pSLD50-6。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌K599。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述環(huán)境污染物為苯或甲苯。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(1)為在發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài) 細(xì)胞中加入pSLD50-6的純化質(zhì)粒DNA，混勻后冰上放置10min，置于液氮速凍5min， 28。C水 浴熱激5min，加入LB液體培養(yǎng)基于28。C振蕩培養(yǎng)2h后，取菌液涂布于含卡那霉素50mg/L+ 鏈霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基，2『C培養(yǎng)48h后，篩選得到抗性菌落。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為抗性菌落經(jīng)活化培養(yǎng)后，在 含卡那霉素50mg/L+鏈霉素50mg/L的MS液體培養(yǎng)基中28。C下振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 4 0. 6，離心，收集的菌體細(xì)胞經(jīng)清洗后進(jìn)行浸染操作；將帶有傷口的野生型矮牽牛的葉片預(yù) 培養(yǎng)于含乙酰丁香酮20mg/L的MS液體培養(yǎng)基3d后，用收集的抗性菌落的菌體細(xì)胞侵染 8min，再轉(zhuǎn)入含乙酰丁香酮20mg/L的MS液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)3d，經(jīng)含頭孢霉素500mg/L的 MS液體培養(yǎng)基清洗后轉(zhuǎn)入含芐氨基嘌呤1. 0mg/L+卡那霉素50mg/L+頭孢霉素500mg/L的 MS液體培養(yǎng)基中，長(zhǎng)出不定根后，將不定根轉(zhuǎn)入含頭孢霉素500mg/L+卡那霉素50mg/L的 MS液體培養(yǎng)基中除菌和繁殖，獲得轉(zhuǎn)基因毛狀不定根。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可高效清除環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因矮牽牛的培育方法，所述方法包括將含有CYP2E1基因的載體pSLD50-6轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因法獲得轉(zhuǎn)CYP2E1基因的轉(zhuǎn)基因毛狀不定根，毛狀不定根在MS+BA 1.0mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織在MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L培養(yǎng)基上獲得叢生芽，叢生芽在MS+NAA 0.1mg/L培養(yǎng)基上再生植株，獲得轉(zhuǎn)基因矮牽牛。本發(fā)明獲得的矮牽牛可用于清除室內(nèi)苯和甲苯等空氣污染物，十分有利于人民的身心健康，有利于提高人民的生活品質(zhì)，有利于生態(tài)環(huán)境建設(shè)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101768603SQ201010039820
公開(kāi)日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者向太和, 龐基良, 張道祥, 王利琳, 胡江琴 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)