專利名稱：一種志賀氏菌的檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)食源性病原菌的方法，具體涉及一種志 賀氏菌的檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
志賀氏菌屬(Shigella)的細(xì)菌(通稱痢疾桿菌)，是細(xì)菌性痢疾的病原菌。臨 床上能引起痢癥狀的病原生物很多，有志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌、大腸桿菌等，還有阿 米巴原蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、以及病毒等均可引起人類痢疾，其中以志賀氏菌引起的細(xì)菌性痢疾最為常 見(jiàn)。人類對(duì)志賀氏菌有很高的易感性，在幼兒可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。目前，傳統(tǒng)志賀氏菌的常規(guī)檢驗(yàn)檢驗(yàn)程序樣品一增菌一分離培養(yǎng)(并作菌數(shù)測(cè) 定)一分離純化一革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應(yīng)試驗(yàn)/腸毒素檢查。整個(gè)檢 測(cè)程序復(fù)雜，步驟繁瑣，需要3 5d完成，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，檢出限為104CFU/mL。已經(jīng)愈來(lái)愈跟 不上人類對(duì)致病微生物微量、快速、簡(jiǎn)易、高特異性的鑒定要求。因此，在分子生物學(xué)水平上 來(lái)研究這些病原菌的核酸結(jié)構(gòu)和分子特征將對(duì)樣品中微量和非可培養(yǎng)狀態(tài)的病原微生物 進(jìn)行正確地鑒定非常適用，以大大提高對(duì)病原菌的檢測(cè)和研究能力。目前，在病原菌的分子 生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中，核酸擴(kuò)增法是最有效的方法之一。在食品病原菌檢測(cè)這一領(lǐng)域中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法是至今使用得最廣泛 的核酸擴(kuò)增方法，盡管它作為一種簡(jiǎn)便高效的基因擴(kuò)增技術(shù)在病原菌檢測(cè)中發(fā)揮著重大作 用，且具有操作簡(jiǎn)單易行的優(yōu)點(diǎn)，但在操作過(guò)程中必須有高精密的溫度循環(huán)裝置，從而使得 其在推廣應(yīng)用中難以在基層普及而受到限制。以檢測(cè)核酸為基礎(chǔ)的其他分子生物學(xué)技術(shù) 如核酸等溫?cái)U(kuò)增法(nucleic acidsequence-based amplification，NAS-BA)、自序列復(fù)制 法(self-sustained sequencereplication, 3SR)禾口鏈置換擴(kuò)i曾法(strand displacement amplification, SDA)等相繼出現(xiàn)。雖然它們的檢測(cè)靈敏度大大提高，但是它們對(duì)目標(biāo)序列 的擴(kuò)增特異性不強(qiáng)，使得擴(kuò)增后還需要詳盡的實(shí)驗(yàn)操作手段來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。而近年來(lái)，全 球流行病趨勢(shì)表明，致病微生物越來(lái)越以微小多變甚至是分子的形式穿越人類空間，難培 養(yǎng)、非可培養(yǎng)的病原微生物已經(jīng)成為傳染性和感染性疾病的主要根源。所以，及時(shí)將生物技 術(shù)發(fā)展的最新成果應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)，具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是2000 年Notomi等開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，利用4條不同的特異性引物識(shí)別靶基因 的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，靶 DNA序列大量交替重復(fù)產(chǎn)生，從而使靶基因高效擴(kuò)增，在15 60min擴(kuò)增數(shù)量級(jí)可達(dá)109， 特異性高，所有靶基因序列的檢測(cè)可只通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的有、無(wú)來(lái)判別。有、無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)是利 用熒光定量PCR儀檢測(cè)反應(yīng)的熒光強(qiáng)度或利用核酸擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀肉眼 來(lái)判定的。LAMP技術(shù)克服以往基因擴(kuò)增方法的不足，在等溫條件下能夠特異性、高效、快速 地進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，不需特殊的儀器，具有很多的優(yōu)越性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的食源性致病菌檢測(cè)程序復(fù)雜、步驟繁瑣 的問(wèn)題，提供一種操作步驟簡(jiǎn)單，可快速檢測(cè)出志賀氏菌的引物。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種使用上述引物檢測(cè)志賀氏菌的方法。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種志賀氏菌檢測(cè)用引物，可以擴(kuò)增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因?yàn)橹举R 氏菌的ipaH-GenBank，登錄號(hào)為M32063，所述引物與靶基因的1075 1267bp位的核酸序 列的片段或片段的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。本發(fā)明所述引物如SEQ ID N0:1 4所示，其中，序列為SEQ ID NO :1的引物擴(kuò) 增片段為1075 1093bp ；序列為SEQ ID NO 2的引物擴(kuò)增片段為1248 1267bp ；序列為 SEQ ID NO 3的引物擴(kuò)增片段為1135 1154bp的互補(bǔ)序列及1094 llllbp ；序列為SEQ ID NO 4的引物擴(kuò)增片段為1165 1184bp和1209 1227bp的互補(bǔ)序列。本發(fā)明利用上述引物對(duì)志賀氏菌進(jìn)行檢測(cè)的方法包括如下步驟(1)提取DNA作為模板；(2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系為模板2 u L、引物各1 ii L、Bst DNA聚合酶1 y L、 擴(kuò)增反應(yīng)液7. 5 12. 5 ii L，加水至25 ii L的反應(yīng)體系，63 65°C恒溫反應(yīng)1 1. 5h ；然后 置于80°C下2 lOmin，終止反應(yīng)；(3)結(jié)果觀察用肉眼觀察到檢測(cè)管出現(xiàn)渾濁為志賀氏菌陽(yáng)性，無(wú)渾濁為陰性；或 在檢測(cè)管中加入核酸染料，置于320nm紫外光下觀察，檢測(cè)管為綠色的是志賀氏菌陽(yáng)性，黃 色的是陰性；或取3 L反應(yīng)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖譜顯示有產(chǎn)物特征階梯狀 條帶的為志賀氏菌陽(yáng)性，反之為陰性。其中，步驟(2)中所述擴(kuò)增反應(yīng)液包括10X聚合酶反應(yīng)緩沖液、lOmmol/LdNTP、 150mmol/L MgS04，體積比為 2. 5 4 1。上述擴(kuò)增反應(yīng)液的配方，也可以是包括10 X聚合酶反應(yīng)緩沖液、lOmmol/LdNTP、 150mmol/L MgS04 和 5mol/L Betaine，其體積比為 2. 5 4 1 0. 5 5。作為一種優(yōu)選方案，步驟(3)中所述核酸染料為SYBR Green I、GoldvieW或EB替 代物。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明檢測(cè)方法步驟可以如下(1)被檢樣品的預(yù)處理將細(xì)胞懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，10000 12000r/min離心 2 3min，去掉上清，然后用無(wú)菌生理鹽水洗滌細(xì)胞2 3次，風(fēng)干；(2)模板的制備在上述得到的細(xì)胞樣品中加入50ii L ddH20,充分混勻后，于 100°C沸水浴lOmin，冰浴5min，4°C 12000r/min離心5min，上清液即為DNA模板；或者在上 述得到的細(xì)胞樣品中依次加入TE 567iiL，10wt% SDS30iiL和20mg/mL蛋白酶K 3 y L，于 37°C溫育 lh，加入 5mol/L NaCl 100 u L，CTAB/NaCl 溶液 80 y L，于 65°C溫育 lOmin,加入等 體積的氯仿/異戊醇，混勻，離心5min。上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新管并加等體積的酚/氯仿/異戊 醇，混勻，離心5min，上清液再轉(zhuǎn)入一只新管中，加入50 y L的醋酸鈉，lmL無(wú)水乙醇，輕輕混 勻，于_20°C下沉淀過(guò)夜，然后離心5min，棄上清，加入70wt%乙醇洗滌lmin，離心，棄上清， 將沉淀的DNA風(fēng)干完全后，溶于ddH20中；(3)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)取上述模板2 u L、引物各1 y L、BstDNA聚合酶1 μ L(8U)、擴(kuò)增反應(yīng)液7. 5 12. 5 μ L，加水至25 μ L的反應(yīng)體系，63 65°C恒溫反應(yīng)1 1. 5h ；然后置于80°C下2 lOmin，終止反應(yīng)；(4)結(jié)果觀察用肉眼觀察到反應(yīng)檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽(yáng)性，無(wú)渾濁為陰性；或 在各檢測(cè)管中加入1 2μ L的核酸染料后，置于320nm的紫外光下觀察，觀察到檢測(cè)管為 綠色者為陽(yáng)性，黃色者為陰性；或取3 5μ L的反應(yīng)物于2襯％的瓊脂糖凝膠，75V電泳 50 70min，電泳圖譜顯示LAMP產(chǎn)物的特征階梯狀條帶。
在檢測(cè)時(shí)，可以設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組為痢疾志賀氏菌基因 組DNA，陰性對(duì)照組為無(wú)菌去離子水。


圖1為SYBR Green I檢測(cè)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，1為陰性對(duì)照，2為陽(yáng)性對(duì)照，3為 志賀氏菌液；圖2為通過(guò)白色沉淀檢測(cè)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，其中，1為陰性對(duì)照，2為陽(yáng)性對(duì)照，3為 志賀氏菌液；圖3為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，其中，M為DL marker 2000，1為陰性對(duì)照，2為陽(yáng) 性對(duì)照，3為志賀氏菌液；圖4為L(zhǎng)AMP檢測(cè)志賀氏菌的靈敏度實(shí)驗(yàn)，其中，M為DL marker 2000,1為陰性對(duì) 照，2 為 1. 0X109cfu/mL ；3 為 1. O X 108cfu/mL ；4 為 1. O X 107cfu/mL ；5 為 1. O X 106cfu/mL ； 6 為 1. 0X105cfu/mL ；7 為 1. O X 104cfu/mL ；8 為 1. O X 103cfu/mL ；9 為 1. O X 102cfu/mL ；10 為 1. OX IO1CfuAiL ； 11 為 1. Ocfu/mL ； 12 為 0. 10cfu/mL。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1利用環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)志賀氏菌，按照以下步驟進(jìn)行(1)被檢樣品的預(yù)處理將被檢樣品懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，lOOOOr/min離心3min，去掉上清，然后用無(wú) 菌生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，風(fēng)干；(2)模板的制備在上述得到的細(xì)胞樣品中加入50 μ L ddH20,充分混勻后，于100°C沸水浴lOmin， 冰浴5min，4°C 12000r/min離心5min，上清液即為DNA模板。(3)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)取上述模板2yL、引物各lyL、Bst DNA聚合酶1 μ L(8U)、擴(kuò)增反應(yīng)液7. 5 12. 5 μ L，加水至25 μ L的反應(yīng)體系，65°C恒溫反應(yīng)1. 5h ；然后置于80°C下lOmin，終止反應(yīng)。所用引物如SEQ ID NO :1 4所示。所用擴(kuò)增反應(yīng)液為10mmol/L dNTP 4μ L, 10 X 聚合酶反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ L，150mmol/L MgSO4I μ L, 5mol/L Betaine 5 μ L。所用陽(yáng)性對(duì)照為志賀氏菌基因組DNA，陰性對(duì)照液為無(wú)菌去離子水。
(4)結(jié)果觀察用肉眼觀察到反應(yīng)檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽(yáng)性，無(wú)渾濁為陰性。
實(shí)施例2從食品樣品中檢測(cè)志賀氏菌，按以下步驟進(jìn)行(1)被檢樣品的預(yù)處理取樣品25g加入到225mL的GN增菌液中，于組織搗碎機(jī)中勻漿，制成勻漿液。將 此勻漿液10倍倍比稀釋，各取ImL為樣品。(2)模板的制備將上述樣品分別于100°C沸水浴IOminJKS 5min，4°C 12000r/min離心5min，上 清液即為DNA模板。(3)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)取上述模板2 μ L、引物各1 μ L、Bst DNA聚合酶1 μ L(8U)、擴(kuò)增反應(yīng)液7. 5 μ L，加 水至25 μ L的反應(yīng)體系，63°C恒溫反應(yīng)Ih ；然后置于80°C下2min，終止反應(yīng)。所用引物如SEQ ID NO :1 4所示；所用擴(kuò)增反應(yīng)液為10mmol/L dNTP 4 μ L，IOX 聚合酶反應(yīng)緩沖液2. 5 μ L，150mmol/L MgSO4 1 μ L。所用陽(yáng)性對(duì)照為志賀氏菌基因組DNA，陰性對(duì)照液為無(wú)菌去離子水。(4)結(jié)果觀察在各檢測(cè)管中加入1 μ L的核酸染料后，置于320nm的紫外光下觀察，觀察到檢測(cè) 管為綠色者為陽(yáng)性，黃色者為陰性。
權(quán)利要求
一種志賀氏菌的檢測(cè)用引物，其特征在于所述引物與志賀氏菌ipaH基因的1075～1267bp位的核酸序列的片段或片段的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述志賀氏菌的檢測(cè)用引物，其特征在于所述引物序列如SEQID NO 1 4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述志賀氏菌的檢測(cè)用引物，其特征在于序列為SEQIDN0:1的引 物擴(kuò)增片段為1075 1093bp ；序列為SEQ ID NO 2的引物擴(kuò)增片段為1248 1267bp ；序 列為SEQ ID NO 3的引物擴(kuò)增片段為1135 1154bp的互補(bǔ)序列及1094 llllbp ；序列 為SEQ ID NO 4的引物擴(kuò)增片段為1165 1184bp和1209 1227bp的互補(bǔ)序列。
4.使用權(quán)利要求1 3中任意一條權(quán)利要求所述引物檢測(cè)志賀氏菌的方法，其特征在 于包括如下步驟(1)提取DNA作為模板；(2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系為模板2yL、引 物各1 P L、Bst DNA聚合酶1 y L、擴(kuò)增反應(yīng)液7. 5 12. 5 ii L，加水至25 y L的反應(yīng)體系， 63 65°C恒溫反應(yīng)1 1. 5h ；然后置于80°C下2 lOmin，終止反應(yīng)；(3)結(jié)果觀察用肉 眼觀察到檢測(cè)管出現(xiàn)渾濁為志賀氏菌陽(yáng)性，無(wú)渾濁為陰性；或在檢測(cè)管中加入核酸染料，置 于320nm紫外光下觀察，檢測(cè)管為綠色的是志賀氏菌陽(yáng)性，黃色的是陰性；或取3 5yL反 應(yīng)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖譜顯示有產(chǎn)物特征階梯狀條帶的為志賀氏菌陽(yáng)性，反之 為陰性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測(cè)志賀氏菌的方法，其特征在于步驟(2)中所述擴(kuò)增反 應(yīng)液包括10X聚合酶反應(yīng)緩沖液、10mmol/L dNTP、150mmol/L MgS04，三者的體積比為 2 5 4 1 o
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測(cè)志賀氏菌的方法，其特征在于步驟(2)中所述擴(kuò)增反應(yīng)液 包括 10X 聚合酶反應(yīng)緩沖液、10mmol/L dNTP、150mmol/L MgS04 和 5mol/L Betaine，其體 積比為 2. 5 4 1 0. 5 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測(cè)志賀氏菌的方法，其特征在于步驟(3)中所述核酸染料為 SYBR Green I、Goldview 或 EB 替代物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種志賀氏菌的檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法。本發(fā)明志賀氏菌的檢測(cè)用引物的序列如SEQ ID NO1～4所示。本發(fā)明志賀氏菌的檢測(cè)方法包括如下步驟(1)提取DNA作為模板；(2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系為模板2μL、引物各1μL、Bst DNA聚合酶1μL、擴(kuò)增反應(yīng)液7.5～12.5μL，加水至25μL的反應(yīng)體系，63～65℃恒溫反應(yīng)1～1.5h；然后置于80℃下2～10min，終止反應(yīng)；(3)結(jié)果觀察用肉眼觀察到檢測(cè)管出現(xiàn)渾濁為志賀氏菌陽(yáng)性，無(wú)渾濁為陰性。本發(fā)明利用引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)來(lái)檢測(cè)志賀氏菌，不需要特殊設(shè)備，可快速檢測(cè)樣品中的痢疾志賀氏菌基因，具有特異性、靈敏度高，鑒定方法簡(jiǎn)易的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101845493SQ20101010574
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者廖振林, 方祥, 王麗, 鐘青萍, 陳紅遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)