專利名稱：：利用微生物發(fā)酵廢棄細胞實現(xiàn)氮源循環(huán)利用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明具體涉及一種利用微生物發(fā)酵廢棄細胞實現(xiàn)氮源循環(huán)利用的方法，具體是指將發(fā)酵廢棄細胞水解后作為氮源再次用于發(fā)酵以實現(xiàn)微生物發(fā)酵中氮源循環(huán)利用的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：在利用微生物進行發(fā)酵生產(chǎn)的過程中，有機氮源作為原料中的主要成分對微生物的生長代謝起到了至關(guān)重要的作用。大部分氮源參與微生物細胞的合成，小部分則殘留在發(fā)酵液中。發(fā)酵工業(yè)中，通常選擇容易被微生物利用的有機氮源，例如酵母粉、蛋白胨或玉米漿等，這些氮源雖然能在最大程度上保證產(chǎn)物的產(chǎn)量及生產(chǎn)效率，然而卻價格昂貴。有研究證明，廢啤酒酵母、豆粕粉等物質(zhì)也可作為廉價的有機氮源被細胞利用。整個發(fā)酵過程中，隨著細胞活力的降低，發(fā)酵也隨即終止，細胞便作為廢棄物被排放。然而細胞是一個有機體，其體內(nèi)含有豐富的氨基酸和維生素，是微生物生長代謝所必需的物質(zhì)?？梢娙裟軐U棄細胞作為氮源再次用于微生物發(fā)酵，則可以減少酵母粉、蛋白胨等昂貴氮源的使用量，并能實現(xiàn)發(fā)酵過程中氮源的循環(huán)利用，這樣既降低了產(chǎn)品生產(chǎn)成本又減輕了廢棄物處理的負擔，達到了綠色、環(huán)保、節(jié)能的社會效益。目前有關(guān)廢棄細胞的處理多集中在廢酵母細胞的綜合利用，微生物細胞的滅活處理以及利用廢棄微生物治理污水等方面。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)目的是將廢棄細胞水解后作為氮源用于微生物的發(fā)酵，達到減少酵母粉、蛋白胨等昂貴氮源的使用量，并實現(xiàn)發(fā)酵過程中氮源的循環(huán)利用的目的，使得本發(fā)明的技術(shù)方案既能降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本，又能減輕廢棄物處理的負擔，達到綠色、環(huán)保、節(jié)能的社會效益。本發(fā)明提出的技術(shù)方案為—種利用微生物發(fā)酵廢棄細胞實現(xiàn)氮源循環(huán)利用的方法，其特征在于包括以下步驟(1)廢棄細胞的預(yù)處理；(2)細胞水解液的制備；(3)將細胞水解液作為氮源配制成微生物發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明所述的廢棄細胞可以是發(fā)酵工業(yè)中所有利用微生物進行發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后的菌體細胞，優(yōu)選發(fā)酵制備乳酸、丁二酸、乙醇等所得的廢棄細胞；本發(fā)明所述的步驟(1)是指將發(fā)酵液采用包括過濾、沉降、沉淀或離心處理后，經(jīng)過生理鹽水或純水洗滌后得到預(yù)處理后的廢棄細胞；本發(fā)明所述的步驟(2)是指采用包括超聲破碎、鹽溶、酶水解或酸水解制得細胞破碎液后，再經(jīng)離心得到上清液；3本發(fā)明所述的步驟(3)是指根據(jù)微生物發(fā)酵所需的總氮含量加入與之總氮含量相等的細胞水解液，再進行微生物發(fā)酵生產(chǎn)；本發(fā)明所述的步驟(3)還可以包括將細胞水解液與其他營養(yǎng)物質(zhì)聯(lián)用步驟，是指以細胞水解液實現(xiàn)氮源循環(huán)利用的能力達到極限時，選擇與少量酵母粉、玉米漿、豆粕粉等其他現(xiàn)有的所有可用于作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源聯(lián)合使用，以達到最佳發(fā)酵效果。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明所述的方法，將水解廢棄細胞后制備的發(fā)酵培養(yǎng)基與對應(yīng)不同氮源種類，但總氮含量相同，且除氮源以外其他微量元素和營養(yǎng)成分完全相同的常規(guī)培養(yǎng)基在完全相同的發(fā)酵條件下進行微生物發(fā)酵，證明使用該方法配制的培養(yǎng)基完全能達到相同的產(chǎn)物產(chǎn)量和效果，并且使部分氮源得以回收，實現(xiàn)其循環(huán)利用。此外，通過本發(fā)明提供的利用發(fā)酵廢棄細胞制得的細胞水解液作為氮源進行微生物的發(fā)酵生產(chǎn)，不僅可以減少酵母粉、蛋白胨等昂貴氮源的使用量，還能實現(xiàn)發(fā)酵過程中氮源的循環(huán)利用，這既降低了產(chǎn)品生產(chǎn)成本又減輕了廢棄物處理的負擔，達到了綠色、環(huán)保、節(jié)能的社會效益。具體實施例方式以下實施例對本發(fā)明做了詳細說明，但對本發(fā)明的應(yīng)用并無限制。實施例1本實施例在生物法制備丁二酸的過程中實現(xiàn)氮源的循環(huán)利用。首先以10g/L酵母粉為氮源進行厭氧發(fā)酵制備丁二酸，菌種為ActinobacillussuccinogenesNH113(CGMCC1716)，具體培養(yǎng)方法按照《食品與發(fā)酵工業(yè)》，2007，33(6):15中提供的培養(yǎng)方法。發(fā)酵結(jié)束后的廢棄細胞經(jīng)過離心、生理鹽水洗滌后稱重并測定其總氮含量，備用。本實施例中所采用的總氮含量測定方法為凱氏定氮法。表1單批發(fā)酵制備丁二酸中總氮的回收情況<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表1中可見，利用廢棄細胞為氮源進行發(fā)酵可以使73.6%的氮源得以回收利用。下面對水解液用于發(fā)酵的可行性進行驗證。將備用的細胞進行酶水解，水解條件如下堿性蛋白酶添加量4.17iiL/g細胞干重，溫度55°C，pH8.O，水解時間24h。水解完成后離心得到的上清液即為細胞水解液，備用。測定水解液總氮含量為3g/L，向3L發(fā)酵罐中加入水解液730mL，加入Na2HP0415g/L和KH2P044g/Lj^K970mL，121。C滅菌15min，加入已滅菌的濃度為500g/L葡萄糖200mL，種子液100mL。此時培養(yǎng)基中總氮含量為1.lg/L，相當于常規(guī)培養(yǎng)基對應(yīng)的10g/L酵母粉的總氮含量，葡萄糖濃度為50g/L。將上述培養(yǎng)基和常規(guī)產(chǎn)丁二酸培養(yǎng)基在下述相同發(fā)酵條件下進行發(fā)酵實驗滅菌結(jié)束后接入5%的ActinobacillussuccinogenesNJ113(CGMCC1716)種子液，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，37"C發(fā)酵培養(yǎng)，C02通氣量為0.25vvm，用Na2C03控制發(fā)酵液的pH為6.8，發(fā)酵培養(yǎng)48h后，檢測發(fā)酵液中丁二酸含量。產(chǎn)丁二酸培養(yǎng)基的常規(guī)配方和本實施例配方，以及發(fā)酵結(jié)果的區(qū)別如表2所示表2不同培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表3中可見，利用廢棄細胞為氮源進行發(fā)酵可以使79.9%的氮源得以回收利用。下面對水解液用于發(fā)酵的可行性進行驗證。將備用的細胞進行超聲破碎，破碎條件如下150W功率下，冰浴，超聲處理至鏡檢無完整細胞，超聲破碎后離心得到的上清液即為細胞水解液。按實施例1中的方法測定總氮含量為3.5g/L，向3L發(fā)酵罐中加入457mL水解液，加入0.lg/LLNaC1，0.5g/LK2HP04和2g/LMgS04，1043mL水，121。C滅菌15min，加入已滅菌的濃度為500g/L葡萄糖400mL，種子液100mL。此時培養(yǎng)基中總氮含量為1.6g/L，相當于常規(guī)培養(yǎng)基對應(yīng)的15g/L酵母粉的總氮含量，葡萄糖濃度為100g/L。將上述培養(yǎng)基和常規(guī)產(chǎn)乳酸培養(yǎng)基在下述相同發(fā)酵條件下進行發(fā)酵實驗滅菌結(jié)束后接入5%的LactobacillusrhamnosusNRRLB445種子液，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，38。C發(fā)酵培養(yǎng)，N2通氣量為0.25vvm，用CaC03作為中和劑，發(fā)酵培養(yǎng)48h后，檢測發(fā)酵液中乳酸含量。產(chǎn)乳酸培養(yǎng)基的常規(guī)配方和本實施例配方，以及發(fā)酵結(jié)果的區(qū)別如表4所示表4利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例3本實施例在生物法制備丁二酸的過程中實現(xiàn)氮源的循環(huán)利用，并通過與少量酵母粉聯(lián)用提高廢棄細胞水解液作為氮源用于發(fā)酵制備丁二酸的能力。以10g/L酵母粉為氮源進行厭氧發(fā)酵制備丁二酸，菌種為ActinobacillussuccinogenesNJ113(CGMCC1716)，具體培養(yǎng)方法同實施例1。發(fā)酵結(jié)束后的廢棄細胞經(jīng)過沉降、生理鹽水洗滌后稱重并用凱式定氮法測定其總氮含量，備用。由實施例1可知，在利用廢棄細胞實現(xiàn)氮源循環(huán)時，廢棄細胞只能替代原發(fā)酵培養(yǎng)基中73.6%的氮源，即以細胞水解液作為氮源的發(fā)酵能力是有限的，將細胞水解液與少量氮源聯(lián)用后便能完全達到以10g/L酵母粉為氮源的發(fā)酵效果。將備用細胞進行酸水解，水解條件如下3MH^(V9(TC水解2h，離心得到上清液用NaC03溶液調(diào)節(jié)pH至中性后測定其總氮含量為3g/L。向5L發(fā)酵罐中加入水解所得的全部水解液1283mL，加入Na2HP0415g/L和KH2P044g/L，酵母粉3g/L，加水2467mL，121。C滅菌15min，加入已滅菌的濃度為500g/L葡萄糖1000mL，種子液250mL。此時培養(yǎng)基中總氮含量為1.lg/L，相當于常規(guī)培養(yǎng)基對應(yīng)的10g/L酵母粉的總氮含量，葡萄糖濃度為100g/L。將上述培養(yǎng)基和常規(guī)產(chǎn)丁二酸培養(yǎng)基在下述相同發(fā)酵條件下進行發(fā)酵實驗滅菌結(jié)束后接入5%的ActinobacillussuccinogenesNJ113(CGMCC1716)種子液，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，37"C發(fā)酵培養(yǎng)，C02通氣量為0.25vvm，用Na2C03控制發(fā)酵液的pH為6.8，發(fā)酵培養(yǎng)48h后，檢測發(fā)酵液中丁二酸含量。產(chǎn)丁二酸培養(yǎng)基的常規(guī)配方和本實施例配方，以及發(fā)酵結(jié)果的區(qū)別如表5所示表5不同培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表5可見，當廢細胞水解液補加3g/L酵母粉用于發(fā)酵時，丁二酸產(chǎn)量完全能夠達到以10g/L酵母粉為氮源時的丁二酸產(chǎn)量，可以使酵母粉用量減少70X，而發(fā)酵時間卻比常規(guī)培養(yǎng)基縮短了近24h，不僅降低了培養(yǎng)基原料成本，更減小了發(fā)酵過程中水、電、氣的消耗，降低了生產(chǎn)成本，更加環(huán)保、節(jié)能。實施例4本實施例在生物法制備乙醇的過程中實現(xiàn)氮源的循環(huán)利用。首先以5g/L酵母粉為氮源進行厭氧發(fā)酵制備乙醇，菌種為PichiastipitisCBS5776具體培養(yǎng)方法按照《生物加工過程》，2008，6(6):1924中提供的培養(yǎng)方法，發(fā)酵結(jié)束后的廢棄細胞經(jīng)過沉淀、純水洗滌后稱重并按實施例1中的方法測定其總氮含量，備用。表6單批發(fā)酵制備乙醇中總氮的回收情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表6中可見，利用廢棄細胞為氮源進行發(fā)酵可以使88.0%的氮源得以回收利用。下面對水解液用于發(fā)酵的可行性進行驗證。將備用的細胞進行鹽溶法水解，水解條件如下將酵母細胞配成6%的菌懸液，加入lg/100mLNaCl和6g/100mL無水乙醇，50。C水浴24h后離心得到的上清液即為細胞水解液。測得水解液總氮含量為3.5g/L，向5L發(fā)酵罐中加入細胞水解液500mL，加水2475mL，12rC滅菌15min，加入已滅菌的濃度為500g/L葡萄糖350mL，種子液175mL。此時培養(yǎng)基中總氮含量為0.5g/L，相當于常規(guī)培養(yǎng)基對應(yīng)的5g/L酵母粉的總氮含量，葡萄糖濃度為50g/L。將上述培養(yǎng)基和常規(guī)產(chǎn)乙醇培養(yǎng)基在下述相同發(fā)酵條件下進行發(fā)酵實驗滅菌結(jié)束后接入5%的PichiastipitisCBS5776種子液，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，35t:發(fā)酵培養(yǎng)，用濃度為2N的KOH溶液控制發(fā)酵液的pH為6.0，發(fā)酵培養(yǎng)24h后，檢測發(fā)酵液中乙醇含量。產(chǎn)乙醇培養(yǎng)基的常規(guī)配方和本實施例配方，以及發(fā)酵結(jié)果的區(qū)別如表7所示表7利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的結(jié)果氮源碳源、滅菌條件等乙醇(g/L)常規(guī)培養(yǎng)基酵母粉5g/L，總氮含量0.5g/L相同43.7實施例培養(yǎng)基細胞水解液，總氮含量0.5g/L相同46.0權(quán)利要求一種利用微生物發(fā)酵廢棄細胞實現(xiàn)氮源循環(huán)利用的方法，其特征在于包括以下步驟(1)廢棄細胞的預(yù)處理；(2)細胞水解液的制備；(3)將細胞水解液作為氮源配制成微生物發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的廢棄細胞是發(fā)酵工業(yè)中利用微生物進行發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后的菌體細胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的廢棄細胞包括發(fā)酵制備乳酸、丁二酸、乙醇所得的廢棄細胞。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)是指將發(fā)酵液采用包括過濾、沉降、沉淀或離心處理后，經(jīng)過生理鹽水或純水洗滌后得到預(yù)處理后的廢棄細胞。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)是指采用包括超聲破碎、鹽溶、酶水解或酸水解制得細胞破碎液后，再經(jīng)離心得到上清液。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的步驟(3)是指根據(jù)微生物發(fā)酵所需的總氮含量加入與之總氮含量相等的細胞水解液，再進行微生物發(fā)酵生產(chǎn)。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的步驟(3)還可以包括將細胞水解液與其他營養(yǎng)物質(zhì)聯(lián)用步驟，即以細胞水解液實現(xiàn)氮源循環(huán)利用的能力達到極限時，選擇與少量酵母粉、玉米漿、豆粕粉等其他現(xiàn)有的所有可用于作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源聯(lián)合使用。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用微生物發(fā)酵廢棄細胞實現(xiàn)氮源循環(huán)利用的方法，包括以下步驟(1)廢棄細胞的預(yù)處理；(2)細胞水解液的制備；(3)將細胞水解液作為氮源配制成微生物發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)。通過本發(fā)明提供的利用發(fā)酵廢棄細胞制得的細胞水解液作為氮源進行微生物的發(fā)酵生產(chǎn)，不僅可以減少酵母粉、蛋白胨等昂貴氮源的使用量，并能實現(xiàn)發(fā)酵過程中氮源的循環(huán)利用，既降低了產(chǎn)品生產(chǎn)成本又減輕了廢棄物處理的負擔，達到了綠色、環(huán)保、節(jié)能的社會效益，本發(fā)明技術(shù)方案有效可行。文檔編號C12R1/01GK101748162SQ20101010176公開日2010年6月23日申請日期2010年1月26日優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日發(fā)明者姜岷,歐陽平凱,白雪飛,陳可泉,韋萍,馬江峰申請人:南京工業(yè)大學(xué)