專利名稱：快速鑒別原料奶品質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別原料奶品質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
我國原料牛奶非法添加、造假、抗生素殘留等問題非常嚴重，奶粉中三聚氰胺中毒 事件的根源就是原料牛奶的非法添加三聚氰胺造成的。但是由于目前采用的原料牛奶檢測 主要是感官、比重和酸度測定，雖然非法添加、造假、抗生素殘留的原料牛奶中蛋白質(zhì)、脂肪 等各種營養(yǎng)成分和抗生素等有害成分含量與高品質(zhì)的原料牛奶相差甚遠，但采用目前的這 些普通檢測方法很難檢測出來。三聚氰胺事件后，有采用高效液相色譜等手段進行檢測的 情況，但是因需要高值的檢測儀器，檢測成本高，無法在原料牛奶的檢測中實現(xiàn)。并且，三聚 氰胺只是原料牛奶非法添加物之一，不可能采用化學(xué)分析手段一一檢測原料牛奶中所有可 能存在的非法添加物。因此，如何實現(xiàn)原料牛奶的快速、低成本、總體質(zhì)量的檢測，用現(xiàn)有的 方法無法實現(xiàn)。 微生物的生長與繁殖需要吸收蛋白質(zhì)、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，合成新的細胞成分和分 裂增加細菌數(shù)量。同時，微生物對pH、抗生素也較敏感。因此，營養(yǎng)成分的含量對微生物生 長和繁殖有很大影響，同時pH不適宜、抗生素的存在容易造成微生物不生長繁殖或生長繁 殖緩慢。因此，可以將微生物接種到食品中，測定其中微生物生長繁殖情況，對食品品質(zhì)進 行分析。該方法成本低，并且只要食品中營養(yǎng)成分不足，或者存在抑制微生物生長的有害成 分，都能反映到微生物的生長，可以檢測出食品總體的品質(zhì)情況。 目前微生物生長繁殖情況主要采用平板涂布和濁度法進行測定，兩者都需要從食 品中取樣測定，且前一種方法耗時長，后一種方法因濁度測定方法本身的局限性，在食品微 生物檢測中應(yīng)用常常出現(xiàn)濁度與微生物生長繁殖情況不一致情況。只有解決了這兩個問 題，才能實現(xiàn)通過微生物生長繁殖情況，對食品品質(zhì)進行快速分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒別原料奶品質(zhì)的方法，應(yīng)用這種方法，可快速 地鑒別出非法添加、造假、抗生素殘留等問題原料牛奶，無問題原料牛奶可用于生產(chǎn)，有問 題原料牛奶退貨，或者進一步檢測其是否摻水、非法添加、造假或者存在抗生素殘留等問 題。 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種快速鑒別原料奶品質(zhì)的測定方法，所 述方法包括如下步驟 A.滅菌將原料奶煮沸，保持其原有品質(zhì)的同時殺滅其中的微生物； B.加樣將待測樣品和對照品分別加入微孔板，然后根據(jù)需要加入顯色底物溶液
和微生物菌懸液； C.實時掃描測定將微孔板放入酶標(biāo)儀中，在預(yù)定的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)后，于波長 400士40nm，使用動力學(xué)測定模式進行掃描測定；禾口
D.鑒別品質(zhì)根據(jù)微生物的生長曲線鑒別原料奶樣品的品質(zhì)。 在步驟D中，可以以測定時間為X軸，以吸收值為Y軸，作每孔的微生物生長曲線；
或者，生長曲線也可以是直接采用軟件制作的生長曲線。 本發(fā)明檢測的原料奶選自牛奶、羊奶等哺乳動物的乳汁。 本發(fā)明的測定方法的步驟C中的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為20°C 45°C ;更優(yōu)選為36 37°C。 本發(fā)明的測定方法的步驟B中使用的對照品選自陽性對照、陰性對照和空白對照 中的至少一種。陽性對照分別為添加了三聚氰胺的原料奶、造假原料奶和/或抗生素殘留 超標(biāo)的原料奶；陰性對照為高品質(zhì)的原料奶；空白對照為待測的原料奶。 步驟D中的生長曲線可分為三種類型陡峭型、中間型、平緩型。陡峭型延滯期 短，對數(shù)期幾乎呈直線上升，穩(wěn)定期維持在較高的吸收值，且持續(xù)時間長，在8小時內(nèi)未進 入衰亡期；中間型延滯期長，對數(shù)期緩慢上升，穩(wěn)定期維持在較低的吸收值，且持續(xù)時間 短，有些在8小時內(nèi)即進入衰亡期；平緩型整個曲線呈拋物線型或貼近X軸呈直線，一直 維持較低的吸收值。陰性對照和品質(zhì)好的待測樣品為陡峭型生長曲線；陽性對照和品質(zhì)差 的待測樣品為中間型或平緩型生長曲線；空白對照為平緩型生長曲線。從而可以根據(jù)生長 曲線的類型鑒別原料奶樣品的品質(zhì)。 根據(jù)本發(fā)明所述的鑒別原料奶品質(zhì)的測定方法，其中工藝步驟B所述的顯色底物 和微生物是特異性的。該種微生物具有使該顯色底物分解產(chǎn)生熒光物質(zhì)的活性，并且隨著 微生物數(shù)量的增加，底物分解量增加，熒光物質(zhì)的強度增加，可在長波長紫外光下定量測 定，在一定范圍內(nèi)熒光的強度與微生物數(shù)量呈正比。從而可以通過連續(xù)掃描測定熒光強度， 實時了解微生物的生長情況。例如，顯色底物可以為紅四氮唑，微生物菌懸液可以為嗜熱乳 酸鏈球菌菌懸液。因為測定的波長采用的是長波長紫外光，并且是由特異性微生物分解特 異性底物產(chǎn)生的特異性熒光，所以，與濁度法相比具有更好的特異性。 工藝步驟D中通過微生物生長曲線來鑒別原料奶的品質(zhì)，與其他原料奶品質(zhì)的鑒 別方法相比具有更簡單、更經(jīng)濟、更快速、更注重牛奶總體品質(zhì)、可實時檢測原料奶中微生 物的生長狀況的優(yōu)點。 也就是說，本發(fā)明提供了一種原料奶品質(zhì)鑒別方法，其是通過微生物在原料奶中 的生長情況，定性判斷原料奶的品質(zhì)。 本發(fā)明適宜于原料奶的快速鑒定，如發(fā)現(xiàn)原料奶品質(zhì)有問題，可直接退貨，或者可 進一步分析原料奶存在的具體問題。 按照本發(fā)明所述的原料奶品質(zhì)的鑒別方法，可以將該方法簡述為原料奶滅
菌——原料奶加樣——實時掃描測定——鑒別原料奶的品質(zhì)。如發(fā)現(xiàn)原料牛奶品質(zhì)有問
題，可直接退貨，或者可進一步分析原料牛奶存在的具體問題。原料奶經(jīng)過滅菌處理，最大
限度保持原有品質(zhì)，同時去除其中的微生物，再將特異性微生物接種到原料奶中，微生物在
原料奶中生長，分解顯色底物，產(chǎn)生熒光物質(zhì)，在400士40nm的長波長下測定熒光強度，作
微生物生長曲線，根據(jù)微生物生長曲線類型，進行牛奶品質(zhì)的快速鑒別。 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明的測定方法包括以下步驟 A.滅菌將原料牛奶煮沸數(shù)次(如3次)，保持其原有品質(zhì)的同時，殺滅其中的微
生物；
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B.加樣將待測樣品和對照品分別加入微孔板，然后加入顯色底物溶液(如紅四 氮唑)和微生物菌懸液(如嗜熱乳酸鏈球菌)； C.實時掃描測定將微孔板放入酶標(biāo)儀中，將培養(yǎng)溫度設(shè)定為36 37°C ，測定波 長為400nm，使用動力學(xué)測定模式，每隔數(shù)分鐘測定1次，連續(xù)測定數(shù)小時；禾口
D.鑒定品質(zhì)以測定時間為X軸，以吸收值為Y軸，作每孔的微生物生長曲線；如 有相應(yīng)軟件，可直接采用軟件，制作生長曲線；根據(jù)生長曲線鑒別原料奶樣品的品質(zhì)。
生長曲線可分為三種類型陡峭型、中間型、平緩型。陰性對照和品質(zhì)好的待測樣 品為陡峭型生長曲線；陽性對照和品質(zhì)差的待測樣品為中間型或平緩型生長曲線；空白對 照為平緩型生長曲線。從而可以根據(jù)生長曲線的類型鑒別原料牛奶樣品的品質(zhì)。
使用本鑒別方法，能夠簡單、快速、高效地鑒別奶的品質(zhì)。 下面，結(jié)合以下示例性實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明和示例說明，但它們并 非用于對本發(fā)明的限定。


圖1為嗜熱乳酸鏈球菌在分別含有尿素和抗生素的牛奶溶液中的生長曲線圖。
具體實施方式

實施例1 將原料牛奶放入三角瓶中，以2層牛皮紙封口，在電爐上煮沸后取出，在水中冷 卻，再煮沸，冷卻后再煮沸，冷去備用。在超凈工作臺中，從三角瓶中取40 60iU原料牛 奶樣品至加有210 230iU腦心浸液的無菌、透明、平底、細胞培養(yǎng)微孔板的微孔中，然后 加入10 ii 1顯色底物(紅四氮唑，TTC) ， 20 iU嗜熱乳酸鏈球菌菌懸液。微生物菌懸液事先 以小管凍存在超低溫冰箱中，要使用時，取出l管，恢復(fù)到室溫即可使用。顯色底物，配置成
儲存液，滅菌后，在冰箱4t:保存，使用時用滅菌蒸餾水稀釋十倍后使用。每次試驗除待檢
原料牛奶樣品外，需設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照陽性對照中待檢的40 60 iU原料 牛奶樣品被替換為添加了尿素(1%)的原料牛奶、或者被替換為添加了抗生素的原料牛奶 (例如可添加青霉素0. 04單位或鏈霉素5單位)；陰性對照中待檢的40 60 iU原料牛 奶樣品被替換為高品質(zhì)的原料牛奶(三元奶牛場提供)；空白對照中10 iU顯色底物被替 換為10iU蒸餾水。每個樣品(包括對照)重復(fù)3孔實驗。加完樣后，蓋上微孔板蓋。放 入掃描儀中。將掃描儀培養(yǎng)溫度設(shè)為36t:，打開動力學(xué)研究軟件(Thermo公司multiskan speetrum酶標(biāo)儀Skanltso軟件)，每隔10分鐘在400nm處檢測1次，檢測時間為8小時。 作每孔的吸收與時間曲線圖。 如圖1所示，A1、B1、C1為空白對照，A2、B2、C2為添加了尿素溶液(1%)的陽性 對照，A3、B3、C3為添加了抗生素(青霉素0. 04單位)的陽性對照，A12、B12、C12為陰性對 照，其余為待檢原料牛奶樣品。其中添加尿素溶液、抗生素的陽性對照原料牛奶中微生物的 生長曲線很平坦，而陰性對照和待檢原料牛奶樣品生長曲線出現(xiàn)明顯的對數(shù)生長期和穩(wěn)定 生長期?？梢姡龣z原料牛奶樣品為合格牛奶。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點為可簡單、快速、高效地鑒別原料牛奶品質(zhì)。
權(quán)利要求
一種快速鑒別原料奶品質(zhì)的測定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.滅菌將原料奶煮沸，保持其原有品質(zhì)的同時殺滅其中的微生物；B.加樣將待測樣品和對照品分別加入微孔板，然后加入顯色底物溶液和微生物菌懸液；C.實時掃描測定將微孔板放入酶標(biāo)儀中，在預(yù)定的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)后，于測定波長400±40nm處，使用動力學(xué)測定模式進行掃描測定；和D.鑒別品質(zhì)根據(jù)微生物的生長曲線鑒別原料奶樣品的品質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B中的顯色底物和微生物是特異 性的，所述微生物具有使顯色底物分解產(chǎn)生熒光物質(zhì)的活性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B中的對照品選自陽性對照、陰 性對照和空白對照中的至少一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟C中的培養(yǎng)溫度為20°C 45°C 。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟C中的培養(yǎng)溫度為36 37°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟C中的測定波長為400nm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述原料奶是原料牛奶或原料羊奶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1 7所述的方法，其特征在于，顯色底物為紅四氮唑，微生物菌懸液 為嗜熱乳酸鏈球菌菌懸液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟D中，以測定時間為X軸，以吸收值 為Y軸，作每孔的微生物生長曲線；或者，直接采用軟件制作生長曲線。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，生長曲線分為三種類型陡峭型、中間 型、平緩型；陰性對照和品質(zhì)好的待測樣品為陡峭型生長曲線；陽性對照和品質(zhì)差的待測 樣品為中間型或平緩型生長曲線；空白對照為平緩型生長曲線。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速鑒別原料奶品質(zhì)的測定方法，其包括如下步驟對原料奶滅菌，保持其原有品質(zhì)的同時殺滅其中的微生物；向待測樣品和對照品分別添加顯色底物溶液和微生物菌懸液；實時掃描測定，利用酶標(biāo)儀，在一定的培養(yǎng)溫度和波長下，使用動力學(xué)測定模式進行測定；鑒別品質(zhì)以測定時間為X軸，以吸收值為Y軸，作微生物生長曲線，根據(jù)生長曲線鑒別原料奶樣品的品質(zhì)。使用本鑒別方法，能夠簡單、快速、高效地鑒別奶的品質(zhì)。
文檔編號C12R1/46GK101736072SQ20101010551
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者張菲菲, 徐寶梁, 楊海榮, 袁飛, 趙勇勝, 趙貴明, 陳穎 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院;袁飛