專利名稱：用于指導(dǎo)伊立替康類藥物個體化治療的基因組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一組用于指導(dǎo)伊立替康類藥物個體化治療的基因組合。
背景技術(shù)：
伊立替康(CPT-Il)是拓?fù)洚悩?gòu)酶I (Topo-I)的特異性抑制劑，Τορο-I是在DNA復(fù) 制和轉(zhuǎn)錄過程中必不可少的核酶。CPT-Il在大多數(shù)組織中經(jīng)羧酸酯酶的作用下產(chǎn)生活性代 謝產(chǎn)物SN-38，其對拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制活性是CPT-Il的100 1000倍。CPT-Il和SN-38 的細(xì)胞毒效應(yīng)是通過與DNA-Topo-I復(fù)合體的穩(wěn)定結(jié)合，引起DNA單鏈斷裂，使DNA產(chǎn)生不 可逆損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。伊立替康在體內(nèi)和體外研究中均有廣譜的、很強的抗腫瘤 活性，重要的是伊立替康和它的代謝產(chǎn)物對表達多藥耐藥的腫瘤仍然有效。研究表明，多種腫瘤細(xì)胞，特別是結(jié)腸癌，宮頸癌、卵巢癌等細(xì)胞內(nèi)的Topo-I含量 大大高于正常組織，尤其在S期腫瘤細(xì)胞中含量大幅提高。由于伊立替康獨特的作用機制， 使得其對上述腫瘤細(xì)胞有著較高的選擇性，從而降低對正常細(xì)胞的毒性。伊立替康應(yīng)用于 上述癌癥的治療，其療效是令人鼓舞的，其應(yīng)用前景將非常美好。然而，伊立替康在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，也不可避免地殺傷了正常組織細(xì)胞，引起 較為嚴(yán)重的毒副作用。包括腹瀉、惡心嘔吐、脫水等胃腸道反應(yīng)；中性粒細(xì)胞減少癥、貧血、 血小板減少癥等血液學(xué)方面的不良反應(yīng)；急性膽堿能綜合征；脫發(fā)、口腔炎、皮膚毒性等。UGTlA 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT-Glucuronosyhransferase)是一種對 許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)進行解毒，加強其排泄的重要酶類，UGT基因分為兩個大類UGTl 和UGT2。研究表明，UGTl基因的遺傳多態(tài)性對減輕藥物的毒副作用有重要的臨床意義。伊 立替康的活性代謝產(chǎn)物是SN-38，SN-38主要由UGTlAl、UGT1A7和UGT1A9代謝生成SN-38G， 但UGTlAl酶的UGT1AN28的形式不能催化SN-38，結(jié)果聚集在體內(nèi)的SN-38引發(fā)腹瀉或嗜 中性白血球減少癥等其他毒性。野生型UGTlAl的TATA盒有6個重復(fù)的TA，UGT1A1M8突變型是插入了一個TA，變 成7個重復(fù)的TA，這樣使UGTlAl的轉(zhuǎn)錄活性下降了三分之二，UGT1A1*28的突變頻率在不 同人群中為0. 5% 23%，在亞洲人中的突變頻率比白人和非洲人要低。UGT1A1*6(G71R) 酶活性是野生型的49%。IL-8 白細(xì)胞介素8(interleukin8，IL-8)是一個多功能、多細(xì)胞來源的趨化性細(xì) 胞因子，可刺激腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞移動，并且作為腫瘤血管發(fā)生因子，加速新生 血管的形成，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-8基因在其轉(zhuǎn)錄起始 點251處存在A/T單核苷酸多態(tài)性，且此多態(tài)性與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。多項研究 發(fā)現(xiàn)AA型較AT型IL-8蛋白表達量高，中性粒細(xì)胞趨化指數(shù)明顯高，IL-8轉(zhuǎn)錄啟動子的激 活率也高。N. Mallik等研究顯示在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中，攜帶AT或TT型IL-8病人 的生存期顯著高于攜帶AA型IL-8的病人，因而該位點的多態(tài)性是臨床上用于判斷CPT-Il 治療的預(yù)后的有效分子標(biāo)記。也有研究表明結(jié)合IL-8和VEGFR的多態(tài)性是預(yù)測大腸癌分化和預(yù)后的可能標(biāo)記。VEGF-A 腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤血管生成。通過抑制腫瘤血管生成來 治療腫瘤是目前抗腫瘤治療的一項重要治療策略。VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成 因子之一，它以旁分泌方式特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的血管內(nèi)皮生長因子受體，對 內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮強烈的促分裂、增殖和趨化作用，從而促進血管生成。VEGF-A是其中的一種， 具有促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加微血管通透性，誘導(dǎo)血管生成等功能，大部分的腫瘤細(xì)胞高度 表達VEGF-A，增強了 VEGF-A介導(dǎo)的血管生成，進而為腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移提供良好的 微環(huán)境。由于VEGF在腫瘤增殖轉(zhuǎn)移等方面的關(guān)鍵作用，針對VEGF的單克隆抗體Avastin 已在2004被美國FDA批準(zhǔn)作為一線藥物用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療，并與2006年繼續(xù)被 批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌的治療。自2005年以來多個研究小組研究了抗VEGF-單克隆抗體 Avastin和伊立替康聯(lián)合用藥對膠質(zhì)瘤的治療作用，幾乎所有研究都表明這種聯(lián)合用藥方 案的療效顯著，包括顯著縮小病灶，提高患者生存率等。因而VEGF的多態(tài)性可影響Avastin 和伊立替康聯(lián)合用藥的療效，結(jié)合IL-8的多態(tài)性分析可以指導(dǎo)臨床治療。藥物代謝和效應(yīng)的個體化差異臨床上，同樣藥物的劑量對病人甲有效，對病人乙 可能不起作用，對病人丙則可能有副作用。在藥物療效與副作用方面，病人的反應(yīng)差異很 大。這主要是由于病人遺傳學(xué)上存在差異(單核苷酸多態(tài)性，SNP)，導(dǎo)致對藥物產(chǎn)生不同的 反應(yīng)。因此，在對腫瘤病人進行化療時，如果先對其相關(guān)基因位點進行檢測，再根據(jù)其基因 多態(tài)性進行治療，就可以對病人實施個體優(yōu)化治療。因此，通過檢測腫瘤病人外周血中的UGT1AN28，UGT1A1*6，IL-8, VEGF-A基因位 點的多態(tài)性，可以指導(dǎo)腫瘤病人使用伊立替康類藥物治療時的用法、用量和使用時機，以使 療效達到最大，副作用降到最低?，F(xiàn)有臨床用藥方法的缺陷在很多疾病的治療過程中，常發(fā)生用藥不當(dāng)而導(dǎo)致副 作用或因劑量不足無法達到治療目的。因此針對這些病患的基因型進行個體化用藥具有特 別重要的意義。以前，醫(yī)生如果需要調(diào)整病人的用藥，需要長時間觀察，病人也需要做大量 的檢測。這種調(diào)整用藥的過程程序復(fù)雜，費時，延誤治病時機。本發(fā)明的有益之處是(1)病人的血液是容易得到的樣本；(2)本發(fā)明的篩選方法 是一種對人體無害的檢測方法；C3)本發(fā)明結(jié)合了的位點組合不但是伊立替康代謝活化通 路上的關(guān)鍵位點(UGT1AN28，UGT1A1*6)，同時還綜合了對伊立替康的療效有協(xié)同作用的 相關(guān)基因位點(IL-8，VEGF-A)的多態(tài)性，以指導(dǎo)腫瘤病人使用伊立替康類藥物治療時的用 法、用量和使用時機，以使療效達到最大，副作用降到最低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對目前腫瘤的治療過程中，伊立替康類藥物的療 效及毒副作用在不同病人中的明顯差異，提供一種方便、快捷的輔助臨床醫(yī)生制定個體化 用藥方案的基因組合及其應(yīng)用方法。本發(fā)明的目的是提供一組用于指導(dǎo)伊立替康類藥物個體化治療的基因組合，包 括:UGT1A1*28, UGT1A1*6，IL-8, VEGF-A 基因。本發(fā)明的另一個目的是提供該基因組合在指導(dǎo)伊立替康類藥物個體化治療中的 應(yīng)用。
基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案針對上述基因的特異性位點設(shè)計引物，各基因引物序列如表1所示。表 1
No.基因名稱正向引物(5’ -3，)序列號反向引物(5’ -3’ )序列號1UGTIA1*28CTCTGAAAGTGAACTCCCTGSEQ ID No. 1CAACAGTATCTTCCCAGCATSEQ ID No. 22UGTIA1*6ACCTCTGGCAGGAGCAAAGSEQ ID No. 3CCGTCAGCATGACATCAAAGSEQ ID No. 43IL-8GAAAGTTCCAGGTGTTSEQ ID No. 5CTGGGAGTGACAAAGSEQ ID No. 64VEGF-AGGAGGAGATGAGAGACTCTGSEQ ID No. 7CATAGGTCCTTTTAGGCTGSEQ ID No. 8使用上述引物鑒定其相應(yīng)基因的突變情況，包括如下步驟(1)提取腫瘤病人血液基因組DNA ；(2)進行PCR擴增，20 μ 1 PCR反應(yīng)體系如下待測腫瘤病人血液基因組DNA 50 IOOng, Taq 酶 0. 125 μ 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 緩沖液 (含Mg2+)2y 1，余下為無菌蒸餾水；PCR反應(yīng)條件為95°C變性anin，隨后95°C變性30sec， 55 °C (UGT1A1*28) ,64 °C (UGT1A1*6)、48 °C (IL_8)、58°C (VEGF-A)退火 30sec，72 °C 延伸 lmin，進行45個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存；(3) PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析；(4) PCR擴增產(chǎn)物測序。


圖1是各基因突變區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，圖中M為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn) marker條帶，1為UGT1A1M8基因條帶，2為UGT1A1*6基因條帶，3為IL-8基因條帶，4為 VEGF-A基因條帶；圖2是UGT1A1M8基因突變區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物的直接測序圖；圖3是UGT1A1*6基因突變區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物的直接測序圖；圖4是IL-8基因突變區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物的直接測序圖；圖5是VEGF-A基因突變區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物的直接測序圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1 一種鑒定UGT1A1M8基因突變情況的方法1.提取腫瘤病人血液基因組DNA ；2.進行PCR擴增，20 μ 1 PCR反應(yīng)體系如下待測腫瘤病人血液基因組DNA 50 IOOng, Taq 酶 0. 125 μ 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，IOXPCR 緩沖液 (含Mg2+) 2 μ 1，余下為無菌蒸餾水；PCR反應(yīng)條件為95°C變性2min，隨后95°C變性30sec， 55°C退火30seC，72°C延伸lmin，進行45個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存；3. PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析a.用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈。放在水平桌面上，并架好梳子?？膳渲?1. 5%濃度的瓊脂糖用于電泳。b.將50ml 1 X TAE電泳緩沖液IOOml于三角燒瓶中，稱取0. 75g的瓊脂糖粉放入 后微波爐內(nèi)加熱溶解。冷卻至60°C左右，加入5μ 1 Gelview ，混勻，倒入電泳槽中，避免氣 泡，待凝固。c.向電泳槽中倒入1 XTAE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子。如樣品孔 內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去。d.在3-5 μ 1 PCR產(chǎn)物中加入12 μ 1的加樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)。并設(shè) 一孔核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)marker (6 μ 1)。e.接通電源，紅色為正極黑色為負(fù)極，DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(靠近加樣孔的 一端為負(fù))，電壓為120V。根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳。一般200 400bp 的PCR產(chǎn)物電泳20min即可。f.紫外儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴增產(chǎn)物的大小。 拍照，電腦存檔。結(jié)果如圖1所示，條帶1代表UGT1A1M8基因，其PCR產(chǎn)物為M9bp。4. PCR擴增產(chǎn)物測序確認(rèn)電泳跑出目標(biāo)條帶后進行測序。a.在每個孔中加入2 μ 1 PCR產(chǎn)物，1 μ 1混和酶(0. 5U蝦堿酶和5U外切酶)，PCR 儀上，85 °C滅活15min。b.在上述孔中加入1μ 1 BDT溶液，2 μ 1引物(lpmol/μ 1)(正向和反向引物分別 裝于兩個孔中)，每加完一次樣都在96孔板于離心機中離心，當(dāng)離心速度達到1500轉(zhuǎn)/min 時即停，最后當(dāng)所有試劑全部加完離心后蓋上熱墊蓋。c.在PCR儀上進行擴增。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性％iin，隨后95°C變性30sec， 50°C退火15sec，進行；35個循環(huán)，最后60°C延伸％iin，4°C保存；d.反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板放入離心機離心，當(dāng)轉(zhuǎn)速達2000轉(zhuǎn)/min即停止離心。e.打開熱墊蓋，在各孔內(nèi)分別加入2. μ 1 125mM EDTA，在離心機中離心，至轉(zhuǎn)速達 2000轉(zhuǎn)/min停止離心，再加17 μ 1無水乙醇(AR)，蓋上蓋子，在漩渦混懸器上振蕩后放入 于低溫離心機中離心，在轉(zhuǎn)速3500轉(zhuǎn)/min下離心30分鐘。f.打開熱墊蓋蓋，在板口放置足夠的吸水紙，在離心機中倒置離心，當(dāng)轉(zhuǎn)速達 1300轉(zhuǎn)/min停止離心。g.分別向上步得到沉淀中加入50μ1 70%乙醇，封上塑料封口膜，在冷凍離心機 中離心(3500轉(zhuǎn)/min) 6分鐘。h.揭開塑料封口膜，在板口放置足夠的吸水紙，在冷凍離心機中倒置離心，當(dāng)轉(zhuǎn)速 達到1300轉(zhuǎn)/min時停止離心。i.將洗滌好的沉淀在抽屜中避光，室溫下放置15-30分鐘左右，讓殘留乙醇全部 揮發(fā)。
6
j.每孔加入IOul Hi-Di，在PCR儀上進行變性反應(yīng)，條件為95°C 4min — 4°C forever。k. 3730x1測序儀進行測序。應(yīng)用DNAstar程序，將樣本測序所得序列與同一區(qū)域的野生型序列比較，確定 UGT1A1*28的突變情況及突變位點，野生型啟動子區(qū)有6個TA反復(fù)，突變型啟動子區(qū)的TA 反復(fù)次數(shù)不為6。本次樣本測序結(jié)果為突變型。見圖2。實施例2 —種鑒定UGT1A1*6基因突變情況的方法1.提取腫瘤病人血液基因組DNA ；2.進行PCR擴增，20 μ 1 PCR反應(yīng)體系如下待測腫瘤病人血液基因組DNA 50 IOOng, Taq 酶 0. 125 μ 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 緩沖液 (含Mg2+) 2 μ 1，余下為無菌蒸餾水；PCR反應(yīng)條件為95°C變性2min，隨后95°C變性30sec， 64°C退火30seC，72°C延伸lmin，進行45個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存；3. PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析具體步驟同實施例1。結(jié)果如圖1所示，條帶2代表UGT1A1*6基因，其PCR產(chǎn)物為47^ρ。4. PCR擴增產(chǎn)物測序具體步驟同實施例1。應(yīng)用DNAstar程序，將樣本測序所得序列與同一區(qū)域的野生型序列比較，確定 UGT1A1*6的突變情況及突變位點。野生型的第71密碼子編碼氨基酸為Gly，即在外顯子1 中的轉(zhuǎn)錄起始點第211為G，突變性型的第71密碼子編碼氨基酸為Arg，即第211位為A，本 次樣本測序結(jié)果為GG純合型。見圖3。實施例3 —種鑒定IL-8基因突變情況的方法1.提取腫瘤病人血液基因組DNA ；2.進行PCR擴增，20 μ 1 PCR反應(yīng)體系如下待測腫瘤病人血液基因組DNA 50 IOOng, Taq 酶 0. 125 μ 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 緩沖液 (含Mg2+) 2 μ 1，余下為無菌蒸餾水；PCR反應(yīng)條件為95°C變性2min，隨后95°C變性30sec， 48°C退火30seC，72°C延伸lmin，進行45個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存；3. PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析具體步驟同實施例1。結(jié)果如圖1所示，條帶3代表IL-8基因，其PCR產(chǎn)物為53^p。4. PCR擴增產(chǎn)物測序具體步驟同實施例1。應(yīng)用DNAstar程序，將樣本測序所得序列與同一區(qū)域的野生型序列比較，確定 IL-8的突變情況及突變位點。本次樣本測序結(jié)果為轉(zhuǎn)錄起始點第251處為TT純和型。見 圖4。實施例4 一種鑒定VEGF-A基因突變情況的方法a.提取腫瘤病人血液基因組DNA ；b.進行PCR擴增，20 μ 1 PCR反應(yīng)體系如下待測腫瘤病人血液基因組DNA 50 IOOng, Taq 酶 0. 125 μ 1，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1μ 1，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 緩沖液 (含Mg2+) 2 μ 1，余下為無菌蒸餾水；PCR反應(yīng)條件為95°C變性2min，隨后95°C變性30sec， 58°C退火30seC，72°C延伸lmin，進行45個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存；c. PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析具體步驟同實施例1。結(jié)果如圖1所示，條帶4代表VEGF-A基因，其PCR產(chǎn)物為508bp。
d. PCR擴增產(chǎn)物測序具體步驟同實施例1。應(yīng)用DNAstar程序，將樣本測序所得序列與同一區(qū)域的野生型序列比較，確定 VEGF-A的突變情況及突變位點。野生型為在轉(zhuǎn)錄起始點前460位為T，突變性型為在轉(zhuǎn)錄 起始點前460位為C，本次樣本測序結(jié)果為TT純合型。見圖5。
權(quán)利要求
1.一組用于指導(dǎo)伊立替康類藥物個體化治療的基因組合，其特征在于該基因組合包含 UGT1A1*28，UGT1A1*6，IL-8，VEGF-A 基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組合，其特征在于針對UGT1AN28位點設(shè) 計的正向引物序列為CTCTGAAAGTGAACTCCCTG(SEQ ID No. 1)，反向引物序列為 CAACAGTATCTTCCCAGCAT (SEQ ID No. 2)；針對UGT1A1*6位點設(shè)計的正向引物序列為 ACCTCTGGCAGGAGCAAAG (SEQ ID No. 3)，反向引物序列為 CCGTCAGCATGACATCAAAG (SEQ ID No. 4)；針對IL-8位點設(shè)計的正向引物序列為GAAAGTTCCAGGTGTT (SEQ ID No. 5)，反向 引物序列為CTGGGAGTGACAAAG (SEQID No. 6)；針對VEGF-A位點設(shè)計的正向引物序列為 GGAGGAGATGAGAGACTCTG (SEQ ID No. 7)，反向引物序列為 CATAGGTCCTTTTAGGCTG (SEQ ID No. 8)。
3.如權(quán)利要求2所述的引物序列在檢測其相應(yīng)的基因突變中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于檢測方法如下(1)提取腫瘤病人血液基因組DNA；(2)以待測腫瘤病人血液基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2所述的擴增引物進行PCR擴增；(3)PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析；G) PCR擴增產(chǎn)物測序。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟O)中PCR反應(yīng)體系每20μ 1組成 如下待測腫瘤病人血液基因組DNA 50 100ng，Taq酶0. 125 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1μ 1，dNTP (2. 5πιΜ)2μ 1，10XPCR 緩沖液(含 Mg2+) 2 μ 1，余下為無菌蒸餾水。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟O)中用于檢測UGT1AN28的PCR 擴增反應(yīng)條件是95°C變性2min，隨后95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，進 行45個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟⑵中用于檢測UGT1A1*6的PCR擴 增反應(yīng)條件是95°C變性2min，隨后95°C變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸lmin，進行 45個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
8.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟⑵中用于檢測IL-8的PCR擴增 反應(yīng)條件是95°C變性2min，隨后95°C變性30sec，48°C退火30sec，72°C延伸lmin，進行45 個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟O)中用于檢測VEGF-A的PCR擴 增反應(yīng)條件是95°C變性2min，隨后95°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸lmin，進行 45個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
10.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(4)中測序PCR擴增的反應(yīng)條件 為95°C預(yù)變％iin，隨后95°C變性30sec，50°C退火15sec，進行35個循環(huán)，最后60°C延伸 %iin，4°C 保存。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，提供一組用于指導(dǎo)伊立替康類藥物個體化治療的基因組合，包括UGT1A1*28，UGT1A1*6，IL-8，VEGF-A基因。本發(fā)明通過檢測腫瘤病人外周血中的UGT1A1*28，UGT1A1*6，IL-8，VEGF-A基因位點的多態(tài)性，可以指導(dǎo)腫瘤病人使用伊立替康類藥物治療時的用法、用量和使用時機，以使療效達到最大，副作用降到最低。
文檔編號C12N15/11GK102146433SQ20101010538
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者張捷, 徐玲麗, 樓敬偉, 黃慧 申請人:上海寶藤生物醫(yī)藥科技有限公司