專利名稱：酶法制備低過敏原海蝦基料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)加工領(lǐng)域和食品安全領(lǐng)域，更具體的說，是涉及一種酶法制備低過敏原海蝦基料的方法。

背景技術(shù)：
近年來食品安全問題受到越來越多的人的重視，過敏疾病的發(fā)病率越來越高，全世界約有30％-40％的人們患有各種各樣的過敏疾病，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，過敏疾病被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)定為當(dāng)今世界性的重大衛(wèi)生問題之一。在西方發(fā)達(dá)國家，有2.5％的成年人和6％-8％的兒童會(huì)對(duì)某些食品過敏。美國有600萬-700萬的過敏患者，每年平均有100-125例因食品過敏而致死的病例。在這些引起過敏的食品中，海產(chǎn)品是其中重要的一類。中國疾病控制中心營養(yǎng)與食品安全所調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在15-24歲年齡段的健康人群中，約有6％的人曾患有食品過敏疾病。有關(guān)食用或加工海產(chǎn)品導(dǎo)致過敏的報(bào)道層出不窮。
在聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的八大類引起過敏的食物之中，蝦與蟹等甲殼類動(dòng)物及其制品是重要的一類。近年來國內(nèi)外有關(guān)食源性蝦過敏的報(bào)道屢見不鮮。食物過敏反應(yīng)的臨床表現(xiàn)包括呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肌肉和骨骼等不同形式的臨床癥狀，如蕁麻疹、皰疹樣皮炎、口腔過敏綜合癥、腸病綜合癥、哮喘及過敏性鼻炎等。嚴(yán)重的食物過敏可導(dǎo)致過敏性休克，現(xiàn)已成為過敏反應(yīng)中危及生命的主要原因。由于食物過敏癥的發(fā)生始于嬰幼兒期，而且對(duì)某些食物的過敏是終生不變的，食物過敏會(huì)嚴(yán)重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量。因此開發(fā)低過敏性蝦產(chǎn)品對(duì)于保證蝦產(chǎn)品的安全性、擴(kuò)大其市場普及和提高水產(chǎn)品的利用價(jià)值都極其重要，是食品安全領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。
蝦的過敏原有多種，其中對(duì)于海蝦過敏原的研究較多。Hoffman等人首先分離并研究了海蝦過敏原的部分性質(zhì)。研究結(jié)果表明海蝦類過敏原分子量為38kDa，是等電點(diǎn)為4.5左右的糖蛋白，糖基的含量在4.0％左右。不久在生海蝦中又提取出過敏原蛋白質(zhì)Antigen I，分子量為21kDa，由兩條多肽鏈組成的二聚體結(jié)構(gòu)。印度Sunil Nagpal研究發(fā)現(xiàn)過敏原Sa-I和Sa-II，此外還發(fā)現(xiàn)一種TRNA(Sa-III)具有致敏性，但是不是過敏原還有待于進(jìn)一步的研究證明。國外研究者從Penaeus indicus、Penaeus aztecus、Metapenaeus ensist和Parapenaeus fissures等4種海蝦中分別純化出相對(duì)分子量為36kDa的原肌球蛋白，并證實(shí)了其為海蝦的主要過敏原，同時(shí)人們也發(fā)現(xiàn)，antergen-II、Antigen-I、Sa-I和Sa-II與原肌球蛋白有著很大的同源性，認(rèn)為它們均為原肌球蛋白加工處理后的不同產(chǎn)物。現(xiàn)已證實(shí)從海蝦中分離出的原肌球蛋白是蝦的主要過敏原(Pen a 1)，分子量為36kDa，占煮后蝦粗提液可溶性蛋白的20％，含糖約2.9％。根據(jù)國際免疫學(xué)學(xué)會(huì)過敏原專業(yè)術(shù)語的要求，將這種過敏原定名為Pen a 1。Nagpal等人從O anaeus indicus中發(fā)現(xiàn)另外一種海蝦類過敏原，其分子量在34kDa左右；有研究者發(fā)現(xiàn)tRNA是另一種蝦類的過敏原，但是其他的研究者沒有證實(shí)獲得這種過敏原。目前人們認(rèn)為Pen a 1是蝦中普遍存在的一種主要過敏原。我國青島海洋大學(xué)也從凡納濱對(duì)蝦、克氏螯蝦、口蝦蛄幾種不同亞目蝦中提取海蝦的主要過敏原，王曉雯等人也對(duì)中國對(duì)蝦的主要過敏原進(jìn)行了研究，在初步分離的蛋白質(zhì)組分中分子量36kDa的蛋白含量較高，用海蝦過敏者血清及陽性血清池鑒定中國對(duì)蝦主要過敏原，鑒定36kDa的蛋白為主要過敏原。
近年來，隨著過敏原研究的進(jìn)一步深入，國外和我國臺(tái)灣報(bào)道，海蝦中除了主要過敏原Pen a 1外，白蝦和紅蝦還存在分子量分別為29kDa和39kDa的過敏原。2004年我國學(xué)者賴荷等在中國羅氏蝦的研究中發(fā)現(xiàn)其粗提液的電泳圖上存在12條致敏條帶，其主要的致敏組分分布于大分子區(qū)段，分子量分別為78.2、66.2、46.5、37.8kDa，這四條帶與過敏性疾病患者血清特異性IgE呈陽性反應(yīng)，反應(yīng)率在100％-56％。1990年Morgan研究證明，蝦中至少存在13種過敏原蛋白質(zhì)，分子量范圍在16-166kDa，其中包括Pen a1，利用免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證明大于82％的蝦過敏個(gè)體對(duì)36kDa分子量的蛋白質(zhì)有過敏性反應(yīng)，其它蛋白質(zhì)也有反應(yīng)，但反應(yīng)均低于50％。2008年在張華等人對(duì)刀額新對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn)其蝦粗提蛋白約有20條可辨蛋白帶，分子量在12.1kDa-105.6kDa之間，其中7條為過敏原條帶，分子量為36kDa、46.2kDa、60kDa、64.8kDa、68kDa、78kDa和88.5kDa。另外還有21.6kDa的蛋白被個(gè)別患者的血清識(shí)別，其中4條過敏蛋白條帶反應(yīng)率高，為主要過敏組分，分子量分別為36kDa、46.2kDa、60kDa、68kDa。
在酶法消減海蝦過敏原蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，大部分的食物過敏原是蛋白質(zhì)，在一定條件下，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生水解。蛋白酶能夠?qū)ξr過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，其作用分為兩個(gè)方面一是改變抗原決定簇的三級(jí)結(jié)構(gòu)，或者斷裂一些化學(xué)鍵使之失去原有的活性，從而降低其過敏性。二是斷裂酰胺鍵，破壞過敏原的抗原表位，從而降低過敏原的免疫活性。通過篩選出高效專一性的酶對(duì)過敏原進(jìn)行定向酶解，控制和優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，可以有效的降低過敏原。日本學(xué)者Kuniyoshi S等人利用蛋白酶水解蝦蝦過敏原，發(fā)現(xiàn)蝦過敏原對(duì)酶解較為敏感。經(jīng)trypsin、α-chymotrypsin、protease等三種蛋白酶處理的龍蝦過敏原，部分或全部喪失了致敏性，但經(jīng)酶處理后可產(chǎn)生苦肽，降低蛋白質(zhì)的質(zhì)量，食用口感差。
目前，利用酶法消減海蝦過敏原蛋白還都處于研究階段，沒有在產(chǎn)業(yè)上運(yùn)用的先例。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種利用木瓜蛋白酶水解海蝦蛋白過敏原，制備味道鮮美無苦味的水解產(chǎn)物，形成低過敏原或無過敏原的海蝦基料，為所有人群提供一種蝦味食品添加物的方法。
本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種酶法制備低過敏原海蝦基料的方法，其特征在于，包括下述步驟 (1)將新鮮海蝦蝦肉，按照每10-25g蝦肉加水100g將蝦肉與水搗碎制成蝦肉漿； (2)將蝦肉漿加熱到60℃并保溫，之后在蝦肉漿中加入木瓜蛋白酶水解，水解條件為pH值為6.5，木瓜蛋白酶與底物的質(zhì)量比為1∶100，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為3小時(shí)；水解結(jié)束后，調(diào)整水解液的pH值為7.0，然后，80℃滅酶10分鐘得到木瓜蛋白酶水解物； (3)按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食鹽和0.3g淀粉的比例在木瓜蛋白酶水解物中添加食鹽和淀粉，混勻后，在60-70℃條件下進(jìn)行真空濃縮至固形物含量大于60％(即100g濃縮物中含有60g固形物)得到海蝦基料；或者，按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食鹽的比例在木瓜蛋白酶水解物中添加食鹽，混勻后，進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥至含水量小于5％得到海蝦基料。
所述噴霧干燥的條件為進(jìn)風(fēng)溫度為180-190℃，排風(fēng)溫度為75-80℃，進(jìn)料溫度為60℃。
海蝦可以為凡納濱對(duì)蝦(南美白對(duì)蝦)、中國明對(duì)蝦、刀額新對(duì)蝦(基圍蝦)、蝦蛄(皮皮蝦)中的任一種。
本發(fā)明具有下述技術(shù)效果 本發(fā)明采用木瓜蛋白酶水解海蝦蛋白，能夠消除過敏原，得到的低過敏原或無過敏原海蝦基料味道鮮美無苦味。通過本發(fā)明的方法直接水解蝦肉或海蝦蛋白制備水解產(chǎn)物，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中無明顯過敏反應(yīng)；通過ELISA檢測(cè)，其過敏者血清的抗原抗體反應(yīng)的OD值與正常人血清的抗原抗體反應(yīng)的OD值的最大值無顯著差異。將水解物通過濃縮制備膏狀海蝦基料，或經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥的方法制備粉狀海蝦基料，可添加到其他食品中制備蝦味食品的添加物。該制品可適用于所有人群，包括海蝦過敏的人群。本方法能夠在產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用。

具體實(shí)施例方式 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明詳細(xì)說明。
實(shí)施例1 1、蝦肉漿制備 將新鮮凡納濱對(duì)蝦清洗干凈，去頭去皮得到蝦肉，按每10g蝦肉加水100g，通過高速組織搗碎機(jī)制成蝦肉漿。
2、木瓜蛋白酶水解蝦肉漿并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過敏反應(yīng)情況 (1)水解物制備 將制成的蝦肉漿加熱至60℃并保溫，利用木瓜蛋白酶水解蝦肉漿的條件為，按照木瓜蛋白酶與底物的質(zhì)量比為1∶100的比例加入木瓜蛋白酶，在pH6.5，溫度60℃的條件下水解3小時(shí)。水解過程中維持所設(shè)定的pH值不變。水解結(jié)束后，用氫氧化鈉溶液調(diào)整水解液的pH值為7.0，然后80℃滅酶10min得到木瓜蛋白酶水解物。
(2)過敏反應(yīng)檢測(cè) ①木瓜蛋白酶水解物致敏豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn) 用上述木瓜蛋白酶水解物進(jìn)行豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。
表1豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表1可以發(fā)現(xiàn)作為陽性對(duì)照組致敏和激發(fā)均為未水解的蝦蛋白，豚鼠死亡率為100％。本實(shí)施例得到的木瓜蛋白酶水解物對(duì)用未水解的蝦蛋白和水解的蝦蛋白致敏豚鼠激發(fā)后豚鼠均正常，無死亡。
豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)中所用水解蝦蛋白經(jīng)ELISA檢測(cè)后的數(shù)值為木瓜蛋白酶水解物與海蝦過敏者血清反應(yīng)的OD值為0.047，該值在正常人血清反應(yīng)的值范圍內(nèi)(正常人血清反應(yīng)值的范圍為0.3-0.5之間)。
②致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮試驗(yàn) 致敏豚鼠，200～350g，♀♂均可。用卵白蛋白等致敏。注射致敏原3～5周后，豚鼠被致敏，可供實(shí)驗(yàn)用。
實(shí)驗(yàn)觀察取致敏豚鼠，放血處死，取出回腸一段，按離體器官裝置進(jìn) 行描記(儀器設(shè)備用BL-420F生物信號(hào)實(shí)時(shí)采集分析系統(tǒng))。待基線穩(wěn)定后，進(jìn)行抗原攻擊。觀察、記錄并比較各組的腸收縮幅度。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，收縮力變化率(％)＝(處理后的腸平滑肌收縮力-處理前的腸平滑肌收縮力)/處理前的腸平滑肌收縮力×100％。
根據(jù)腸管收縮反應(yīng)判斷過敏反應(yīng)的強(qiáng)度，結(jié)果見表2。
表2
與0.1％蝦蛋白組比較，*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01 由表2可以看出本實(shí)施例的木瓜蛋白酶水解物的致敏腸管收縮反應(yīng)與蝦蛋白相比具有顯著差異。
3、低過敏原的膏狀海蝦基料制作 將步驟2所獲得的木瓜蛋白酶水解物，按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食鹽，0.3g淀粉，混勻后，在60-70℃條件下進(jìn)行真空濃縮，濃縮至固形物含量大于60％，可獲得膏狀海蝦基料。
實(shí)施例2 1.將新鮮凡納濱對(duì)蝦清洗干凈，去頭去皮得到蝦肉，按每15g蝦肉加水100g，通過高速組織搗碎機(jī)制成蝦肉漿。
2、木瓜蛋白酶水解蝦肉漿并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過敏反應(yīng)情況 (1)水解物制備 制備條件同實(shí)施例1。
(2)過敏反應(yīng)檢測(cè) ①全身免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果同表1。
②致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮試驗(yàn)結(jié)果見表2。
豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)中所用水解蝦蛋白經(jīng)ELISA檢測(cè)后的數(shù)值為木瓜蛋白酶水解物與海蝦過敏者血清反應(yīng)的OD值為0.054，該值接近正常人血清反應(yīng)的最大值(正常人血清反應(yīng)值的范圍為0.3-0.5之間)，與最大值相比無顯著差異。
3、低過敏原的膏狀海蝦基料制作 將步驟2所獲得的木瓜蛋白酶水解物，按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食鹽，0.3g淀粉，混勻后，在60-70℃條件下進(jìn)行真空濃縮，濃縮至固形物含量大于60％，可獲得膏狀海蝦基料。
實(shí)施例3 1.將新鮮凡納濱對(duì)蝦清洗干凈，去頭去皮得到蝦肉，按每25g蝦肉加水100g，通過高速組織搗碎機(jī)制成蝦肉漿。
2、木瓜蛋白酶水解蝦肉漿并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過敏反應(yīng)情況 (1)水解物制備 制備條件同實(shí)施例1 (2)過敏反應(yīng)檢測(cè) ①全身免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果同表1。
②致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮試驗(yàn)結(jié)果見表2。
豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)中所用水解蝦蛋白經(jīng)ELISA檢測(cè)后的數(shù)值為木瓜蛋白酶水解物與海蝦過敏者血清反應(yīng)的OD值為0.057，該值接近正常人血清反應(yīng)的最大值(正常人血清反應(yīng)值的范圍為0.3-0.5之間)，與最大值相比無顯著差異。
3、低過敏原的膏狀海蝦基料制作 將步驟2所獲得的木瓜蛋白酶水解物，按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食鹽，0.3g淀粉，混勻后，在60-70℃條件下進(jìn)行真空濃縮，濃縮至固形物含量大于60％，可獲得膏狀海蝦基料。
實(shí)施例4 木瓜蛋白酶水解物的制作方法及檢測(cè)方法同實(shí)施例1。將所獲得的木瓜蛋白酶水解物按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食鹽，食鹽溶解后，在進(jìn)風(fēng)溫度為180-190℃，排風(fēng)溫度為75-80℃，進(jìn)料溫度為60℃的條件下進(jìn)行噴霧干燥，控制水分含量小于5％得到粉狀海蝦基料。
實(shí)施例5 木瓜蛋白酶水解物的制作方法及檢測(cè)方法同實(shí)施例1。將所獲得的木瓜蛋白酶水解物按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食鹽，食鹽溶解后，采用真空冷凍干燥方法，干燥到水分含量小于5％得到粉狀海蝦基料。
權(quán)利要求
1.一種酶法制備低過敏原海蝦基料的方法，其特征在于，包括下述步驟
(1)將新鮮海蝦蝦肉，按照每10-25g蝦肉加水100g將蝦肉與水搗碎制成蝦肉漿；
(2)將蝦肉漿加熱到60℃并保溫，之后在蝦肉漿中加入木瓜蛋白酶水解，水解條件為pH值為6.5，木瓜蛋白酶與底物的質(zhì)量比為1∶100，水解溫度為60℃，水解時(shí)間為3小時(shí)；水解結(jié)束后，調(diào)整水解液的pH值為7.0，然后，80℃滅酶10分鐘得到木瓜蛋白酶水解物；
(3)按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食鹽和0.3g淀粉的比例在木瓜蛋白酶水解物中添加食鹽和淀粉，混勻后，在60-70℃條件下進(jìn)行真空濃縮至固形物含量大于60％得到海蝦基料；或者，按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食鹽的比例在木瓜蛋白酶水解物中添加食鹽，混勻后，進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥至含水量小于5％得到海蝦基料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法制備低過敏原海蝦基料的方法，其特征在于，所述噴霧干燥的條件為進(jìn)風(fēng)溫度為180-190℃，排風(fēng)溫度為75-80℃，進(jìn)料溫度為60℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酶法制備低過敏原海蝦基料的方法，旨在提供一種利用木瓜蛋白酶水解海蝦蛋白過敏原，制備味道鮮美無苦味的水解產(chǎn)物，形成低過敏原或無過敏原的海蝦基料，為所有人群提供一種蝦味食品添加物的方法。將新鮮海蝦蝦肉，按照每10-25g蝦肉加水100g將蝦肉與水搗碎制成蝦肉漿；將蝦肉漿加熱到60℃并保溫，之后在蝦肉漿中加入木瓜蛋白酶水解；按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食鹽和0.3g淀粉，混勻后，在60-70℃條件下進(jìn)行真空濃縮至固形物含量大于60％得到海蝦基料；或者，按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食鹽，混勻后，進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥至含水量小于5％得到海蝦基料。
文檔編號(hào)A23L1/223GK101756147SQ20101010241
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者胡志和, 吳海明, 王麗娟, 龐廣昌, 陳慶森 申請(qǐng)人:天津商業(yè)大學(xué)