專利名稱：利用中肋骨條藻快速評價鉆井液生物毒性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及鉆井液的生物毒性評價方法，具體地說是利用中肋骨條藻快速評價鉆 井液生物毒性的方法。
背景技術：
鉆井液是一種由水以及各種化學處理劑組成的極其復雜的多相穩(wěn)定膠態(tài)懸浮體， 其生物毒性主要來源于鉆井液各組分。對于鉆井液的生物毒性評價的研究始于20世紀60 年代，已發(fā)展了包括96h急性毒性和慢性毒性等多種評價方法，所采用的受試生物體多種 多樣，包括糠蝦、發(fā)光細菌、中肋骨條藻(如Skeletonema costatum，即本工作所選用的中 肋骨條藻)、橈腳類、蚤類和魚類以及雙貝類軟體動物、片腳類動物。美國等國家主要檢測 鉆井液的毒性，以歐洲經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)為代表的組織和國家則要求同時檢測 鉆井液及其組分的毒性。目前國內外對廢棄鉆井液的毒性檢測及分級評價方法尚無統(tǒng)一標 準。20世紀70年代中期美國環(huán)保局(EPA)和石油工業(yè)協(xié)會(API)共同制訂了巴西擬 糠蝦(Mysidopsis bahia)%h急性毒性實驗法，是美國環(huán)保局批準的鉆井液毒性評價的唯 一方法，也是美國試驗與材料學會(ASTM)和美國石油工業(yè)協(xié)會推薦的鉆井液毒性的評價 標準。由于美國EPA推薦使用的巴西擬糠蝦在我國無分布，我國學者致力于尋找新的可以 替代糠蝦的受試生物。與美國EPA糠蝦法的96h急性毒性試驗時間相比，發(fā)光細菌法和發(fā)光海藻法測量 時間大大縮短。其中發(fā)光細菌法是根據(jù)發(fā)光細菌的發(fā)光度隨樣品毒性總體濃度的增高而呈 線性降低的特性，測定發(fā)光細菌在接觸樣品15min后的發(fā)光量，得出樣品的毒性水平。該檢 測方法具有簡易、快速、實時的特點，但由于多數(shù)鉆井液的黑褐色在發(fā)光細菌的發(fā)光波段有 吸收，需要校正才能應用。另外，該方法與糠蝦法的相關性較低，僅為0.3。而發(fā)光海藻法采 用專用的毒性檢測儀，如QwikLiteTM 200，利用夜光發(fā)光藻Pyrocystis lunula作為測試 物種，當海藻接觸到污染物時，水中的毒性會殺死海藻，從死亡率預測污染物對人體和生態(tài) 環(huán)境危害的嚴重性，4 證時即可得出鉆井液的毒性結果。但是發(fā)光海藻在實驗室培養(yǎng)較 為困難，并且要求鉆井液貯備液的PH在7. 5-8. 0，通常鉆井液貯備液的pH值往往超出此范 圍。2001年我國頒布的國家標準《海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性檢驗方法》GB/ T18420. 2-2001規(guī)定采用對蝦的仔蝦、鹵蟲幼體或蒙古裸腹蚤中的一種進行毒性實驗。 《海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性分級》GB/T18420. 1-2001規(guī)定，對于屬于一級海區(qū)的渤 海、萊州灣，生物毒性容許值為3X 104mg · L-1，當96hLC50大于或等于3X104mg · L-1時，則 鉆井液為符合生物毒性要求，可直接排放入海；小于3X 10 -Γ1時，為不符合生物毒性要 求，判定為有毒。在國家標準推薦的三種模式生物中，鹵蟲易保存、易孵化，是非常好的毒性 試驗生物，但鉆井液需要其與作用足夠長的時間，如才能顯示毒性。因此，尋求敏感生物指示物，其在短時間內與鉆井液作用所顯示出的毒性與國家 標準鹵蟲法試驗得到的毒性具有好的相關性，從而建立鉆井液毒性快速評價方法，乃實際生產(chǎn)所急需。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用中肋骨條藻快速評價鉆井液生物毒性的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為首先，選取渤海海域優(yōu)勢藻種中肋骨 條藻作為毒性試驗的生物；第二，研究鉆井液對中肋骨條藻的EC50與96hEC5(l的關系；第 三，研究快速評價指標以國家標準GB/T18420. 2-2001中鹵蟲法^hLC5tl的相關性。具體為(1)按體積比取1份鉆井液加入9份海水，攪拌靜置后取上層混懸液做為貯備液；(2)選擇中肋骨條藻進行培養(yǎng)，中肋骨條藻的培養(yǎng)條件為(20士 l)°C，4000LuX，明 暗周期12 l i，F(xiàn)/2培養(yǎng)基；接種后密度為4X104個/mL;培養(yǎng)4d至平穩(wěn)期，得到進入平 穩(wěn)生長期后的中肋骨條藻藻液；(3)將貯備液加入盛有藻液的錐形瓶中進行混合培養(yǎng)；以每個錐形瓶中液體體積 為140mL計，藻液體積為IOOmL,所加入的貯備液體積從0至40mL梯度變化，每個濃度設置 4個平行樣；若混合容器中藻液與貯備液的體積不足的，以過濾滅菌后的天然海水補充至 140mL ；(4)在和從錐形瓶中取樣，測定680nm處的藻葉綠素熒光強度；(5)以未加貯備液的藻熒光強度作為對照，計算中肋骨條藻的相對死亡率中肋骨條藻的相對死亡率=(未加鉆井液的藻熒光強度-加鉆井液的藻熒光強 度)/未加鉆井液的藻熒光強度；(6)半數(shù)有效濃度EC5tl的計算根據(jù)中肋骨條藻的相對死亡率，利用Microsoft Excel 2003軟件分別繪制中肋骨 條藻死亡率與鉆井液濃度關系曲線，得出中肋骨條藻致死率為50%所對應的鉆井液貯備液 的體積V(mL)，根據(jù)EC50 = 0. IVX 1. 02X 103/0. 14(單位:mg .L-1)計算相應時間的EC50值， 其中，鉆井液貯備液的密度近似地取海水密度1. 02g · mL—1。(7)根據(jù)中肋骨條藻的EC50值按照國家標準確定鉆井液有無毒性。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.快速。本發(fā)明建立的利用中肋骨條藻對水基鉆井液毒性的評價方法，比常規(guī) 96h生物毒性實驗時間縮短了 89h。2.準確。對鉆井液的生物毒性評價結果與鹵蟲96h LC5tl的一致。具體實施實例本發(fā)明采用的技術方案工藝流程為(1)鉆井液貯備液配制；(2)中肋骨條藻的培養(yǎng)；(3)不同種類鉆井液對中肋骨條藻的和96h的毒性試驗；(4)不同種類鉆井液對鹵蟲96h的毒性試驗；(5)基于中肋骨條藻的鉆井液毒性快速評價方法與鹵蟲法的相關性。本發(fā)明主要研究內容包括(1)探討鉆井液對中肋骨條藻的幾EC50與96h EC50的關系；
(2)考察鉆井液對中肋骨條藻的EC5tl與水基鉆井液對鹵蟲的96hLC5(1的相關性。實驗包括樣品準備、中肋骨條藻馴化培養(yǎng)、鉆井液對中肋骨條藻毒性實驗、鉆井液 對鹵蟲幼體的毒性實驗、鉆井液毒性評價等五個部分。1.鉆井液貯備液的制備按照中國國家標準《海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性檢驗方法》(GB/ T18420. 2-2001)配制。鉆井液貯備液的制備按體積比取1份鉆井液加入9份海水，3000r/min攪拌 15min，靜置60min后取上層混懸液做為貯備液。本發(fā)明試驗了勝利油田鉆井院研制和現(xiàn)場使用過的6種不同種類的水基鉆井液 樣品及8種不同種類的鉆井液用處理劑。2.中肋骨條藻馴化培養(yǎng)(1)中肋骨條藻來源渤海海域分離，馴化培養(yǎng)。(2)中肋骨條藻的培養(yǎng)預先馴化、接種中肋骨條藻，使其生長同步。培養(yǎng)確定培養(yǎng)條件為(20士 1)°C， 4000-7000Lux,明暗周期12h 12h，F(xiàn)/2培養(yǎng)基。接種后密度為4X IO4個/mL ；培養(yǎng)4d至
平穩(wěn)期。本實驗和中肋骨條藻毒性實驗過程中使用的過濾海水以及錐形瓶、燒杯、量筒等 玻璃器具均經(jīng)過高壓滅菌處理。清潔海水經(jīng)過濾滅菌后使用。3.鉆井液對中肋骨條藻毒性實驗培養(yǎng)中肋骨條藻2. 4L至平穩(wěn)生長期，均分為M瓶，每瓶的體積為IOOmL,分別加 入鉆井液貯備液0、5、10、20、30、40mL(四個平行樣)，用過濾滅菌海水將藻液體積統(tǒng)一到 140mL ；在和時間取樣，測定藻液在Em = 680nm處的熒光強度數(shù)值。4.鉆井液對鹵蟲幼體的毒性實驗(1)設置1個空白對照組和6個鉆井液濃度梯度組50、1X102、2X102、5X102、 2. 5 X IO3U X104mg · Γ1 ；每組4個平行樣。取80mL海水分別加入28個IOOmL燒杯中，分 別加入一定量的鉆井液貯備液，用玻璃棒攪勻，將燒杯置于恒溫槽中保持溫度為27V。(2)加入鹵蟲為減少移取鹵蟲時吸取大量水分改變鉆井液的濃度，吸去盛放鹵 蟲的燒杯中多余的水分，使鹵蟲聚集于燒杯底部。用膠頭滴管隨機吸取健康、趨光性好的鹵 蟲幼體，然后小心移入實驗燒杯中，每個燒杯中投放10個，盡量減少分放的時間。(3)鹵蟲死亡和生長記錄每隔一定時間記錄鹵蟲幼體的死亡數(shù)目，持續(xù)96h。死 亡標準為在GL系列連續(xù)變倍體視顯微鏡下沉到燒杯底部的幼體在1 內仍不能游動者即 認為已死亡，移去死亡個體，將死亡個體數(shù)記錄在原始記錄表內。5.毒性評價(1)中肋骨條藻的相對死亡率的計算以未加鉆井液的藻的熒光強度作為對照，計算中肋骨條藻的相對死亡率中肋骨條藻的相對死亡率=(未加鉆井液的藻熒光強度-加鉆井液的藻熒光強 度)/未加鉆井液的藻熒光強度；(2)半數(shù)有效濃度EC5tl的計算半數(shù)有效濃度EC5tl 半效應(致死)濃度(EC5tl)是指在一定時間內，實驗系統(tǒng)中或某一生態(tài)系統(tǒng)中50%的實驗生物或某一生物種群表現(xiàn)出可觀察到的不良效應(或死亡)時 毒性物質的濃度。原始實驗數(shù)據(jù)經(jīng)上述計算得到中肋骨條藻死亡率，利用MicrosoftExcel 2003軟件繪制幾和96h的中肋骨條藻死亡率與鉆井液濃度關系曲線，根據(jù)EC5tl = 0. 1VX1. 02X1070. HOng·!/1)計算各時間的EC5tl值，式中V(mL)是關系曲線得出的致死 率50%對應的鉆井液貯備液的體積；鉆井液貯備液的密度近似地取海水密度1. 02g · mL—1。(3)鉆井液毒性結果根據(jù)我國國家標準《海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性分級》(GB/ T18420. 1-2001)，對于屬于一級海區(qū)的渤海、萊州灣，生物毒性容許值為3X 104mg化―1，以此 衡量鉆井液是否有毒。當中肋骨條藻^1EC5tl大于或等于3X 104mg -Γ1時，則鉆井液為符合 生物毒性要求，可直接排放入海；小于3X IO^ig · Γ1時，為不符合生物毒性要求，判定為有實驗結果按上述方法，分別試驗了 6種不同種類的水基鉆井液樣品及7種鉆井液用處理劑， 得到如下結果(1)中肋骨條藻在快速評價鉆井液的生物毒性與評價鉆井液的生物毒性結 果一致，其中有毒的水基鉆井液對中肋骨條藻的96hEC5(1和^1EC5tl的比值在0. 43 1。據(jù) 此提出了以中肋骨條藻^1EC5tl快速評價鉆井液急性毒性的方法，該方法重現(xiàn)性理想。(2)中肋骨條藻法與國標鹵蟲法存在相關性，相關系數(shù)R大于0.9。結論本發(fā)明建立的中肋骨條藻法對水基鉆井液的毒性評價結果與鹵蟲的96h LC5tl的一 致，比常規(guī)96h生物毒性實驗時間縮短了 89h，且能夠在現(xiàn)場使用。
權利要求
利用中肋骨條藻快速評價鉆井液生物毒性的方法，其特征在于
1.實驗室培養(yǎng)中肋骨條藻，中肋骨條藻的培養(yǎng)條件為(20士l)°C，4000Lux，明暗周期 12 :12h, F/2培養(yǎng)基；接種后密度為4X IO4個/mL ；培養(yǎng)4d至平穩(wěn)期，得到進入平穩(wěn)生長期 后的中肋骨條藻藻液；
2.按體積比取1份鉆井液加入9份海水，攪拌靜置后取上層混懸液做為貯備液；
3.將鉆井液貯備液藻液加入進入平穩(wěn)生長期后的中肋骨條藻藻液中，以每個錐形瓶中 液體體積為140mL計，藻液體積為IOOmL,所加入的貯備液體積從0至40mL梯度變化，每個 濃度設置4個平行樣；若混合容器中藻液與貯備液的體積不足的，以過濾滅菌后的天然海 水補充至140mL ；
4.后取樣，測定680nm處的藻葉綠素熒光強度；
5.以未加貯備液的藻熒光強度作為對照，計算中肋骨條藻的相對死亡率中肋骨條藻的相對死亡率=(未加鉆井液的藻熒光強度-加鉆井液的藻熒光強度)/ 未加鉆井液的藻熒光強度；
6.半數(shù)有效濃度EC5tl的計算根據(jù)中肋骨條藻的相對死亡率，利用Microsoft Excel 2003軟件分別繪制中肋骨條藻 死亡率與鉆井液濃度關系曲線，得出中肋骨條藻致死率為50%所對應的鉆井液貯備液的體 積 V(mL)，根據(jù) EC50 = 0. IVX 1. 02X 103/0. 14(單位:mg · L-1)計算相應時間的 EC50 值，其 中，鉆井液貯備液的密度近似地取海水密度1. 02g · mL—1。
7.根據(jù)中肋骨條藻EC5tl值按照國家標準確定鉆井液有無毒性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鉆井液的生物毒性評價的方法，具體地說是利用中肋骨條藻快速評價鉆井液生物毒性的方法，將鉆井液貯備液加入平穩(wěn)生長期的中肋骨條藻液中，7h后取樣測定680nm處的藻葉綠素熒光強度；以未加貯備液的藻熒光強度作為對照，計算中肋骨條藻的相對死亡率，利用Microsoft Excel 2003軟件繪制中肋骨條藻死亡率與鉆井液濃度關系曲線，根據(jù)7h EC50值按照國家標準確定鉆井液有無毒性。本發(fā)明建立的中肋骨條藻對鉆井液的毒性評價結果與鹵蟲的96h LC50的一致，比常規(guī)96h生物毒性實驗時間縮短了89h。
文檔編號C12Q1/02GK102134582SQ201010100558
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月25日 優(yōu)先權日2010年1月25日
發(fā)明者何興貴, 周守菊, 張妍, 李公讓, 楊景利, 薛玉志 申請人:中國石化集團勝利石油管理局鉆井工藝研究院, 中國石油化工集團