專利名稱：用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，其特征在于，谷胱甘肽生產性 酵母的培養(yǎng)基內含有肌醇和煙酰胺，在加快谷胱甘肽生產性酵母的生長繁殖速度的同時， 增加菌體內谷胱甘肽積蓄量。
背景技術：
關于谷胱甘肽生產性酵母，自以前起，酵母(Saccharomyces)屬的生產率高，菌體 內積蓄量多的情況便為人們所知，據(jù)報告顯示，其中，酵母屬Cystinovolensis與其它具 代表性的谷胱甘肽生產性酵母——釀酒酵母和卡氏酵母——相比，具有生產率更高的菌種 特性(日本特愿昭52-8984)。還有報告顯示，遺傳基因引入技術可使釀酒酵母中谷胱甘 肽的積蓄量增加(日本特開平6-7075 。此外，通過向培養(yǎng)基內添加鋅離子，谷胱甘肽的 生成積蓄量將會增加(日本特開平11-92394)。此外，亦有報告顯示，挑選酵母屬酵母的 突然變異株，提高鋅離子的耐受性，這樣便可使谷胱甘肽的生成積蓄量增加(日本特愿平 1-115295)。無論哪項技術，都以增加酵母菌中谷胱甘肽的生成積蓄量，最終增加生產收率 為目的。然而，盡管添加鋅離子會產生其相應的效果，但需指出的是，培養(yǎng)基內鋅離子的濃 度梯度難以控制，此外，還可能產生種種問題，例如由于菌的不同，在高濃度鋅離子存在的 情況下，可能引起繁殖障礙等。雖然通過挑選突然變異株也有得到改觀的傾向，但不一定會 收到良好的效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明最重要的目的是提高谷胱甘肽產生菌的生長繁殖速度，進而延長菌的谷胱 甘肽合成活性半衰期，故而致力于培養(yǎng)基的改良。發(fā)明者知道，不論動物還是植物，正常細 胞培養(yǎng)中若有肌醇的存在，那么培養(yǎng)基的環(huán)境本身便可得到調節(jié)，從而保持對葡萄糖這種 養(yǎng)分的穩(wěn)定吸收，于是發(fā)明者嘗試向培養(yǎng)基內添加肌醇。此外，液態(tài)物質、細胞培養(yǎng)液狀態(tài) 下，混合液本身的穩(wěn)定性會對細胞的繁殖率產生巨大影響，發(fā)明者認為這是培養(yǎng)基內氧化 物的增加造成的。為此，發(fā)明者選出生物體內廣泛存在、能對電子的授受進行可逆性操作的 抗氧化物質作為最適宜添加進培養(yǎng)基內的物質，這就是煙酰胺。也就是說，本技術是以通過 向培養(yǎng)基內添加肌醇和煙酰胺，加快谷胱甘肽生成菌生長繁殖速度，進而延長谷胱甘肽合 成活性半衰期為特征的技術。通過利用本技術，可增加谷胱甘肽在細胞內的積蓄量，與鋅離 子添加技術、遺傳基因重組技術相比，在最終收率上，會得到同等甚至更高的生產率。培養(yǎng) 后的菌體可通過離心分離等方式收集，并用熱水提取。提取是指將收集到的菌體的濃度調 節(jié)至6 10%后，使其懸浮于95 100°C的熱水中，并保持1 10分鐘，然后再提取。基于上述目的，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物， 其特征在于，含有0. OlmM/IOOmL ImM/lOOmL的肌醇及0. OlmM/IOOmL ImM/lOOmL的煙 酰胺。在本發(fā)明前述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物中，含有等摩爾濃度的L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸作為合成谷胱甘肽的原料，其中，L-谷氨酸、L-半胱 氨酸和甘氨酸的濃度均為20 50mM/100mL。在本發(fā)明前述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物中，含有濃度為 10 25mM/100mL的硫酸鎂作為活性維持輔助劑。在本發(fā)明前述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物中，含有從D-葡 萄糖、D-果糖和D-麥芽糖中選出的至少一種物質作為碳源。在本發(fā)明前述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物中，上述碳源的濃 度為 5 15mM/100mL。在本發(fā)明前述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物中，肌醇含量為 0. 05mM/100mL 0. 5mM/100mL，煙酰胺含量為 0. 05mM/100mL 0. 5mM/100mL。在本發(fā)明前述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物中，谷胱甘肽生產 性酵母為酵母屬酵母。在本發(fā)明前述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物中，谷胱甘肽生 產性酵母為從假絲酵母(Candida)屬酵母、德巴利酵母(Debaryomyces)屬酵母、紅酵母 (Rhodotorula)屬酵母、球擬酵母菌(Torulopsis)屬酵母、漢遜酵母(Hansenula)屬酵 母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母、畢赤酵母(Pichia)屬酵母、克魯維酵母 (Kluyveromyces)屬酵母和法夫酵母(Wiaffia)屬酵母組成的菌群中選取的1種或2種以 上的酵母。利用本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，加快了谷胱甘 肽生產性酵母的生長繁殖速度，進一步延長了谷胱甘肽合成活性半衰期，增加了菌體內谷 胱甘肽積蓄量。
具體實施例方式下面通過實施例來具體說明本發(fā)明。首先，使用"Saccharomyces cystinovolens KNC-1，，、“釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae IF00021) ”、“卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensisY1068)，，這 3 種菌種。用麥芽糖培養(yǎng)基對它們進行初期培養(yǎng)后，為它們添加3種培養(yǎng)基，分別計算測量 其生長繁殖速度、菌體濃度、菌體內谷胱甘肽濃度、菌體外谷胱甘肽濃度、谷胱甘肽穩(wěn)定濃 度到達時間、基質中谷胱甘肽穩(wěn)定收率、谷胱甘肽穩(wěn)定濃度保持時間、谷胱甘肽合成活性半 衰期，并作比較。培養(yǎng)基中的L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸是由酵母菌生成的谷胱甘肽 的原料，添加D-葡萄糖作為菌體的碳源，還添加日本特開昭53-94089記述的硫酸鎂作為菌 生長繁殖的輔助劑。此外，作為原料添加的L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸必須為等摩爾 濃度，這樣得以生成谷胱甘肽。當然，為增加產量還可能提高各原料的濃度，但生產上最優(yōu) 選的濃度是實施例中列舉的比例。另外，硫酸鎂對該原料的相對濃度優(yōu)選1/3 1/2，選擇 1/3時，判斷葡萄糖選定為10/3會產生最佳效果，該結果如實施例1所示。此外，為對它們進行對比，先固定谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、硫酸鎂、葡萄糖的濃 度，然后改變肌醇、煙酰胺的添加量，其對比結果如實施例3 5所示。關于谷胱甘肽含量的測定，使用DTNB (BP 5,5- 二硫代雙硝基苯甲酸))，通過 比色法(chromogenic technique)測定，待測定穩(wěn)定濃度后算出各數(shù)值。關于合成活性，需自初期值起定時測定谷胱甘肽濃度，標注半衰減時間。谷胱甘肽在初期培養(yǎng)階段，因D-麥芽糖、糖蜜的作用而繁殖到2倍容量，在下一階 段添加硫酸鎂后，活性提高、繁殖到4倍容量。在最終階段，添加適量L-谷氨酸、L-半胱氨 酸、甘氨酸這三種原料的同時，添加適量D-葡萄糖、肌醇、煙酰胺，谷胱甘肽可繁殖到6倍容 量。酵母菌發(fā)酵產生的谷胱甘肽被高氯酸鈉、高氯酸鉀高氯酸鎂或高氯酸鈣這些添加劑氯 化后，使用高速離心機提取澄清部分，向罐內投進ODS樹脂，進行攪拌，讓其產生吸附作用， 然后用淡鹽酸萃取，溫風干燥后即得到所需谷胱甘肽。實施例13種培養(yǎng)基的組成如下。(數(shù)值單位mM/100ml)表權利要求
1.用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，其特征在于，含有0.OlmM/lOOmL ImM/IOOmL 的肌醇及 0. OlmM/IOOmL ImM/lOOmL 的煙酰胺。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，其特征在 于，含有等摩爾濃度的L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸作為合成谷胱甘肽的原料，其中， L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的濃度均為20 50mM/100mL。
3.根據(jù)權利要求1所述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，其特征在 于，含有濃度為10 25m M/100mL的硫酸鎂作為活性維持輔助劑。
4.根據(jù)權利要求1所述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，其特征在 于，含有從D-葡萄糖、D-果糖和D-麥芽糖中選出的至少一種物質作為碳源。
5.根據(jù)權利要求4所述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，其特征在 于，上述碳源的濃度為5 15mM/100mL。
6.根據(jù)權利要求1所述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，其特 征在于，肌醇含量為0. 05mM/100mL 0. 5mM/IOOmL,煙酰胺含量為0. 05mM/100mL 0. 5mM/100mL。
7.根據(jù)權利要求1 6中任一項所述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合 物，其特征在于，谷胱甘肽生產性酵母為酵母屬酵母。
8.根據(jù)權利要求1 6中任一項所述的用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合 物，其特征在于，谷胱甘肽生產性酵母為從假絲酵母屬酵母、德巴利酵母屬酵母、紅酵母屬 酵母、球擬酵母菌屬酵母、漢遜酵母屬酵母、裂殖酵母屬酵母、畢赤酵母屬酵母、克魯維酵母 屬酵母和法夫酵母屬酵母組成的菌群中選取的1種或2種以上的酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于培養(yǎng)谷胱甘肽生產性酵母的培養(yǎng)基組合物，其含有0.01mM/100mL～1mM/100mL的肌醇及0.01mM/100mL～1mM/100mL的煙酰胺，在加快谷胱甘肽生產性酵母的生長繁殖速度的同時，增加菌體內谷胱甘肽積蓄量。
文檔編號C12R1/86GK102134556SQ201010104159
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月27日 優(yōu)先權日2010年1月27日
發(fā)明者川崎究 申請人:重慶凱林制藥有限公司