專利名稱：高血壓易感基因單核苷酸多態(tài)性位點rs2236055的檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和醫(yī)學領域。更具體地涉及人線粒體融合基因2(Mfn2 gene)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點 rs2236055 及其 與原發(fā)性高血壓相關性的檢測。本發(fā)明還涉及檢測這個SNP位點的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性高血壓(essential hypertension, EH)是一種多因素、多基因疾病，由環(huán) 境與遺傳因素共同致病的常見而多發(fā)的心血管病癥，對人類健康造成了極大的影響。隨著 分子醫(yī)學的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的高血壓相關基因已經(jīng)有150余種，但是EH的發(fā)病機制仍 然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預防問題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環(huán)境共 同作用的結(jié)果，血壓的變化30%-60%歸因于遺傳。由于環(huán)境因素是可以控制和確認的，而 對高血壓遺傳學因素卻是固定不變的。因此，對可變因素的控制，如對高血壓危險因素的 預防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發(fā)病，但是對固定不變的遺傳因素的認識不 足卻在一定程度上嚴重影響著對高血壓發(fā)病、診斷和治療。因此對高血壓遺傳學的研究十 分必要(王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態(tài)性[J].高血壓雜志， 2001,9 259-264)。近二十余年來，有關高血壓治療的研究更多地集中在對血壓的控制和對靶器官的 保護，并已取得突飛猛進的發(fā)展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對人類內(nèi) 源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究內(nèi)源性抗高血壓機制是今后高血壓防治研究 的主要方向之一，具有重要的研究價值和應用前景，如果通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗高血壓機制治 療高血壓病，將會促進我國生物醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，并為我國每年節(jié)省巨大的醫(yī)療費用。目前所發(fā)現(xiàn)的高血壓相關基因，歸結(jié)起來可以概括為促高血壓基因和抗高血壓 基因，Mfn2屬于后者。Mfn2的前身是我國學者陳光慧等[Chen GH, Zhang CH, Zhu YQ, et al. Expression of a novel gene related to hypertension[J]. NatlMed J China,1997, 77 =823-828.]于1997年對培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY)大 鼠的血管平滑肌細胞進行差異顯示，克隆出一個新基因——增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene, HSG)。它包含有4160bp的堿基對，共編碼661個氨基酸(NM_014874， GeneBank Access U41803)。后經(jīng)一系列體內(nèi)、體外實驗發(fā)現(xiàn)[Chen KH,Guo ΧΜ,Dalong Ma, et al. Dysregulationof HSG triggers vascular proliferative disorders[J]. Nature Cell Biol，2004，6，872-883. ]，HSG可以明顯地抑制Ras-Raf蛋白_絲裂素活化蛋白激酶 基因表達，并且可以激活抗癌基因的表達，有效地阻遏細胞周期和抑制多種細胞的增殖，且 這種抑制作用是通過細胞凋亡的方式實現(xiàn)的。因此HSG基因是原發(fā)性高血壓的候選基因 之一，后經(jīng)基因功能研究表明，HSG基因參與線粒體融合，因此正式命名為線粒體融合基因 2 (mitofusin 2，Mfn2)但是目前對Mfn2與EH的研究較少，沒有證實rs2236055與EH相關 性的報道。
綜上所述，為了最終實現(xiàn)治療高血壓，本領域迫切需要尋求原發(fā)性高血壓易感基 因，并開發(fā)檢測原發(fā)性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的檢測高血壓易感基因的方法及檢測試劑盒。具體而言，本發(fā)明提供了一種高血壓易感性基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方 法，它包括檢測Mfn2基因rs2236055位點的基因型；rs2236055帶有A基因型的個體，獲得 所述基因與原發(fā)性高血壓的相關性。本發(fā)明檢測結(jié)果顯示，攜有上述基因的個體其高血壓的易感性顯著高于普通人 群。本發(fā)明所述的rs2236055位于Mfn2的第2號內(nèi)含子區(qū)域中。更好的，所述的 rs2236055位于片段重疊群NT_021937. 18的6575958位置。本發(fā)明提供了一種檢測Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性基因型的 方法，該方法包括以下步驟(a)用Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的特異性引物擴增樣品的基因組DNA，得到擴 增產(chǎn)物；(b)檢測擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點rs2236055的基因型。上述方法中，擴增Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的引物的序列如SEQ ID NO :2和 SEQ ID NO 3所示。檢測rs2236055的探針的序列如SEQ ID NO 4或者SEQ ID NO 5所不。相應的，本發(fā)明提供了一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，它包括特異性擴增 Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的引物，其序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:3所示。它還可 以含有與rs2236055結(jié)合的探針，其序列如SEQ ID NO 4或者SEQ ID N0:5所示。該試劑 盒還可以包括PCR反應所用的常規(guī)緩沖液、dNTP和說明書，等等。在本發(fā)明中，提供了一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的Mfn2基因rs2236055位點的基因型，以此判斷該個體患高血壓的發(fā) 病風險是否高于普通人群。在另一優(yōu)選例中，所述的差異是選自下列的單核苷酸多態(tài)性rs2236055 位于 Mfn2，內(nèi)含子 2 中(片段重疊群 contig :NT_021937. 18 位置 6579628 A/G)其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號rs2236055位置基于SEQ ID NO :1。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在Mfn2基因的單核苷酸多態(tài) 性的方法，包括步驟a)用Mfn2基因內(nèi)含子2特異性引物擴增樣品的基因組DNA，得到擴增產(chǎn)物；和b)檢測擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點rs2236055的基因型rs2236055 位于 Mfn2，內(nèi)含子 2 中(片段重疊群 contig :NT_021937. 18 位置 6579628 A/G)；其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號引物1基于SEQ ID NO 2 ；引物2基于SEQ ID NO 3 ；探針1基于SEQ ID NO 4 ；探針2基于SEQ ID NO 5 ；擴增產(chǎn)物基于SEQ ID NO 6。在另一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是rs2236055位于Mfn2，內(nèi)含子2中(片 段重疊群 contig :NT_021937. 18 位置 6579628 A/G)其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號rs2236055位置基于SEQ ID NO :1。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下列的試劑Mfn2內(nèi)含子2特異性引 物、與單核苷酸多態(tài)性位點rs2236055結(jié)合的探針。其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號引物1基于SEQ ID NO 2 ；引物2基于SEQ ID NO 3 ；探針1基于SEQ ID NO 4 ；探針2基于SEQ ID NO 5 ；擴增產(chǎn)物基于SEQ ID NO 6。在另一優(yōu)選例中，所述的Mfn2內(nèi)含子2單核苷酸多態(tài)性位點rs2236055 位于 Mfn2，內(nèi)含子 2 中(片段重疊群 contig :NT_021937. 18 位置 6579628 A/G)其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號rs2236055位置基于SEQ ID NO :1。本發(fā)明經(jīng)過多年研究，首次發(fā)現(xiàn)和證明了 Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點 rs2236055(位于 Mfn2 內(nèi)含子 2 中，片段重疊群 contig :NT_021937. 18 位置 6579628A/G) 與高血壓密切相關，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點rs2236055位 于Mfn2，內(nèi)含子2中(片段重疊群contig :NT_021937. 18位置6579628 A/G)基因型的改 變將導致高血壓的發(fā)病風險升高，其中關聯(lián)研究結(jié)果顯示，在Mfn2基因rs2236055G — A在 病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P < 0. 05)，該SNP多態(tài)性可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位 點。在此基礎上完成了本發(fā)明。Mfn2基因的詳細序列可參見登錄號為rs2236055的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。本發(fā)明人對Mfn2基因中的內(nèi)含子2中(片段重疊群contig :NT_021937. 18位置 6579628)區(qū)域進行了測序。Mfn2基因rs2236055位點的多態(tài)性可直接用于高血壓的個性化治療。在使用本發(fā) 明Mfn2基因rs2236055位點的多態(tài)性時，還可同時使用其他治療高血壓的藥劑。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效的本發(fā)明Mfn2蛋白以及藥學 上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、 乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形 式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑 和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠 囊在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天0. 1微克/千克體重-約 10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的Mfn2蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于普哺 乳動物，其中該安全有效劑量通常至少約0. 1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過 約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0. 1微克/千克體重_約100毫克/千克體重。當 然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)。檢測Mfn2基因的rs2236055的基因型也可用于診斷高血壓。檢測可以針對基因 組DNA，也可針對Mfn2基因的擴增片段。Mfn2基因的rs2236055的基因型可用已有的技術(shù)
5如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。本發(fā)明提供了一種檢測原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測個體的線粒體融 合基因2(Mfn2)/增殖抑制基因(HSG)rs2236055位點的基因型，rs2236055帶有A基因型 的個體，高血壓的易感性顯著高于普通人群。本發(fā)明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒 含有擴增Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的引物。利用本發(fā)明檢測rs2236055位點的基因型， 方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供了一個簡捷的新途徑。


圖1顯示了 Mfn2 rs2236055位于Mfn2，內(nèi)含子2中(片段重疊群contig NT_021937. 18位置6579628 A/G)的一種SNP基因型的測序結(jié)果。圖2是766號樣品基因組DNA抽提的檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。粚嶒炇沂謨?New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1熒光PCR檢測一、實驗材料7900HT熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，聚合酶鏈反應液(TaqManEXPress Master Mix)由美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)定制合成。二、引物及探針設計與合成以MFn2基因內(nèi)含子2的部分序列為模板，使用Primer ExpressTM 2. O軟件分析 TaqMan引物和探針位點，并由美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)定制合成。檢測用引物MFn2基因rs2236055上游引物序列MFn2基因rs2236055下游引物序列熒光探針MFn2 基因 rs2236055 熒光探針 1 :5MFn2 基因 rs2236055 熒光探針 2 5三、樣本檢測實驗共檢測918例高血壓病例和499例正常對照人群，每例收集血樣標本約2ml， 用酚/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結(jié)果用微量紫外/可見光分光光度計(INFINIGEN公司) 檢測。按如下表1的體系進行熒光PCR擴增，最后用SDS 2. 3掃描并聚類分析。表 15 ‘ -TGTGCTCTCCTGGACCTCTG-3‘ 5 ‘ -GAAGAGCCAGCACAGCAGAGA-3‘
-VIC-CAAGTCTCTTGAATG-TAMRA-3‘ -FAM-CAAGTCTCTTGGATG-TAMRA-3‘
四、型檢測結(jié)果所有樣本的基因組DNA符合檢測要求(260/280 > 1. 8，濃度> lOng/ul，如下圖所 示樣本766號的檢測結(jié)果)基因組DNA抽提的檢測結(jié)果如表2所示表2MFn2基因rs2236055位點基因型的檢測結(jié)果
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用做參考，就如同每一篇文獻被單獨引 用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可以 對本發(fā)明做各種改動或修改，這些形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例2用測序法檢測原發(fā)性高血壓易感基因MFn2基因的rs2236055位點。挑選上述高 血壓病例_對照組樣本各10例進行測序判斷rs2236055的基因型。一、實驗方法PCR測序引物仍采用上述熒光PCR用引物，擴增的產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序。測序的 儀器是ABI公司的3130x1遺傳分析儀，用sequence analysis 5. 2分析軟件進行分析，結(jié)果用chromas也可以查看。二、實驗結(jié)果最終，20例的測序結(jié)果與7900熒光PCR的基因型分析結(jié)果完全一致。三、MFn2基因rs2236055基因型和高血壓易感的關聯(lián)分析1^112基因^2236055在高血壓病人和對照中分布的比較采用1^0乂2檢驗.用 SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，檢測結(jié)果及SPSS軟件分析結(jié)果如表3所示。表權(quán)利要求
一種高血壓易感性基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其特征在于，它包括檢測Mfn2基因rs2236055位點的基因型；rs2236055帶有A基因型的個體，獲得所述基因與原發(fā)性高血壓的相關性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的rs2236055位于Mfn2的第2號內(nèi)含 子區(qū)域中。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的rs2236055位于片段重疊群 NT_021937. 18 的 6575958 位置。
4.一種檢測Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性基因型的方法，其特征在 于，該方法包括步驟(a)用Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的特異性引物擴增樣品的基因組DNA，得到擴增產(chǎn)物；(b)檢測擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點rs2236055的基因型。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，擴增Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的引物的 序列如 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，檢測rs2236055的探針的序列如SEQID NO: 4或者SEQ ID NO 5所示。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的rs2236055位于片段重疊群 NT_021937. 18 的 6575958 位置。
8.一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增Mfn2基因第2 號內(nèi)含子區(qū)域的引物，其序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:3所示。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，它還含有與rs2236055結(jié)合的探針，其序 列如 SEQ ID NO 4 或者 SEQ ID NO 5 所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學領域，涉及一種檢測原發(fā)性高血壓易感性的方法及其試劑盒。本發(fā)明提供了一種檢測原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測個體的線粒體融合基因2(Mfn2)/增殖抑制基因(HSG)rs2236055位點的基因型，rs2236055帶有A基因型的個體，高血壓的易感性顯著高于普通人群。本發(fā)明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴增Mfn2基因第2號內(nèi)含子區(qū)域的引物。利用本發(fā)明檢測rs2236055位點的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供了一個簡捷的新途徑。
文檔編號C12Q1/68GK101892298SQ201010103850
公開日2010年11月24日 申請日期2010年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月1日
發(fā)明者劉潔琳, 劉闊, 劉雅, 吳海, 李志忠, 李瑤, 柳景華, 樓煜清, 溫紹君, 王佐廣, 羅毅, 謝毅 申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院;復旦大學