專利名稱：一種水稻香味基因及其功能標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻香味基因及其功能標(biāo)記的開發(fā)。
背景技術(shù)：
香稻由于其獨(dú)特的香味特性而備受人們的歡迎，而且香米在市場上的價(jià)格也都遠(yuǎn) 遠(yuǎn)高于非香稻米，因此香稻育種已成為現(xiàn)代水稻育種的重要內(nèi)容之一，明確香味遺傳的分 子生物學(xué)機(jī)理有利于新品種的選育。 到目前為止，水稻香味基因研究取得了較大的進(jìn)展，許多學(xué)者對水稻香味基因進(jìn) 行了遺傳分析及基因定位。Ahn et al. (1992)首先利用限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記將控制 香味的隱性基因定位在第八染色體上，與RFLP標(biāo)記RG28的遺傳距離為4. 5cM。 Lorieux et al. (1996)利用RFLP、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、序列標(biāo)記位點(diǎn)以及同工酶等4種標(biāo)記，結(jié)合氣相 色譜對揮發(fā)性物質(zhì)2AP的測定，將香味基因定位在第八染色體上RFLP標(biāo)記RG1和RG28之 間。Jin et al. (1995-1996)以CT9993/KDML105衍生的F2分離群體為研究材料，用RAPD引 物擴(kuò)增出一個(gè)與香味基因緊密連鎖的產(chǎn)物，經(jīng)NcoI酶切后發(fā)展了 RFLP探針jas500，然后對 F2分離群體進(jìn)行檢測，證明K匿L105的香味遺傳受一對隱性基因控制并將控制香味的基因 aro定位在第八染色體上。Dong et al. (2001)利用RFLP分子標(biāo)記以及初級三體對Delia 和三個(gè)日本地方香稻品種Kabashiko、 Shiroikichi和Henroyori進(jìn)行了遺傳分析和基因 定位，認(rèn)為這四個(gè)品種的香味基因等位且均由隱性單基因控制，并將其定位于第八染色體 上。Wanchana etal. (2005)主要通過簡單序列重復(fù)區(qū)間標(biāo)記和細(xì)菌人工染色體克隆的方 法，將香味基因fgr定位在第八染色體上遺傳距離為2. 9cM的兩個(gè)簡單重復(fù)序列標(biāo)記RM223 和RM342之間，并進(jìn)一步找到fgr基因附近的標(biāo)記10L03FW和CP04133，兩標(biāo)記間170kb的 DNA序列包含有22個(gè)開放閱讀框，同時(shí)對序列的分析顯示出了香稻與非香稻的差異就在編 碼甜菜堿醛脫氫酶的一個(gè)基因上。Bradbury et al. (2005)對fgr區(qū)域的17個(gè)基因進(jìn)行 序列測定發(fā)現(xiàn)控制甜菜堿醛脫氫酶(BADH2)的基因Badh2在香和非香水稻品種中有明顯區(qū) 別，其中香稻品種在Badh2的編碼區(qū)第7外顯子出現(xiàn)了 8bp的缺失和3個(gè)SNPs，結(jié)果導(dǎo)致 翻譯提前終止，產(chǎn)生無功能的截?cái)郆ADH2蛋白。據(jù)此，Bradbury等預(yù)測Badh2基因可能是 控制香味性狀的基因。Chen et al. (2006)也通過定位群體，將fgr定位于標(biāo)記L02和標(biāo) 記L06間69Kb區(qū)域，同時(shí)fgr區(qū)域的序列分析顯示了三個(gè)候選基因，功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示，轉(zhuǎn)Badh2的轉(zhuǎn)基因植株2AP含量較對照有了明顯的降低，而其余兩個(gè)候選基因在轉(zhuǎn)基因 前后香味性狀基本沒有改變，這表明只有Badh2基因和香味性狀有關(guān)。Chen et al. (2008) 還發(fā)現(xiàn)了 Badh2中的另外一個(gè)等位基因，即第2外顯子7bp的缺失，并將非香的Badh2轉(zhuǎn)化 到第2外顯子變異的香稻品種中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的2AP含量顯著下降，結(jié)果表明該位點(diǎn)的 缺失同樣導(dǎo)致水稻香味的產(chǎn)生。 與此同時(shí)，多個(gè)學(xué)者還對控制香味基因的不同位點(diǎn)進(jìn)行探索和研究。Bourgis et al. (2008)在badh2的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)MITE結(jié)構(gòu)，即12bp堿基的變化(8bp缺失和4bp插 入)，在所有研究的香型的水稻品種中都表現(xiàn)為缺失，以此認(rèn)為香味基因啟動子區(qū)域與水稻
3香味的產(chǎn)生可能存在一定的關(guān)系。同時(shí)，F(xiàn)itzgerald et al. (2008)也在對464份材料的分析之后得出相似結(jié)論，并不是所有的香稻材料都包含Badh2編碼區(qū)第7外顯子上的缺失，認(rèn)為可能存在新的非等位香味基因或等位香味基因內(nèi)的不同位點(diǎn)發(fā)生了變異。許多學(xué)者也根據(jù)現(xiàn)有的水稻香味基因開發(fā)了相應(yīng)的分子標(biāo)記，但是一些香味水稻雖然有香味，但其香味基因序列并非與上述研究保持一致，這將為新香味基因的發(fā)掘與利用提供了機(jī)會。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于獲得了一種新的水稻香味基因特異序列，并設(shè)計(jì)提供了該水稻香味基因的功能標(biāo)記的技術(shù)方案。 所述的一種水稻香味基因，其特征在于所述的水稻香味基因與第八染色體上的編碼甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2等位，所述的水稻香味基因與正常的Badh2相比在第4和5外顯子之間發(fā)生了 803bp的缺失，該缺失堿基位于基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子下游1628bp與2430bp之間，803bp缺失堿基對應(yīng)于第4外顯子90bp，第4內(nèi)含子694bp和第5外顯子19bp。
所述的水稻香味基因特異序列設(shè)計(jì)香味基因功能標(biāo)記FMbadh2-E4-5 ，所述的FMbadh2-E4-5正反引物序列如下 正向引物序列(5' -3')為TGCTGGATGCTTTGAGTA， 反向引物序列(5' -3')為GTTTAGCACACCTGAAGGAAGACCA。 所述的香味基因功能標(biāo)記，其特征在于可用于對特定香稻材料香味基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。 通過該方法，可以有目標(biāo)的將香味基因轉(zhuǎn)到非香味水稻品種中去，極大地促進(jìn)了新優(yōu)質(zhì)香稻品種的培育。


圖1為本發(fā)明中水稻香味基因結(jié)構(gòu)和3個(gè)功能位點(diǎn)示意圖； 圖2為利用3個(gè)功能標(biāo)記對4個(gè)非香稻及22個(gè)香稻材料基因型檢測結(jié)果。 圖1中第2及第7外顯子為已報(bào)道的功能位點(diǎn)；第4與和第5外顯子間803bp缺
失為本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的功能位點(diǎn)，涵蓋第4外顯子90bp、第4內(nèi)含子694bp和第5外顯子19bp
的缺失。
圖2中1-4 :非香稻材料，分別為日本晴，秋光，南京11 ， IR36 ;5_12 :經(jīng)
FMbadh2-E2 (A)檢測在第2外顯子7bp缺失的香稻材料，依次為蘇香粳1號，武香粳14，香粳糯，卡雞糯，白毛香粳，黑香粳，密香糯，花殼香粳；13-20 :經(jīng)FMbadh2-E4-5(B)檢測在第4、5外顯子803bp缺失的香稻材料，依次為渠坤香糯，在妙香糯，花香糯，上思小香糯，紫香糯，洋縣紅香寸，無芒香糯，本地香糯；21-26 :經(jīng)FMbadh2-E7 (C)檢測在第7外顯子8bp缺失的香稻材料，依次為Basmati370，Della，香玉1號，蘇御糯，豫南香98，香米。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例1 :一種水稻香味基因新缺失位點(diǎn)的獲得方法 1.地方香稻品種在妙香糯葉片基因組DNA的提取
DNA提取方法主要參考盧揚(yáng)江和鄭康樂(1992)的方法，具體方法如下將新鮮葉
片2-3cm左右放入研缽，加入400iiL DNA提取液，研磨，直至葉片磨碎，再加入400 y L DNA
提取液，混勻；加入500 ii L氯仿萃取液，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻；11000rpm/min離心1分
鐘至清晰分相；吸取上清液400ii L轉(zhuǎn)入新的做好標(biāo)記的1. 5mL離心管中；加入800ii L預(yù)冷
的無水乙醇，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻，12000rpm/min離心3分鐘至沉淀附于離心管底部，
棄上清液。75%乙醇洗滌沉淀，將1. 5mL微量離心管倒置于平鋪于桌上的紙上，自然干燥；
最后加入100 ii L的1/10TE緩沖液溶解沉淀。 2.在妙香糯種子及葉片香味鑒定方法如下 1)咀嚼法將成熟糙米放入口中咀嚼來判別香味的有無。 2)氫氧化鉀法將2g左右供試材料的綠葉剪成碎片，放入小錐形瓶中，在每個(gè)裝
有樣品的瓶內(nèi)加10ml左右17g/L氫氧化鉀溶液，立即蓋上瓶蓋，置于室溫下10分鐘，然后
逐一打開培養(yǎng)皿，立即用鼻嗅之，鑒別植株葉片香味。 3.利用2個(gè)功能標(biāo)記對香稻材料進(jìn)行基因型檢測 通過采用兩個(gè)功能標(biāo)記(Shi et a1，2008) 功能標(biāo)記FMbadh2-E2 : 正向引物序列(5' -3')為CCTCTGCTTCTGCCTCTGAT
反向引物序列(5' -3')為GATTGCGCGGAGGTACTTG
功能標(biāo)記FMbadh2-E7 : 正向引物序列(5' -3')為GGTTGCATTTACTGGGAGTT
反向引物序列(5' -3')為CAGTGAAACAGGCTGTCAAG 對在秒香糯基因組DNA進(jìn)行香味基因基因型檢測，發(fā)現(xiàn)在妙香糯在兩個(gè)功能位點(diǎn)都沒有發(fā)生缺失，這表明控制該材料香味控制基因可能屬于一個(gè)新的非等位香味基因或在相同基因內(nèi)不同位點(diǎn)變異而導(dǎo)致香味的等位基因。
4.香味基因等位性驗(yàn)證 首先將在妙香糯與非香材料日本晴雜交，其巳葉片表現(xiàn)出非香，而與香稻品種中香糯(秈稻，來源于中國河北，香味基因第7外顯子存在8bp缺失)雜交，其雜交種子、巳植株葉片及巳所產(chǎn)生的種子都表現(xiàn)出香味，這表明控制在妙香糯的香味基因與中香糯香味基因等位，都是由于第八染色體上編碼甜菜堿醛脫氫酶基因失活而導(dǎo)致的香味。
5.在妙香糯香味基因測序分析 首先采用9對測序引物如表1 (引物序列信息參考Shi et al， 2008)對在妙香糯
badh2進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 2%瓊脂糖凝膠上電泳；使用TIANGEN公司所生產(chǎn)的DNA
回收試劑盒回收DNA片段，并連接到pGEM-T Easy Vector (Promega)，并轉(zhuǎn)化到DH5 a感受
態(tài)細(xì)胞后篩選陽性單克隆菌落，在含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基上37t:培養(yǎng)12小時(shí)，將
菌液送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。 表1本實(shí)驗(yàn)所采用的香味基因測序引物引物名稱TE向引物反向引物PCR產(chǎn)物(bp)1)引ffl文獻(xiàn)
Radh2PGTCTCTCCTCCAACATGCTCGTGGTGTCAGGTGTGGAGTC995Shi et al，2008
Badh2P2CCGAAGTCCGTACCAACTGCCAATCAGCCA丁GCTTCCAAC972Shiet al,2008
Badh2P3GTGCGTATCCTCTGTTCTGGCAAGCGTCTCTAGTCTAGCC855Shi et al，200S
Badh2P4-5CTGAGCTGGCTAGACTAGAGCATAGCAAGTGGCATGTACC1778This study
Badh2P6GGTTGGTCTTCCTTCAGGTGGTCC'n'CCTAACTGCCTTCC926Shiet al，2008
Badh2P7CCAGACGAGCAGGA丁GCAAGCATGGTCAGGAGCAAGAAGC984Shi et al，2008
Badh2P8GTGGCAAGGAAGGCAGTTAGGCAATAAGGCTTGGAAGGAC912Shi et al,2008
Badh2P9TTTCAGCTTCTTGCTCCTGACAGTT八ATCTCTGGC八TCGC1023Shiet al，2畫
Badh2P10G G CC AACG ATAC丁C AGTG AGCCGGTCA丁CAGCTAAC丁丁CC聽Shi et al，200S"PCR產(chǎn)物以日本晴為擴(kuò)增模板 1) PCR的反應(yīng)體系及程序具體方法如下 反應(yīng)體系含10 X PCR buffer 1. 0 ii L (含25,1L—^gCl》，2mmolL—MNTPsO. 8 ii L， 5iimolL—1正、反引物各1. Oil L，Taq DNA聚合酶(2Uii L—"O. 25ii L，模板DNA 1. Oil L，ddH20 4. 95ii L。反應(yīng)程序?yàn)?4。C模板預(yù)變性2min ;94。C變性45s， 55。C復(fù)性45s， 72。C延伸lmin， 30個(gè)循環(huán)；最后72t:下延伸10min。
2) DNA擴(kuò)增片段分離方法如下 1. 2%瓊脂糖凝膠上恒壓電泳分離，然后通過EB染色檢測結(jié)果。
3)載體連接反應(yīng)體系如下 線性載體DNA約20ng，外源DNA片斷約200ng， 10 X連接緩沖液2 y L， T4DNA連接 酶(5U ii L—0 1 ii L，力卩ddH20至20 ii L。
4)載體轉(zhuǎn)化方法如下 a.取一管低溫保存的約50 ii L感受態(tài)細(xì)胞，冰浴中溶化，加入10 y L連接產(chǎn)物，輕 微搖蕩混勻，冰浴30min ; b. 42C熱擊30s后迅速冰浴5分鐘，加入800 y L液體LB培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng) lh，使菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)； c.將上述菌液3000rpm/min離心5min，棄上清液剩下約100 y L左右的混合液涂 布于LB固體培養(yǎng)基上(涂有氨芐，IPTG及X-gal混合液)，37t:培養(yǎng)12-16h，然后挑取陽 性克隆用于測序分析，并設(shè)置陰性對照。
6.在妙香糯香味基因序列分析 采用Contig-E鄧ress軟件對9個(gè)測序片段進(jìn)行組裝拼接。 拼接后完整的香味基因組序列與日本晴Badh2序列及其mRNA序列進(jìn)行比 對。其中日本晴Badh2序列弓l自網(wǎng)站www, gramene. org, Badh2的mRNA序列檢索號為 EU770322 (htto:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez)。序列比對分析在網(wǎng)站htto:〃 www, ebi. ac. uk/Tools/emboss/align/index, html上進(jìn)行。 通過對在妙香糯badh2序列與日本晴Badh2序列及其mRNA序列進(jìn)行比對分析。 在香味基因內(nèi)部發(fā)現(xiàn)803bp的缺失的現(xiàn)象(距離基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)1628bp與2430bp之 間)，該缺失位點(diǎn)位于Badh2第4和第5外顯子之間(對應(yīng)于第4外顯子90bp，第4內(nèi)含子 694bp，第5外顯子19bp)(如圖1)，以此認(rèn)為Badh2內(nèi)部803bp的缺失是導(dǎo)致香味的產(chǎn)生直 接原因。
6
實(shí)施例2 :水稻香味基因功能標(biāo)記的開發(fā)及對部分香稻材料香味基因的檢測1.供試材料
本實(shí)驗(yàn)所研究的香稻材料列于表2中，包括22份香稻材料及4份非香稻材料c表2本實(shí)驗(yàn)所研究的4份非香稻及22份香稻材料
DNA編號.水稻品種~香/非香1來源
1
2
4
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
日本晴秋光南京11IR26
蘇香粳1武香粳1香粳糯卡雞糯白毛香粳
密香粳
花殼香粳
渠坤香糯
在妙香糯
花香糯
上思小香糯
紫香糯
洋縣紅香寸
無芒香糯
本地香糯
Basmati370
Delia
香玉1
蘇御糯
豫南香98
香米
++++++++++++++++++++++
日本日本
南京/中國IRRI
江蘇/中國
江蘇/中國
江蘇/中國
安徽/中國
江蘇/中國
江蘇/中國
中國
中國
廣西/中國廣西/中國中國
廣西/中國廣西/中國山西/中國中國
浙江/中國巴基斯坦
江蘇/中國
江蘇/中國河南/中國
廣西/中國
秈秈
注_表示非香材料；+表示香味材料
2. 22份香稻及4份非香稻材料香味鑒定香味鑒定方法咀嚼法和氫氧化鉀法同實(shí)施例1所述。
結(jié)果表明，22份香稻種子及葉片都表現(xiàn)出香味，4分非香稻材料都無香味:
3. DNA提取，PCR擴(kuò)增分析
DNA提取方法及PCR擴(kuò)增分析如實(shí)施例1所示。
4. 香味基因功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)及合成
功能標(biāo)記FMbadh2-E4-5采用Primer Premier 5. 0軟件進(jìn)行合成。FMbadh2-E4-5正反引物序列如下正向引物序列(5' -3')為TGCTGGATGCTTTGAGTA，反向引物序列(5' -3')為GTTTAGCACACCTGAAGGAAGACCA。
5.功能標(biāo)記對香/非香型水稻品種的基因型檢測 結(jié)合Shi et al， 2008報(bào)道的兩個(gè)功能標(biāo)記，利用上述3個(gè)功能標(biāo)記，對22份香稻材料及4份非香稻材料香味基因內(nèi)部特異性位點(diǎn)進(jìn)行了檢測。其中在4個(gè)非香稻品種中3個(gè)位點(diǎn)都沒有發(fā)生缺失；在22份香稻材料，F(xiàn)Mbadh2-E2、FMbadh2-E4-5和FMbadh2_E7等3個(gè)標(biāo)記分別有8、8和6個(gè)材料在其特異性位點(diǎn)發(fā)生了缺失，結(jié)果表明利用功能標(biāo)記可以很好地區(qū)分香與非香的水稻品種，可用于水稻香味基因標(biāo)記輔助選擇(圖2)。
權(quán)利要求
一種水稻香味基因，其特征在于所述的水稻香味基因與第八染色體上的編碼甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2等位，所述的水稻香味基因與正常的Badh2相比在第4和5外顯子之間發(fā)生了803bp的缺失，該缺失堿基位于基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子下游1628bp與2430bp之間，803bp缺失堿基對應(yīng)于第4外顯子90bp，第4內(nèi)含子694bp和第5外顯子19bp。
2. 根據(jù)上述的水稻香味基因特異序列設(shè)計(jì)香味基因功能標(biāo)記FMbadh2-E4-5，所述的 FMbadh2-E4-5正反引物序列如下正向引物序列(5' -3')為TGCTGGATGCTTTGAGTA， 反向引物序列(5' -3')為GTTTAGCACACCTGAAGGAAGACCA。
3. 如權(quán)利要求2所述的香味基因功能標(biāo)記，其特征在于可用于對特定香稻材料香味基 因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。
全文摘要
一種水稻香味基因及其功能標(biāo)記，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于所述的水稻香味基因與第八染色體上的編碼甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2等位，所述的水稻香味基因與正常的Badh2相比在第4和5外顯子之間發(fā)生了803bp的缺失，該缺失堿基位于基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子下游1628bp與2430bp之間，803bp缺失堿基對應(yīng)于第4外顯子90bp，第4內(nèi)含子694bp和第5外顯子19bp。并根據(jù)水稻香味基因設(shè)計(jì)香味基因功能標(biāo)記FMbadh2-E4-5。通過該方法，可以有目標(biāo)的將香味基因轉(zhuǎn)到非香味水稻品種中去，極大地促進(jìn)了新優(yōu)質(zhì)香稻品種的培育。
文檔編號C12N15/53GK101736018SQ20101010360
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者唐傲, 唐紹清, 焦桂愛, 羅炬, 胡培松, 邵高能, 魏詳進(jìn) 申請人:中國水稻研究所