專利名稱：：一種逆轉(zhuǎn)錄-多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測rna-snp的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種逆轉(zhuǎn)錄-多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測RNASNP的方法，特別是涉及到一種利用逆轉(zhuǎn)錄-多重?zé)晒馓结様U(kuò)增技術(shù)檢測孕婦母體血漿中胎兒RNA-SNP的方法。本方法通過提取母體血漿中胎兒游離核酸對其中的RNA-SNP進(jìn)行檢測，可用于檢測一類孕期中特異表達(dá)于胎盤的基因。
背景技術(shù)：
：多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MultiplexLigation-d印endentProbeAmplification,MLPA)是一種將探針雜交技術(shù)、核酸連接技術(shù)、PCR擴(kuò)增技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合并可相對定量的方法，具有特異性好、靈敏度高、高通量和可自動化分析的特,€。2002$，SchoutenJP^A(SchoutenJP,McElgunnCJ,WaaijerR,ZwijnenburgD,etal.Relativequantificationof40nucleicacidsequencesbymultiplexligation-dependentprobeamplification.NucleicAcidsRes2002；30(12):e57)對此方法首次進(jìn)行了描述。逆轉(zhuǎn)錄-多重?zé)晒馓结様U(kuò)增技術(shù)(ReverseTranscriptase-MLPA，RT-MLPA)是在MLPA技術(shù)上發(fā)展起來的，其原理是將制備的長型探針和短型探針同逆轉(zhuǎn)錄合成的目的基因cDNA序列雜交，雜交后短探針的5’-端和長探針的3’-端能夠通過連接酶連接成一條片段。不匹配的探針雜交后不能被連接酶連接。所有被連接而成的片段其序列都有共同的5’和3’末端，因此可以僅僅用一對引物在一個PCR體系中擴(kuò)增不同的目的基因序列。由于長型探針中間有填充序列，因此每組RT-MLPA探針可以擴(kuò)增出特定片段大小的一段序列，通過毛細(xì)管電泳的方法即可以分辨出不同的目的基因序列。2000年，Poon等人(PoonLL,LeungTN,LauTK,LoYM.PresenceoffetalRNAinmaternalplasma.ClinChem2000；46(11):1832-1834)發(fā)現(xiàn)了母血菜中存在胎兒游離_亥@|。2009$，Heung^A(MacyM.S.Heung,ShengnanJin,NancyB.Y.Tsui,ChunmingDing,etal.Placenta-DerivedFetalSpecificmRNAIsMoreReadilyDetectableinMaternalPlasmathaninWholeBlood.PLoSOne.2009；4(6):e5858)發(fā)現(xiàn)存在于孕婦血漿中的胎兒游離核酸比全血中的更穩(wěn)定，且隨著孕周期數(shù)的增加表達(dá)量增多，隨著胎兒的娩出后M小時而消失。目前認(rèn)為孕婦母體血漿中的胎兒游離核酸之所以能穩(wěn)定存在可能是由于合體滋養(yǎng)層微顆粒的保護(hù)而避免了血漿中RNA酶的消化作用，同時研究也發(fā)現(xiàn)胎盤是胎兒游離核酸的主要來源，并且來源于胎盤的RNA容易被檢測到。孕婦母體血漿中的一些胎兒游離RNA同性別無關(guān)，且母親自身無表達(dá)，如位于21號染色體上胎盤特異表達(dá)的PLAC4基因，位于17號染色體上的絨毛膜生長催乳激素CSHl和絨毛膜生長催乳樣激素CSHLl等。這些發(fā)現(xiàn)為檢測胎兒游離核酸中的基因mRNA序列上的單核苷酸多態(tài)性(RNA-SNP)提供了科學(xué)依據(jù)。目前尚無利用RT-MLPA方法檢測胎兒游離核酸中的RNA-SNP的報道，本發(fā)明人在RT-MLPA技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)通過提取母體血漿中胎兒游離核酸進(jìn)行RNA-SNP相對定量檢測，凡是孕期中特異表達(dá)于胎盤的基因均可以利用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種逆轉(zhuǎn)錄多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測RNA-SNP的方法，通過提取母體血漿中胎兒游離核酸對RNA-SNP進(jìn)行相對定量檢測。本方法包括四個步驟1)選擇RNA-SNP位點，并設(shè)計合成相應(yīng)的引物探針，配制反應(yīng)體系；2)提取孕婦母體血漿中胎兒游離核酸并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；3)將cDNA進(jìn)行雜交、連接及PCR擴(kuò)增反應(yīng)；4)PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明的個優(yōu)選實施方案是利用NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫篩選出mRNA序列中靠近5’端且雜交率相對較高的RNA-SNP位點。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是設(shè)計的引物包括一組逆轉(zhuǎn)錄引物和一對共用的MLPA-PCR引物。因為所有被連接后的片段具有共同的5’端和3’端，因此可以共用對MLPA-PCR引物在一個PCR體系中擴(kuò)增不同的目的基因序列，其MLPA-PCR弓丨物的上下游引物序列分別為5，-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，(SEQIDNO1)和5’-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’(SEQIDNO2),且下游引物的5’端用FAM熒光素標(biāo)記，組逆轉(zhuǎn)錄引物可以按照引物的一般設(shè)計原則進(jìn)行設(shè)計。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是設(shè)計的探針由包含RNA-SNP位點的幾組或幾十組探針組成，且每組探針包括兩條短探針和一條共用的長探針，可以按照探針的一般設(shè)計原則進(jìn)行設(shè)計。所有的短探針均具有相同的5’端，所有的長探針均具有相同的3’端且長探針的5’端均進(jìn)行磷酸化處理。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是利用Trizol預(yù)處理、市售的RNA提取試劑(如Qiagen生產(chǎn)的RNeasyminikit)進(jìn)行提取、再用DNase處理的方法從孕婦母體血漿中提取胎兒游離核酸，由于取材使用孕婦母體血漿，避免傳統(tǒng)的胎兒取材方法，避免了可能存在的由于侵襲性取材導(dǎo)致流產(chǎn)的風(fēng)險。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、雜交反應(yīng)體系、連接反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括RNA樣本、逆轉(zhuǎn)錄引物混合液、MMLV-逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。其中RNA樣本的工作濃度范圍為15-500ng/ul，優(yōu)選范圍為50-250ng/ul；逆轉(zhuǎn)錄引物工作濃度范圍為0.1μM-10.0μM，優(yōu)選范圍為0.1μΜ-2μΜ;逆轉(zhuǎn)錄酶和反應(yīng)液可采用市售產(chǎn)品，如invitrogen公司生產(chǎn)的SuperScriptIIIRT和IOXRTbuffer0本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案將樣本和逆轉(zhuǎn)錄引物混合液冰上混勻后65°C加熱5min，立刻置冰上至少lmin。然后按相應(yīng)產(chǎn)品說明書的要求加入逆轉(zhuǎn)錄酶和反應(yīng)液的混合液，50°C孵育50min，85°C加熱5min，終止反應(yīng)后37°C孵育20min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為5ul。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是雜交反應(yīng)體系包括雜交液和探針混合液。其中探針混合液中探針工作濃度范圍為0.OlfM-lOOfM，優(yōu)選范圍為0.IfM-IOfM,雜交液的配制如下1.5MKCl,300mMTris-HCl(pH8.5)，ImMEDTA。雜交反應(yīng)體系體積為!3ul，加入5ul逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是雜交反應(yīng)的條件為95°C加熱lmin，隨即放入58°C水浴鍋中雜交16小時。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是連接反應(yīng)體系包括TaqDNAligasebuffer和TaqDNA連接酶，可采用市售產(chǎn)品，如NEB公司產(chǎn)品。連接反應(yīng)體系體積為32ul，加入8ul雜交反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是連接反應(yīng)的條件為孵育15min，95°C加熱5min。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括PCRbuffer,25mMdATP，25mMdGTP,25mMdCTP,50mMdUTP的混合液，MLPA-PCR上下游引物和熱啟動Taq酶。其中MLPA-PCR上下游引物工作濃度范圍為0.1μΜ-10.0μΜ,優(yōu)選范圍為0.1μΜ_2μΜ,熱啟動Taq酶和buffer可采用市售產(chǎn)品，如QIAGEN公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為40ul，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物IOul進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為95°C熱啟動15-30min，94°C變性30-60s，6(TC退火30_60s，72°C延伸30_90s，按此條件進(jìn)行30-40個循環(huán)，最后60°C延伸20-50min，4°C保存。優(yōu)選反應(yīng)條件為95°C熱啟動15min，94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，進(jìn)行32個循環(huán)，最后60°C延伸45min，4°C保存。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是反應(yīng)所擴(kuò)增出的目的片段大小在90_500bp之間，且在同一個反應(yīng)中可以擴(kuò)增出不同目的基因序列，同時檢測多個RNA-SNP位點。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是擴(kuò)增產(chǎn)物與市售的Marker溶液(如ABI公司生產(chǎn)的Hi-DiTMformamide和GeneScanR0X-500Sizestandard)按比例混合后，95°C變性5min，立刻置冰上至少1分鐘。取適量變性混合物上樣，采用市售的遺傳分析儀進(jìn)行片段分析。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是通過對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行各位點不同的等位基因片段大小和數(shù)目的檢測，分析累計產(chǎn)物發(fā)出的熒光量來檢測靶多核苷酸的存在和相對量，用同一雜合位點處兩個片段對應(yīng)的峰面積的比值結(jié)合臨床資料綜合分析檢測結(jié)果?！愄禺惐磉_(dá)于胎盤的基因均可以利用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測，這類基因均具有隨著孕周期數(shù)的增加表達(dá)量增多且隨著胎兒娩出后M小時而消失的特點，如PLAC4基因、絨毛膜生長催乳激素CSHl基因、絨毛膜生長催乳樣激素CSHLl基因。利用本發(fā)明方法進(jìn)行RNA-SNP檢測，為SNP的檢測提供了一種新方法，拓寬了SNP檢測的檢測范圍。圖1顯示探針的組成成分。圖中1表示共用的上游引物，2表示短探針的填充序列，3表示短探針A的目的基因組序列，4表示B中不同于A的目的基因組序列，5表示長探針的目的基因組序列，6表示長探針的填充序列，7表示共用的下游引物和表示SNP等位基因。圖2顯示染色體核型分析結(jié)果為正常的樣本RT-MLPA檢測，GenemapperV3.0分析結(jié)果。圖中藍(lán)色標(biāo)記的兩組片段即為檢測到的兩個雜合RNA-SNP位點對應(yīng)的片段，每個雜合SNP位點對應(yīng)的兩個片段的峰面積比值接近于11。圖3顯示檢測到的雜合SNP位點的測序驗證結(jié)果。圖中T/C箭頭所指的方向即為檢測到的雜合SNP位點。圖4顯示依次為空白、21三體核型分析正常和核型分析異常的三個樣本RT-MLPA毛細(xì)管電泳結(jié)果。圖中空白樣本沒有擴(kuò)增片段；核型分析正常的樣本檢測到2個雜合RNA-SNP位點且每個雜合位點對應(yīng)的兩個片段的峰面積比值等于或接近11;核型分析異常的樣本檢測到3個雜合RNA-SNP位點且每個雜合位點處長片段與短片段所對應(yīng)的峰面積比值等于或接近21。圖5顯示依次為空白，CSHLl-rs2M6207檢測為純合子，CSHLl-rs2246207檢測為雜合子，的三個樣本RT-MLPA毛細(xì)管電泳結(jié)果。圖中空白樣本沒有擴(kuò)增片段；CSHLl-rs2246207檢測為純合子的樣本為單一片段，CSHLl-rs2246207檢測為雜合子的樣本雜合位點對應(yīng)的兩個片段的峰面積比值等于或接近11。具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1RT-MLPA檢測位于21號染色體上特異表達(dá)于胎盤的PLAC4基因的RNA-SNP位點1.IRNA-SNP位點的選擇及設(shè)計參考NCBI-SNP數(shù)據(jù)庫中PLAC4基因的信息，選擇rs8130833、rsll909439、rs59895715、rsl6998089和rs9977003五個位點，按照附圖1中所示設(shè)計要求設(shè)計包含所選SNP位點的五組探針序列如下rs8130833位點(5，_3，)短探針GTGCCAGCMGATCCMTCTAGACMCACCATTTGGGTTMATACMGTTAGAT(SEQIDNO3)GTGCCAGCMGATCCMTCTAGATATTGCMCACCATTTGGGTTAMTACMGTTAGAC(SEQIDNO4)長探針GACGAATATATCTGGCCTAAACATGGTTCTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO5)rsll909439位點(5，3，)短探針GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAGATGGGAATAGGAGCATTG(SEQIDNO6)GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGCTGTAGATGGGAATAGGAGCATTA(SEQIDNO7)長探針ATCTTGCTCTTCTTCCTGACTGTAGTACTTCATCAATATGTACATCTTAGTAATGATCAATTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO8)rs59895715位點(5，_3，)短探針GTGCCAGCMGATCCMTCTAGACAGTGAGTAGAMAGAGAGATGTMAGMT(SEQIDNO9)GTGCCAGCMGATCCMTCTAGATGMCCAGTGAGTAGAAMGAGAGATGTAMGMC(SEQIDNO:10)長探針ATTATGAATAGAAAATGTATTTTTTGTTTGTTTTGCAAGGAAGGATATAAAGAAAGAGTAATTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO11)rsl6998089位點(5，_3，)短探針GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGACCTGTAAGCAGGGAAGCAC(SEQIDNO:12)6GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAATTGCCTGTAAGCAGGGAAGCAT(SEQIDNO:13)長探針AATGTTTTCACATTCTTTGTAAGTCATATGTTCTACTAGAATCTAACTTCAGAACATGATCTTACAAGTAATGAAGAAGTTGATGTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO:14)rs9977003位點(5，_3，)短探針GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGATTGATATTTACACCTTGTGGCCCT(SEQIDNO:15)GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGATTTTCTTGATATTTACACCTTGTGGCCCC(SEQIDNO:16)長探針GTGATAGACTGGAAATCTCAAACAACAACTATAGAAAGATTCTTACATTCATGATTCAAGAATGATACTAGAACAAGAACTAACTATACTTATCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO:17)1.2標(biāo)本采集、處理及胎兒游離核酸的抽提收集40例經(jīng)染色體核型分析正常和10例經(jīng)染色體核型分析為21三體陽性的9-18孕周孕婦的外周血5-10ml，采用EDTA抗凝。將收集到的外周血4°C預(yù)冷10-30min后，4000rpm4°C離心lOmin，將上層血漿小心轉(zhuǎn)移至1_2個滅菌的2.Oml的離心管中。收集到的血漿應(yīng)立即提取游離RNA或加入RNA穩(wěn)定劑存放至-80°C以備日后提取。胎兒游離RNA的提取步驟如下1)在1.6ml的母體血漿中加入2ml的Trizol(Invitrogen生產(chǎn))和0.4ml氯仿混勻后靜置3分鐘，14000rpm4°C離心15min,小心將上層液體移至新的滅菌離心管中；2)在新的離心管中加入等體積的70%乙醇，混勻后將液體移至RNeasyminicolumn(RNeasyminikit,Qiagen生產(chǎn))，隨后的操作根據(jù)產(chǎn)品說明書完成。最后RNA用30μ1DEPC-H2O洗脫，儲存于-80°C。3)提取到的RNA使用前用DNase(RNase-FreeDNasekt，Qiagen生產(chǎn))處理以消除殘留的DNA。1.3RT-MLPA將2μ1RNA樣本和1.5μ1逆轉(zhuǎn)錄引物混合液冰上混勻后65°C加熱5min，立刻置冰上至少lmin。然后加入1.5ulSuperScriptIIIRT和10XRTbuffer的混合液，50°C孵育50min，85°C加熱5min，終止反應(yīng)后37°C孵育20min.將1.5μ1雜交液和1.5μ1探針混合液加入到逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA的管中，混勻后95°C加熱lmin，隨即放入58°C水浴鍋中雜交16小時。將16小時后的雜交產(chǎn)物中加入TaqDNAligasebuffer(含IUTaqDNA連接酶，NEB公司)至反應(yīng)體系為40μ1，然后孵育15min，95°C加熱5min終止反應(yīng)。取上述10μ1連接產(chǎn)物加到50μ1總反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個反應(yīng)中還包括PCRbuffeHQIAGEN公司)，25mMdATP,25mMdGTP,25mMdCTP,50mMdUTP，20nMMLPA-PCR上下游引物(上下游引物序列分別為5，-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，和5‘-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3‘)和HotStarTaqDNAPolymerase(QIAGEN公司)。反應(yīng)條件95°C熱啟動15min，94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，此條件共進(jìn)行32個循環(huán)，最后60°C延伸45min，4°C保存。1.4ABIPRISM3100片段分析取擴(kuò)增產(chǎn)物Ιμ，加入13·5μ1Hi_Diformamide和0.5ulGeneScanR0X-500Sizestandard(ABI公司)混合后，95°C變性5min，立刻置冰上至少1分鐘。取10μ1變性混合物上樣ABIPRISM3100遺傳分析儀(PEAppliedBiosystems生產(chǎn))進(jìn)行片段分析。反應(yīng)結(jié)束后用GenemapperV3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。1.5結(jié)果分析胎兒染色體核型分析為正常的40例樣本用上述方法進(jìn)行檢測，每個樣本均檢測兩次，每個樣本中至少有1個雜合SNP位點，且每個雜合SNP位點中兩個片段對應(yīng)的峰面積比值均等于或接近11(見附圖幻。對40例樣本中檢測到的雜合SNP位點進(jìn)行測序驗證，結(jié)果均正確(見附圖幻。胎兒染色體核型分析異常的10例樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果完全相符。每個雜合SNP位點處長片段與短片段所對應(yīng)的峰面積比值等于或接近21(見附圖4)。實施例2RT-MLPA檢測位于17號染色體上特異表達(dá)于胎盤的CSHLl基因(絨毛膜生長催乳樣激素基因)的RNA-SNP位點1.IRNA-SNP位點的選擇及設(shè)計參考NCBI-SNP數(shù)據(jù)庫中CSHLl基因的信息，選擇rs2M6207位點，按照附圖1中所示設(shè)計要求設(shè)計包含所選SNP位點的一組探針序列如下rs2246207位點(5，_3，)短探針GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGACTTTAGGAGGTGATAGTCATCA(SEQIDNO:18)GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAGGTCCTTTAGGAGGTGATAGTCATCG(SEQIDNO:19)長探針ACTGTGTATGACACCTCGGACAGATAATCTGTGTTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO20)1.2標(biāo)本采集、處理及胎兒游離核酸的抽提收集40例經(jīng)染色體核型分析正常的9-18孕周孕婦的外周血5_10ml，采用EDTA抗凝。將收集到的外周血4°C預(yù)冷10-30min后，4000rpm4°C離心lOmin，將上層血漿小心轉(zhuǎn)移至1-2個滅菌的2.Oml的離心管中。收集到的血漿應(yīng)立即提取游離RNA或加入RNA穩(wěn)定劑存放至-80°C以備日后提取。胎兒游離RNA的提取步驟如下1)在1.6ml的母體血漿中加入2ml的Trizol(Invitrogen生產(chǎn))和0.4ml氯仿混勻后靜置3分鐘，14000rpm4°C離心15min,小心將上層液體移至新的滅菌離心管中；幻在新的離心管中加入等體積的70%乙醇，混勻后將液體移至RNeasyminicolumn(RNeasyminikit,Qiagen生產(chǎn))，隨后的操作根據(jù)產(chǎn)品說明書完成。最后RNA用30μ1DEPC-H2O洗脫，儲存于-80°C。3)提取到的RNA使用前用DNase(RNase-FreeDNasekt，Qiagen生產(chǎn))處理以消除殘留的DNA。1.3RT-MLPA將2μ1RNA樣本和1.5μ1逆轉(zhuǎn)錄引物混合液冰上混勻后65°C加熱5min，立刻置冰上至少lmin。然后加入1.5ulSupei^criptIIIRT和10XRTbuffer的混合液，50°C孵育50min，85°C加熱5min，終止反應(yīng)后37°C孵育20min.將1.5μ1雜交液和1.5μ1探針混合液加入到逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA的管中，混勻后95°C加熱lmin，隨即放入58°C水浴鍋中雜交16小時。將16小時后的雜交產(chǎn)物中加入TaqDNAligasebuffer(含IUTaqDNA連接酶，NEB公司)至反應(yīng)體系為40μ1，然后孵育15min，95°C加熱5min終止反應(yīng)。取上述10μ1連接產(chǎn)物加到50μ1總反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個反應(yīng)中還包括PCRbuffeHQIAGEN公司)，25mMdATP,25mMdGTP,25mMdCTP,50mMdUTP，20nM8MLPA-PCR上下游引物(上下游引物序列分別為5，-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，和5‘-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3‘)和HotStarTaqDNAPolymerase(QIAGEN公司)。反應(yīng)條件95°C熱啟動15min，94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，此條件共進(jìn)行32個循環(huán)，最后60°C延伸45min，4°C保存。1.4ABIPRISM3100片段分析取擴(kuò)增產(chǎn)物Ιμ，加入13·5μ1Hi_Diformamide和0.5ulGeneScanR0X-500Sizestandard(ABI公司)混合后，95°C變性5min，立刻置冰上至少1分鐘。取10μ1變性混合物上樣ABIPRISM3100遺傳分析儀(PEAppliedBiosystems生產(chǎn))進(jìn)行片段分析。反應(yīng)結(jié)束后用GenemapperV3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。1.5結(jié)果分析胎兒染色體核型分析為正常的40例樣本用上述方法進(jìn)行檢測，每個樣本均檢測兩次，共有23例樣本檢測到該雜合SNP位點，且每個雜合SNP位點中兩個片段對應(yīng)的峰面積比值均等于或接近11(見附圖幻。對23例樣本中檢測到的雜合SNP位點進(jìn)行測序驗證，結(jié)果均正確。權(quán)利要求1.一種逆轉(zhuǎn)錄一多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測RNA-SNP的方法，其特征在于該方法包括四個步驟1)選擇RNA-SNP位點，并設(shè)計合成相應(yīng)的引物探針，配制反應(yīng)體系；2)提取孕婦母體血漿中胎兒游離核酸并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；3)將cDNA進(jìn)行雜交、連接及PCR擴(kuò)增反應(yīng)；4)PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于設(shè)計的引物包括一組逆轉(zhuǎn)錄引物和一對共用的MLPA-PCR引物。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于MLPA-PCR引物的上下游引物序列分別為5，-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，和5，-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3，，且下游引物的5，端用FAM熒光素標(biāo)記。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于設(shè)計的探針由包含RNA-SNP位點的幾組或幾十組探針組成，且每組探針包括兩條短探針和一條共用的長探針，所有的短探針均具有相同的5’端，所有的長探針均具有相同的3’端且長探針的5’端均進(jìn)行磷酸化處理。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、雜交反應(yīng)體系、連接反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中RNA樣本的工作濃度范圍為50-250ng/ul，逆轉(zhuǎn)錄引物工作濃度范圍為0.1μM-2μM。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于雜交反應(yīng)體系包括雜交液和探針混合液，其中探針混合液的探針工作濃度范圍為0.IfM-IOfM,雜交液為1.5ΜKCl，300mMTris-HCl(ρΗ8·5)，ImMEDTA08.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括PCRbuffer,25mMdATP,25mMdGTP,25mMdCTP,50mMdUTP的混合液，MLPA-PCR上下游引物和熱啟動Taq酶。9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中MLPA-PCR上下游引物工作濃度范圍為0.1μΜ-2μMo全文摘要本發(fā)明涉及一種逆轉(zhuǎn)錄-多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測RNA-SNP的方法，特別是涉及到一種利用逆轉(zhuǎn)錄-多重?zé)晒馓结様U(kuò)增技術(shù)檢測孕婦母體血漿中胎兒RNA-SNP的方法。本發(fā)明方法包括四個步驟，通過提取母體血漿中胎兒游離核酸對RNA-SNP進(jìn)行相對定量檢測，可以用于檢測一類特異表達(dá)于胎盤的基因，也為SNP的檢測提供了一種新方法，拓寬了SNP檢測的檢測范圍。文檔編號C12Q1/68GK102140497SQ20101010458公開日2011年8月3日申請日期2010年1月29日優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日發(fā)明者李明,鄧艷華,陳華云申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司