專利名稱：一種將蘿卜染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘藍(lán)的培育方法，具體地說是將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法， 屬于甘藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交利用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
遠(yuǎn)源雜交是指親緣關(guān)系疏遠(yuǎn)的類型之間的雜交，包括種間、屬間和科間的雜交。它 可以創(chuàng)造現(xiàn)有植物所沒有的特異類型或新種質(zhì)，因此遠(yuǎn)緣雜交已成為解決植物基因資源匱 乏的重要手段，在植物遺傳育種中有廣泛的應(yīng)用，如在小麥(Bris B.等，1983;Kozub NA 等，2004)、棉花(Vmh B I等，1999)、油菜(劉忠松等，2001 ；陳樹忠等，2000)、黃瓜(Chen J F等，1997)等多種作物上通過種間或?qū)匍g雜交進(jìn)行品種改良，獲得了豐富的遺傳變異類 型。眾所周知，蘿卜屬(Raphanus)植物中存在著豐富的抗源和許多對蕓薹屬 (Brassica)栽培作物有益的性狀，如細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因和恢復(fù)基因、對軟腐病、黑腐病、 和根腫病等多種病害的抗性基因，蘿卜屬植物還具有抗線蟲病、抗旱、抗寒、耐酸堿等優(yōu)異 特性(Delourme等，1998 ；Dolstra, 1982 ；Baukloh, 1976)。因此，蘿卜屬是蕓薹屬及其它十 字花科近緣屬植物進(jìn)行遺傳改良和創(chuàng)造新的變異的重要供體資源。國際上對蕓薹屬與蘿
卜屬的遠(yuǎn)緣雜交研究始于上世紀(jì)二十年代，至今已開展了八十多年，其中甘藍(lán)(Brassica oleracea)和白菜(Brassica campestris)與蘿卜的遠(yuǎn)緣雜交研究不少，但多數(shù)研究表明 蘿卜與蕓薹雜交獲得雜種非常困難，雖然有的獲得了蘿卜蕓薹、蘿卜甘藍(lán)或蘿卜黑芥等雜 種，但雜種高度不育，難以繼續(xù)回交。為了克服蕓薹屬植物與蘿卜雜交不親和性，許多學(xué)者 嘗試用不同的技術(shù)和方法，如植株嫁接后雜交、混合花粉授粉、化學(xué)藥物處理等，但這些技 術(shù)和方法對蕓薹屬植物與蘿卜的遠(yuǎn)緣雜交幾乎沒有效果(李旭峰等，19%)。后來組織培 養(yǎng)技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)推動了這一領(lǐng)域的發(fā)展，最成功的是通過原生質(zhì)體融合技術(shù)成 功地將蘿卜的細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因轉(zhuǎn)入蕓薹屬蔬菜，獲得甘藍(lán)和白菜的細(xì)胞質(zhì)雄性不育材 料。與有性雜交相比，原生質(zhì)體融合技術(shù)雖然可以在一定程度上克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，獲 得雜種，但在原生質(zhì)體培養(yǎng)的技術(shù)成熟度、在體細(xì)胞雜種的遺傳穩(wěn)定性、育性(特別是遠(yuǎn)緣 體細(xì)胞雜交中)以及非對稱雜交中染色體消失的隨機(jī)性導(dǎo)致無法有針對地轉(zhuǎn)移特定的性 狀等方面都存在著亟待研究和解決的問題(宋尚偉等，2007)?；谏鲜銮闆r，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍在積極尋求一種能有效地克服甘藍(lán)與蘿卜間的 遠(yuǎn)緣雜交障礙，將蘿卜染色體或基因?qū)氲礁仕{(lán)的途徑。本發(fā)明擬采用一種新的思路和方 法，避開甘藍(lán)與蘿卜之間的直接雜交，而利用從國外引進(jìn)的附加蘿卜d染色體的甘藍(lán)型油 菜與甘藍(lán)進(jìn)行有性雜交，從而將蘿卜d染色體從甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)移至甘藍(lán)，使甘藍(lán)獲得蘿卜d 染色體所攜帶的優(yōu)良性狀(如抗線蟲病等)，為甘藍(lán)遺傳育種創(chuàng)造更多的遺傳變異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種可以克服蘿卜與甘藍(lán)之間的遠(yuǎn)緣雜交障礙，通過有性雜交將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法。本發(fā)明的發(fā)明思路為為了克服甘藍(lán)與蘿卜之間的遠(yuǎn)緣雜交障礙，發(fā)明人利用甘 藍(lán)型油菜-蘿卜d染色體附加系(CGMCC No. 3596)作為甘藍(lán)與蘿卜之間的橋梁，通過該附加 系與甘藍(lán)的有性雜交，將蘿卜d染色體導(dǎo)入到甘藍(lán)，同時(shí)利用細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)，選擇 含蘿卜d染色體的甘藍(lán)植株，創(chuàng)建攜帶蘿卜d染色體的甘藍(lán)新種質(zhì)。這種方法以甘藍(lán)型油 菜作為蘿卜d染色體的載體，通過它與甘藍(lán)的雜交將蘿卜d染色體傳遞給甘藍(lán)，避免了甘藍(lán) 與蘿卜之間的直接雜交，這種蕓薹屬內(nèi)的雜交比蕓薹屬與蘿卜屬之間的屬間雜交更容易成 功。在后代材料的鑒定上，利用細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)，可以快速、高效地選擇目標(biāo)材料。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明采用如下具體技術(shù)方案所述的獲得攜帶有蘿卜d染色體的甘藍(lán)的方法包括下述步驟(1)利用甘藍(lán)型油菜-蘿卜d染色體附加系為母本，甘藍(lán)為父本進(jìn)行人工蕾期雜交 授粉，結(jié)合子房培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)育一代；(2)利用RAPD分子標(biāo)記檢測和細(xì)胞鏡檢鑒定轉(zhuǎn)育一代，選擇含有蘿卜d染色體且 根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為四的單株，與甘藍(lán)進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，結(jié)合子房培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)育二代；(3)利用RAPD分子標(biāo)記檢測，選擇含有蘿卜d染色體的植株，再利用細(xì)胞鏡檢，選 擇含有蘿卜d染色體且根尖細(xì)胞染色體數(shù)目接近20，推薦選擇19 四范圍內(nèi)的，植株形態(tài) 接近甘藍(lán)的單株，繼續(xù)與甘藍(lán)進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，結(jié)合子房培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)育三代；(4)利用RAPD分子標(biāo)記檢測，選擇含有蘿卜d染色體的植株，再利用細(xì)胞鏡檢，選 擇含有蘿卜d染色體且根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為19或20，植株形態(tài)似甘藍(lán)的單株，即為攜帶 有蘿卜d染色體的甘藍(lán)。甘藍(lán)植株形態(tài)及生物學(xué)特性均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知內(nèi)容，在此不贅述，本發(fā)明 最終產(chǎn)品經(jīng)分子鑒定含有蘿卜d染色體及具備甘藍(lán)形態(tài)和生物學(xué)特性。所述甘藍(lán)型油菜-蘿卜d染色體附加系于2010年1月27日，保藏于中國微生物 保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為 CGMCC No. ；3596，分類命名油菜 brassica napus。上述RAPD分子標(biāo)記檢測為利用蘿卜d染色體的RAPD標(biāo)記0PF07_36;3bp、 0PG19-488bp中的一個(gè)檢測，有上述標(biāo)記中任意一個(gè)的植株為含有蘿卜d染色體植株。 0PF07和0PG19的引物序列如下所示。0PF07-363bp :5， -CCGATATCCC-3， ；0PG19_488bp :5， -GTCAGGGCAA-3，。所述細(xì)胞鏡檢是利用顯微鏡鏡檢待檢植株根尖細(xì)胞染色體數(shù)目。本發(fā)明所涉及的甘藍(lán)型油菜-蘿卜d染色體附加系CGMCC No. 3596直接來源為 德國聯(lián)邦栽培作物育種研究中心；原始來源由德國聯(lián)邦栽培作物育種研究中心自行培 育。父本甘藍(lán)的直接來源和原始來源均為北京市農(nóng)林科學(xué)院自行培育。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果與傳統(tǒng)的甘藍(lán)和蘿卜直接遠(yuǎn)緣雜交方法相比，采用附加蘿卜d染色體的甘藍(lán)型油 菜與甘藍(lán)進(jìn)行雜交，以甘藍(lán)型油菜-蘿卜d染色體附加系(基因組AACC+RR)作為甘藍(lán)(基 因組CC)與蘿卜(基因組RR)的中間橋梁，并且只有1對蘿卜染色體與甘藍(lán)基因組整合，可 以避免用整個(gè)蘿卜基因組雜交引起的更多遺傳累贅，因此這種方法不但可以克服甘藍(lán)與蘿 卜之間的遠(yuǎn)緣雜交障礙，還可以提高目標(biāo)性狀的轉(zhuǎn)移和選擇效率。這種方法為甘藍(lán)與蘿卜
4的遠(yuǎn)緣雜交提供了一條新的思路與方法。


圖1為本發(fā)明技術(shù)流程圖；圖2為RAPD分子標(biāo)記0PF07_363bp檢測結(jié)果，泳道從左到右分別是Marker，2個(gè) 附加系親本，2個(gè)甘藍(lán)親本，3個(gè)轉(zhuǎn)育一代，Marker，1個(gè)轉(zhuǎn)育一代，1個(gè)轉(zhuǎn)育二代，其余為轉(zhuǎn)育 三代；圖3為RAPD分子標(biāo)記0PG19_488bp檢測結(jié)果，泳道從左到右分別是Marker，附加 系親本，3個(gè)甘藍(lán)親本，3個(gè)轉(zhuǎn)育一代，1個(gè)轉(zhuǎn)育二代，1個(gè)轉(zhuǎn)育三代，Marker,其余為轉(zhuǎn)育三 代。
具體實(shí)施例方式如圖1所示，具體步驟如下1、雜交授粉與子房培養(yǎng)以甘藍(lán)型油菜-蘿卜d染色體附加系為母本，甘藍(lán)(市售 可以購買得到，品種或純合的自交系都可以應(yīng)用于本發(fā)明，無具體限定)為父本進(jìn)行雜交 授粉。開花前2 3天，父母本花枝分別套袋隔離。母本蕾期去雄，取父本的花粉涂抹于母 本的柱頭上。取授粉后7 15天的子房進(jìn)行組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基為1/2MS+肌醇(10g/L) + 煙酸(100mg/L)+VB6(100mg/L)+VBl(lg/L)+IAA(l. 5mg/L) +蔗糖(50g/L)，pH= 5.8。培養(yǎng) 一個(gè)月左右，子房內(nèi)的種子基本成熟，得到轉(zhuǎn)育一代。2、轉(zhuǎn)育一代鑒定(1)利用蘿卜d染色體的RAPD標(biāo)記0PF07_363bp和0PG19_488bp中的一個(gè)檢測轉(zhuǎn) 育一代是否含有蘿卜d染色體，有上述標(biāo)記的植株為含有蘿卜d染色體。如圖2和圖3所
7J\ ο圖2為RAPD分子標(biāo)記0PF07_363bp檢測結(jié)果，泳道從左到右分別是Marker，2個(gè) 附加系親本，2個(gè)甘藍(lán)親本，3個(gè)轉(zhuǎn)育一代，Marker，1個(gè)轉(zhuǎn)育一代，1個(gè)轉(zhuǎn)育二代，其余為轉(zhuǎn)育 三代；圖3為RAPD分子標(biāo)記0PG19_488bp檢測結(jié)果，泳道從左到右分別是Marker，附加 系親本，3個(gè)甘藍(lán)親本，3個(gè)轉(zhuǎn)育一代，1個(gè)轉(zhuǎn)育二代，1個(gè)轉(zhuǎn)育三代，Marker,其余為轉(zhuǎn)育三 代。其中引物0PF07、OPG19的堿基序列分別如下所示，具體為5，-CCGATATCCC-3，， 5’ -GTCAGGGCAA-3’。轉(zhuǎn)育一代含有蘿卜d染色體。 RAPD分子標(biāo)記鑒定采用SDS法提取親本和雜種幼苗葉片DNA，用RAPD引物 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為16ng DNA, 0. 25mmol/L dNTP, 1 X Buffer, 0. IU Taq DNA 聚 合酶，2. 5mmol/L MgCL2，0. 4mmol/L 引物，終體積 8μ L。反應(yīng)循環(huán)為94 "C (2min)， 940C (30s)-360C (30s)_72°C (Imin)45 個(gè)循環(huán)，之后 72°C 10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物用 6% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測。(2)用顯微鏡鏡檢轉(zhuǎn)育一代植株的根尖細(xì)胞染色體數(shù)目，轉(zhuǎn)育一代的染色體數(shù)目 為29。染色體鏡檢方法先固定根尖，取2 3mm左右根尖于飽和對二氯苯溶液中避光處理4h，后轉(zhuǎn)入現(xiàn)配的卡諾固定液(無水乙醇冰醋酸以3 1混合)中固定3 Mh。取 固定后的根尖進(jìn)行解離，先用蒸餾水漂洗根尖2 3次，然后將根尖放入已預(yù)熱的lmol/L 鹽酸中60°C水浴6 8分鐘，再轉(zhuǎn)入蒸餾水中浸泡10分鐘以上。切取根尖用卡寶品紅染 液染色4 6分鐘，常規(guī)壓片后在OLYMPUS BH-2顯微鏡下鏡檢染色體。3、回交授粉與子房培養(yǎng)以鑒定篩選出的轉(zhuǎn)育一代為母本，甘藍(lán)為父本進(jìn)行回交 授粉。授粉方法與子房培養(yǎng)方法同步驟1，得到的種子為轉(zhuǎn)育二代。4、轉(zhuǎn)育二代鑒定同步驟2方法(1)，用分子標(biāo)記檢測轉(zhuǎn)育二代中是否含有蘿卜d 染色體。選擇帶蘿卜d染色體的轉(zhuǎn)育二代植株，用顯微鏡鏡檢根尖細(xì)胞染色體，從中選擇染 色體數(shù)目接近20、植株形態(tài)接近甘藍(lán)的植株。5、轉(zhuǎn)育二代回交與子房培養(yǎng)以鑒定篩選得到的轉(zhuǎn)育二代為母本，甘藍(lán)為父本繼 續(xù)回交授粉。授粉與子房培養(yǎng)方法同步驟1，得到轉(zhuǎn)育三代。6、轉(zhuǎn)育三代鑒定同第二步(1)方法，檢測轉(zhuǎn)育三代中是否含有蘿卜d染色體。選 擇帶蘿卜d染色體的轉(zhuǎn)育三代植株，用顯微鏡鏡檢根尖細(xì)胞染色體，從中選擇染色體數(shù)目 為19或20、植株形態(tài)似甘藍(lán)的植株，即為本發(fā)明所述攜帶有蘿卜d染色體的甘藍(lán)。經(jīng)本方法獲得的甘藍(lán)經(jīng)RAPD分子標(biāo)記鑒定含有蘿卜d染色體，并且具有甘藍(lán)的形 態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性。本發(fā)明通過簡單的方法克服了甘藍(lán)與蘿卜之間的遠(yuǎn)緣雜交障礙，提高 目標(biāo)性狀的轉(zhuǎn)移和選擇效率。本發(fā)明為甘藍(lán)與蘿卜的遠(yuǎn)緣雜交提供了一條新的思路與方 法，具有很好的市場前景。
權(quán)利要求
1.一種將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其特征在于，其是利用甘藍(lán)型油菜-蘿卜d染 色體附加系與甘藍(lán)進(jìn)行有性雜交，將蘿卜d染色體導(dǎo)入到甘藍(lán)，同時(shí)利用分子標(biāo)記檢測及 細(xì)胞鏡檢方法，選擇含蘿卜d染色體的甘藍(lán)植株，創(chuàng)建攜帶蘿卜d染色體的甘藍(lán)新種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其特征在于，所述甘藍(lán)型油 菜-蘿卜d染色體附加系保藏編號為CGMCC No. 3596。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其特征在于所述方法 包括下述步驟(1)利用甘藍(lán)型油菜-蘿卜d染色體附加系為母本，甘藍(lán)為父本進(jìn)行人工蕾期雜交授 粉，結(jié)合子房培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)育一代；(2)利用RAPD分子標(biāo)記檢測和細(xì)胞鏡檢鑒定轉(zhuǎn)育一代，選擇含有蘿卜d染色體且根尖 細(xì)胞染色體數(shù)目為四的單株，與甘藍(lán)進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，結(jié)合子房培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)育二代；(3)利用RAPD分子標(biāo)記檢測轉(zhuǎn)育二代，選擇含有蘿卜d染色體的植株，再利用細(xì)胞鏡 檢，選擇含有蘿卜d染色體且根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為19 四，形態(tài)學(xué)鑒定為甘藍(lán)的單株，繼 續(xù)與甘藍(lán)進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，結(jié)合子房培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)育三代；(4)利用RAPD分子標(biāo)記檢測轉(zhuǎn)育三代，選擇含有蘿卜d染色體的植株，再利用細(xì)胞鏡 檢，選擇含有蘿卜d染色體且根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為19或20，形態(tài)學(xué)鑒定為甘藍(lán)的單株，即 為攜帶有蘿卜d染色體的甘藍(lán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其特征在于，所述甘藍(lán)型油 菜-蘿卜d染色體附加系保藏編號為CGMCC No. 3596。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其特征在于，所述步驟 (1)子房培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為:l/2MS、10g/L肌醇、100mg/L煙酸、100mg/L VB6、lg/L VB 1、 1. 5mg/L IAA、50g/L 蔗糖，pH = 5. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其特征在于，所述RAPD 分子標(biāo)記檢測為利用蘿卜d染色體的RAPD標(biāo)記0PF07-36;3bp、0PG19_488bp中的一個(gè)檢 測，有上述標(biāo)記中任意一個(gè)的植株為含有蘿卜d染色體植株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其特征在于，所述RAPD分 子標(biāo)記0PF07、0PG19的引物序列如下所示0PF07 5' -CCGATATCCC-3‘ ；0PG19 5' -GTCAGGGCAA-3‘。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其特征在于，所述細(xì)胞鏡檢 是利用顯微鏡鏡檢待檢植株根尖細(xì)胞染色體數(shù)目。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將蘿卜d染色體導(dǎo)入甘藍(lán)的方法，其是通過甘藍(lán)型油菜-蘿卜d染色體附加系與甘藍(lán)進(jìn)行有性雜交，將蘿卜d染色體導(dǎo)入到甘藍(lán)，同時(shí)利用分子標(biāo)記檢測及細(xì)胞鏡檢方法，選擇含蘿卜d染色體的甘藍(lán)植株，創(chuàng)建攜帶蘿卜d染色體的甘藍(lán)新種質(zhì)。本發(fā)明以甘藍(lán)型油菜作為蘿卜d染色體的載體，通過它與甘藍(lán)的雜交將蘿卜d染色體傳遞給甘藍(lán)，避免了甘藍(lán)與蘿卜之間的直接雜交，這種蕓薹屬內(nèi)的雜交比蕓薹屬與蘿卜屬之間的屬間雜交更容易成功。并且只有1對蘿卜染色體與甘藍(lán)基因組整合，可以避免用整個(gè)蘿卜基因組雜交引起的更多遺傳累贅，因此還可以提高目標(biāo)性狀的轉(zhuǎn)移和選擇效率。這種方法為遠(yuǎn)緣雜交利用提供了一條新的思路。
文檔編號C12Q1/68GK102138515SQ20101010434
公開日2011年8月3日 申請日期2010年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月1日
發(fā)明者丁云花, 康俊根, 李倩, 李利軍, 簡元才 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院