專利名稱：：麻瘋樹胚胎發(fā)育后期豐富蛋白編碼序列及其在植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地，本發(fā)明涉及一種在麻瘋樹中表達的LEA蛋白(胚胎發(fā)育后期豐富蛋白，lateembryogenesisabundantprotein,LEA)及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：干旱脅迫是植物尤其是經(jīng)濟作物種植栽培的主要限制因子之一。在植物的各種干旱應(yīng)答機制中，策略之一是在缺水期間植物細胞積累一系列的蛋白質(zhì)來減少細胞的脫水(孫立平，李德全.LEA蛋白的分子生物學(xué)研究進展，生物技術(shù)通報，2003,6:5_13)。盡管已有文獻報道從植物中分離了大量抗逆相關(guān)基因(Thomashow等，PlantcoldacclimationFreezingtolerancegenesandregulatorymechanisms.Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.1999,50:571_599；Shinozaki等，Molecularresponsestodehydrationandlowtemperature!differencesandcross-talkbetweentwostresssignalingpathways.Curr.Opin.PlantBiol.2000,3(3):217_223)。但這些基因遠遠不能滿足植物抗逆遺傳工程的應(yīng)用。胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(lateembryogenesisabundantprotein,LEA)是一類胚胎發(fā)生晚期豐富表達蛋白并且受逆境誘導(dǎo)(Himdertmark等，LEA(lateembryogenesisabundant)proteinsandtheirencodinggenesinArabidopsisthaliana.BMCGenomics.2008,9118).在植物耐寒、耐鹽堿、耐干旱性方面起重要作用。LEA蛋白相對分子質(zhì)量較小，約10，000-30,000D,具有很強的親水性和熱穩(wěn)定性，即使在煮沸條件下也能保持水溶狀態(tài)。這種高度親水性有利于LEA蛋白在植物受到干旱失水時把足夠的水分捕獲到細胞內(nèi)，從而保護細胞免受水分脅迫的傷害。LEA基因已從一些植物如小麥中被分離出來并且用于植物抗逆遺傳的改良(Xu等，Expressionofalateembryogenesisabundantproteingene,HVAI,frombarleyconferstolerancetowaterdeficitandsaltstressintransgenicrice.PlantPhysiol.1996，110:249_257)。LEA的種類繁多，根據(jù)氨基酸序列的同源性和一些特殊的基元序列，將LEA蛋白分為6組第一組是LEAD19，具有多拷貝串聯(lián)的20個氨基酸殘基組成的保守序列；第二組是LEAD11，也稱為脫水素；第三組是LEAD7，包含保守的酪氨酸磷酸化位點和11氨基酸的重復(fù)序列；第四組是LEAD113，這類蛋白含有一個比較保守的N末端區(qū)域；第五組是LEAD29，該組蛋白與第三組類似，但缺乏高度的殘基專一性；第六組是LEAD95。不同類型的LEA蛋白的功能存在差異。以前的研究僅限于以第三組LEA為研究體系獲得的結(jié)果。因此從現(xiàn)有的耐旱性強的植物中篩選新的抗旱相關(guān)基因并且應(yīng)用于植物抗逆遺傳的改良仍是現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)發(fā)展的迫切需要。麻瘋樹又稱小桐子、臭油桐，屬于大戟科麻瘋樹屬，是一種落葉灌木或小喬木。麻瘋樹耐旱性強，是干旱地區(qū)理想的造林樹種。野生麻瘋樹主要分布干熱的亞熱帶和潮濕的熱帶雨林，可在年降水量480-2380mm，年均溫18.0-28.5°C的環(huán)境下生存，通常生于海拔700-1600m的平地、丘陵、坡地及河谷荒山坡地。在我國主要分布在四川、云南、廣東、廣西、貴州、福建、臺灣和海南等地。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的麻瘋樹LEA蛋白序列及其核酸序列。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的麻瘋樹LEA基因(屬于第五組LEA基因)，該基因是一個麻瘋樹LEA蛋白基因。本發(fā)明的第二目的是提供一種新的麻瘋樹蛋白LEA。本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述新的麻瘋樹LEA蛋白和核酸序列的方法。本發(fā)明的進一步目的是提供該麻瘋樹LEA蛋白多肽和編碼序列在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制植物干旱耐受上的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有麻瘋樹LEA蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位DNA分子的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的麻瘋樹LEA蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多膚、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDN0.2序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是酵母細胞、擬南芥和和其它植物細胞。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有麻瘋樹LEA蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其步驟如下(1)將編碼具有麻瘋樹LEA蛋白活性多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成麻瘋樹LEA蛋白表達載體，所述的核昔酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入原核宿主細胞，形成麻瘋樹LEA蛋白的重組細胞；(3)在適合表達麻瘋樹LEA蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有麻瘋樹LEA蛋白活性的基本純的多肽。較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.1中第59-820位的序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有麻瘋樹LEA蛋白活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物對干旱的耐受性的方法，其步驟如下(1)將編碼具有麻瘋樹LEA蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達調(diào)控序列，形成含麻瘋樹LEA蛋白基因的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達載體的農(nóng)桿菌同真核宿主細胞共培養(yǎng)，在22-28°C條件下，暗培養(yǎng)1-2天后，通過篩選如抗生素篩選，獲得含有麻瘋樹LEA蛋白基因的轉(zhuǎn)化細胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。含有麻瘋樹LEA蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株對植物干旱耐受特性具有增強的作用。較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQIDNo.1中第59-820位的序列。本發(fā)明還提供了與LEA蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體，它包括多克隆抗體和單克隆抗體。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基木純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA.或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語“麻瘋樹胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有麻瘋樹胚胎發(fā)育后期豐富蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第59-820位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.1序列的編碼框第59-820位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.1中第59-820位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的麻瘋樹LEA蛋白相同功能的蛋白的SEQIDNO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。在本發(fā)明中，術(shù)語“麻瘋樹LEA蛋白或多肽”指具有麻瘋樹LEA蛋白活性的SEQIDN0.1序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然麻瘋樹LEA蛋白相同功能的SEQIDN0.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括麻瘋樹LEA蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的麻瘋樹LEA蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊條件下能與麻瘋樹LEA蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用麻瘋樹LEA蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，“麻瘋樹LEA蛋白保守性變異多肽”指與SEQIDNO.1的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。發(fā)明還包括麻瘋樹LEA蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然LEA蛋白多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的麻瘋樹LEA蛋白多肽時，可以將麻瘋樹LEA蛋白編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成麻瘋樹LEA蛋白表達載體。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、擬南芥細胞和其它植物細胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析麻瘋樹LEA蛋白基因產(chǎn)物的表達，即分析麻瘋樹LEA蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物在細胞中的存在與否和數(shù)量。麻瘋樹LEARNA的Northern印跡分析和麻瘋樹LEA特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實麻瘋樹LEA在生物樣本中的表達。此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有麻瘋樹LEA蛋白核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼麻瘋樹LEA蛋白的核酸分子。本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在麻瘋樹LEA蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于麻瘋樹LEA蛋白核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的麻瘋樹LEA蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選麻瘋樹LEA蛋白同源基因或同源蛋白。為了得到與麻瘋樹LEA蛋白基因相關(guān)的麻瘋樹cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選麻瘋樹cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對麻瘋樹LEA蛋白的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自麻瘋樹的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，PaloAlto,Cal.。這種篩選方法可以識別與麻瘋樹LEA蛋白的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的麻瘋樹LEA蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進行連接而獲得編碼本發(fā)明麻瘋樹LEA蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變弓I入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid—PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.，SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149_2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的麻瘋樹LEA蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與麻瘋樹LEA蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。本發(fā)明的麻瘋樹LEA蛋白基因可通過基因工程技術(shù)用來提高經(jīng)濟植物的抗旱性能，在全球水資源日趨緊缺的情況下，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用前景。表2為本發(fā)明的麻瘋樹LEA與擬南芥(Arabidopsisthaiiana)LEA的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。表3為本發(fā)明的麻瘋樹LEA蛋白的氨基酸序列與擬南芥(A.thaiiana)LEA的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，相似的氨基酸用“+”標出。表2麻瘋樹LEA蛋白的核酸序列與擬南芥LEA蛋白的核酸序列的同源比較圖67%identityin331ntoverlapQuery483CCGCAGGAGACAAACCAATTGATCAAAGCGACGCCGCTGCTATAAAAGCTGCAGAGGTGA542MilIIIlllllllΙllllllllllllIlIlIlNilIlllllSbjct548COGCTGGMACMACOGGTGGATCMAGCGAOGCAGCAGCGATTCMGCGGCAGAGGTTA607Query543GAGCTCTTOGCAGTACTCMACCCOGGCGGGTGGMTAGGCGCAGMGCACAGTOGGCAG602INIIIIIlIIIIlllllllIIIIIlIlIlIIISbjct608GAGCTTGTGGCACTMTGTGATTGCTCCTGGTGGMTOGCOGCTTCTGCTCMTCAGCAG667Query603CTGATOGTAA——TACCAGAGTTATGCTOGAOGMGATMGACTACCCTCTCTGATGTTT659IINNINIlIIlIlIIIIIIIIlllllllSbjct668CAAATCACAAOGCTACCATAGACOGTGATGAGGATAAAATCAAGCTCATTGATGTTT724Query660TAGCGGAOGCGACTGCCMGTTGCCTAGAGACMGAOGGTMCTOGGGATGATGCTGMG719IINIINIIIIIIIIIlIIlIlIlIIlIlSbjct725TGGCGGGTGCGACOGGGMGTTAGCOGCAGATMAGCTGTGACCAGGCAGGAOGCAGAGG784Query720GTGTGATTGGAGCGGMATMGMACMACCTMTATGAGGACTAOGCCTGGTGGAGTTG779IINIINNININΝΙΝΙIlIIIIlllllSbjct785GAGTGGTGAGCGCTGAGCTGAGGMCMTCCTMTTTGTCTACTCACCCTGGTGGTGTAG844Query780CTGCTTCTGTGGCTGCAGCTGCTAGGCTTAA810IINIIIlllIllllllllllSbjct845CGGCTTCTATTACTGCCGCCGCTAGGCTTAA875Query麻瘋樹LEA的核酸序列Sbjct擬南芥LEA的核酸序列(NM_113148)表3麻瘋樹LEA蛋白的氨基酸序列與擬南芥LEA蛋白的氨基酸序列的同源比較圖Identities=149/262(56%),Positives=182/262(69%),Gaps=14/262(5%)Query1MSQG-QPRRTQYDQEPIKYGDVFNVGGDVASQPIAPVDAANMQSAESQVLGEPQRGGPAS59MSQQP+RQEP+YGDVFVG++A+PIAPDAMQ+AE++VGQ+GGA+Sbjct1MSQEEQPKRPQ—■EPVTYGDVFEVSGELADKPIAPEDANMMQAAETRVFGHTQKGGAAA57Query60VMQSAANVNVRTGAVERDDVSDWREQGINVAEIDIGGTRVITEKVGGEWGQYVQPRVP119VMQSAANRGVD+D+E+G+VA+D+GRVTEVGG+WGQYV+PRSbjct58VMQSAATANKRGGFVHPGDTTDLAAERGVTVAQTDVPGARVTTEFVGGQWGQYVEPRPV117Query120ATYP---MPGMD——IIMGEALEATAYSAAGDKPIDGSDAAAIKAAEVRALRSTQTP170AT+G+IT+GEALEAT+AG+KP+DQSDAAAI+AAEVRA+Sbjct118ATAAAMEAEWGLSLQSAIIGEALEATVQTA-GNKPVDQSDAAAIQAAEVRAOGTNVIA176Query171AGGIGAEAQSAADRNTRVfflDEDKTTLSDVLADATAKLPRDKTVTRDDAEGVIGAEIRNK230GGIAAQSAA+N+DEDKLDVLAATKLDKVTRDAEGV+AE+RNSbjct177PGGIMSAQSAANHNATIDRDEDKIKLIDVLAGATGKLMDKAVTRQDAEGWSAELRNN236Query231P匪RTTPGGVAASVAAAARLNQ252PN+TPGGVAAS+AAARLN+Sbjct237PNLSTHPGGVAASITAAARLNE258Query麻瘋樹LEA氨基酸序列Sbjct擬南芥LEA氨基酸序列(GenBankAccessionNo.NP_188888)圖1是麻瘋樹LEA蛋白的結(jié)構(gòu)域圖。具體實施例方式下面結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1麻瘋樹LEA蛋白基因的克隆1.組織分離(isolation)麻瘋樹種子來源于四川省攀枝花地區(qū)，麻瘋樹種子采集后，放在實驗室保存。2.RNA的分離(RNAisolation)將麻瘋樹種子的種皮剝掉，取出種仁，用研缽研碎，加入液氮后，研磨成粉后，取IOOmg移至1.5mLEP管中，抽提總RNA(兩步裂解法)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。3.基因的全長克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據(jù)一些植物LEA的氨基酸保守序列，設(shè)計兼并引物，利用同源性基因克隆原理，SMARTTMRACEcDNA擴增方法(Clonetech試劑盒)進行cDNA全長克隆，分四個階段進行(1)核心序列的克隆PCR(JcLEAF+JcLEAR)得到LEA-1(383bp)，回收，連接到pMD_18T載體上，用M13F或M13R作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知的模式植物擬南芥等的LEA基因的同源性很高，故初步認為它是一個LEA基因。(2)3，-RACE根據(jù)核心序列的擴增的結(jié)果，設(shè)計兩個正向特異引物(JcLEAFl和JcLEAF2)。采用二次PCR擴增方法進行。第一次PCR(JcLEAFl+AP)得到PCR產(chǎn)物，稀釋100倍后，用其做模板，進行第二次PCR(JcLEAF2+AP)，得到JcLEA_3(361bp)，回收，連接，測序過程同(1))。(3)5，-RACE根據(jù)核心序列的擴增的結(jié)果，設(shè)計兩個反向特異引物(JcLEARl和JcLEAR2)。采用二次PCR擴增方法進行。第一次PCR(JcLEARl+UPM)得到PCR產(chǎn)物，稀釋100倍后，用其做模板，進行第二次PCR(JcLEAR2+NUP)，得到JcLEA_5(716bp)，回收，連接，測序(過程同(1))。(4)編碼序列的克隆將5’RACE測序結(jié)果與3’RACE測序結(jié)果比對并進行拼接，得到全長片段序列信息，并設(shè)計一對特異引物進行JcLEA編碼區(qū)(JcLEAful1-F+JcLEAfull-R)PCR擴增，得到JcLEA編碼區(qū)(762bp)(過程同(D)0通過組合使用上述4種方法，獲得了候選的麻瘋樹LEA蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進一步設(shè)計引物JcLEAfull-F:5，-ATGAGCCAGGGGCAACCACGAAGAA-3，(SEQIDN0.3)為正向引物，寡核苷酸JcLEAfull-R5，-TTATGGGTTCTGATTAAGCCTAGCAGCTGC-3，(SEQIDNO.4)為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，PCR條件為94°C5分鐘，隨之以94°C1分鐘、58°C1分鐘和72°C2分鐘進行35個循環(huán)，最后以72°C延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增片段長度為762bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產(chǎn)物進行克隆、測序，獲得SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的序列。實施例2麻瘋樹LEA蛋白基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的麻瘋樹LEA蛋白全長cDNA的長度為1070bp，詳細序列見SEQIDNO.1,其中開放讀框位于59-820位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出麻瘋樹LEA蛋白的氨基酸序列，共254個氨基酸殘基，分子量26454.62，pi為4.64。詳細序列見SEQIDNO.2。將麻瘋樹LEA蛋白的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與擬南芥LEA蛋白(NM_113148)在核苷酸水平上具有67%的同源性(見表2)；在氨基酸水平上，它與擬南芥LEA(NP_188888)有56%的相同性和69%的相似性(見表3)。由此可見，麻瘋樹LEA蛋白與擬南芥LEA蛋白無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認為麻瘋樹LEA蛋白在功能上也相似。實施例3麻瘋樹LEA蛋白的結(jié)構(gòu)和類型預(yù)測1.麻瘋樹LEA蛋白的結(jié)構(gòu)域分析將麻瘋樹LEA蛋白的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中檢索結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如附圖1所示。(1)在氨基酸序列中，存在以下結(jié)構(gòu)域區(qū)加框區(qū)(即序列表中SEQID.1自氨基端(N端)第14-72位氨基酸殘基，129-190,第193-254位氨基酸殘基)。該加框區(qū)組成SMP成熟蛋白功能模塊(Seedmaturationprotein,SMP)。(2)功能分析在該基因氨基酸序列中存在種子成熟蛋白功能模塊，因而可預(yù)見其的確具有相應(yīng)功能。2.麻瘋樹LEA蛋白的分類預(yù)測將麻瘋樹LEA蛋白的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，所推斷的麻瘋樹JcLEA蛋白序列與其它植物的第五組LEA蛋白序列的有較高的相似性。與陸地棉LEAD-34(Gossypiumhirsutum)(GenBank登錄號為P09444)，擬南芥ATECP31(Arabidopsisthaliana)(NP_188889)，胡蘿卜ECP31(Daucuscarota)(BAD86645)，苜蓿LEA(Medicagotruncatula)(ABB16353)，大豆PM24(Glycinemax)(AAF21310)，玉米D_34(Zeamays)(ACG48700)基因的氨基酸序列的一致性(或相似性)分別為61%(76%),59%(68%57%(72%),57%(71%),57%(68%)和54%(69%)。棉花中的D34、胡蘿卜的ECP31和擬南芥的AtEC31均屬于第五組LEA蛋白序列，因此推測麻瘋樹LEA蛋白也為第五組LEA蛋白序列。實施例4麻瘋樹LEA蛋白在酵母中進行真核表達及功能評價在該實施例中，將全長的麻瘋樹LEA蛋白編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的酵母表達載體之中，通過其在酵母中過量表達，對其抗旱性作出功能評價。酵母表達載體的構(gòu)建，以及酵母的轉(zhuǎn)化。根據(jù)麻瘋樹LEA蛋白的氨基酸序列，設(shè)計蛋白編碼區(qū)的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這根據(jù)選用的PYES2載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將麻瘋樹LEA蛋白基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至PYES2載體(Invitrogen)。鑒定好的表達載體利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303(ura3-l,can-1-100,leu2~3,112trpl-l,his3_ll，15)，篩選鑒定得到含有PYES2-LEA蛋白表達載體的工程菌W303-pYES2-LEA。野生酵母W303的培養(yǎng)，繼代用YPD培養(yǎng)基(1%酵母浸提液，2%蛋白胨，2%葡萄糖，pH5.8)。轉(zhuǎn)化了pYES2-LEA及空載pYES2的W303的培養(yǎng)，繼代用SD_ura培養(yǎng)基(Difco，尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基)。各種脅迫處理時的培養(yǎng)基用YPGAL(1%酵母浸提液，2%蛋白胨，2%半乳糖，pH5.8)加相應(yīng)的脅迫劑。酵母RNA提取及Northern雜交分析a)W303-pYES2-LEA在SD_ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到OD6tltl達到0.7，部分培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到Y(jié)PD或YPGAL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。b)24h后，0D_達到2.0，8000rpm離心5min，收集菌體。將細胞懸浮于400μ1AE緩沖液(50mMSodiumAcetate,IOmMEDTA調(diào)整pH值至5.2)。c)加入1/10體積的10%SDS，充分混合。加入等體積在65°C預(yù)熱的酸性酚(pH4.5)，混合后65°C加熱5min，冰上放置lOmin。d)在室溫下8000rpm離心IOmin。e)取水相，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25241)，IOOOOrpm離心8min。f)取水相，加入等體積氯仿/異戊醇(49DlOOOOrpm離心8min。g)加入1/10體積3MpH5.2的醋酸鈉，2.5倍體積的純乙醇，_20°C過夜沉淀。h)沉淀樣品于4°C離心5min，去除液體。i)在冰上干燥RNA(放置15min)，最后用適量DEPC水溶解RNA。j)30μg總RNA經(jīng)112%瓊脂糖變性膠電泳后轉(zhuǎn)到Hybond-N+尼龍膜用于Northern雜交分析。全長LEAcDNA用a-32P-dCTP標記后做探針進行雜交。雜交膜第1次在含2XSSC,0.1%SDS洗膜液中45°C，漂洗15min；然后轉(zhuǎn)入1XSSC，0.1%SDS的洗膜液45°C漂洗5min。雜交膜上殘液用濾紙吸干后，用保鮮膜包裹。將膜置于磷屏中進行放射自顯影(AmershamPharmacia)。k)Northern雜交表明麻風樹LEA蛋白在酵母中可被誘導(dǎo)表達。含半乳糖的YPGal培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白的表達量比不含半乳糖的YPD培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達量高，而野生轉(zhuǎn)空載pYES2的酵母則在兩種培養(yǎng)基中均檢測不到雜交信號，表明構(gòu)建的PYES2-LEA表達載體可在酵母中很好表達麻瘋樹LEA蛋白，且不會有酵母自身的LEA類似蛋白的干擾。NaCl、KCl、山梨醇處理及酵母生長量測定W303-pYES2-LEA在SD-ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長ld，OD6tltl達到0.2，20μL培養(yǎng)物接種至lj2mLYPGAL+NaCl(0-1.4mol/L)系列濃度，YPGAL+KC1(0-1.4mol/L)系列濃度，YPGAL+山梨醇(0-2.2mol/L)系列濃度培養(yǎng)基中，30°C，250rpm，培養(yǎng)48h后測定600nm吸光值。每項實驗都設(shè)3個重復(fù)。以轉(zhuǎn)空載pYES2的酵母為對照，用NaCl、KC1、山梨醇系列濃度梯度分析了轉(zhuǎn)PYES2-LEA酵母的生長狀況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PYES2-LEA的酵母能顯著改進細胞的耐逆性，表現(xiàn)為高于0.8mol/LNaCl,0.8mol/LKCl，1.4mol/L山梨醇脅迫時，轉(zhuǎn)pYES2_LEA酵母生長量的下降程度明顯滯后于對照(轉(zhuǎn)空載PYES2)。說明麻瘋樹LEA在酵母中過量表達，改善了酵母在離子和滲透脅迫下的生長狀態(tài)或提高了存活率。實施例5麻瘋樹LEA蛋白在擬南芥中進行表達及轉(zhuǎn)基因植物抗旱性檢測含目的基因(麻瘋樹LEA蛋白基因)的表達載體的構(gòu)建。根據(jù)麻瘋樹LEA蛋白的全長序列(SEQIDNO.1)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將麻瘋樹LEA蛋白基因cDNA克隆至中間載體(如PMD18-T)，進一步克隆到雙元表達載體(如pHB)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好表達載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。利用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥擬南芥無菌培養(yǎng)a)擬南芥無菌培養(yǎng)超凈臺上將種子在20%漂水洗滌lOmin，無菌水沖洗4次。然后用0.Triton滅菌，顛倒混勻18min，無菌水沖洗4次；b)MS培養(yǎng)基先倒平板下層，吹干后，把消毒后的種子分裝后用40-50°C的MS培養(yǎng)基混勻，倒入平板中，均勻地鋪滿一層(小培養(yǎng)皿大約需要4-5ml培養(yǎng)基)；c)平皿封口，4°C冰箱內(nèi)春化3-5d，放入到人工氣候室中開始萌發(fā)生長。植物生長環(huán)境為相對濕度60%；恒溫20-22°C；光照周期24h；光照強度為80-220μm0l/m2/sec。擬南芥土壤種植a)浸土把土裝入到種植盆中至距盆口約2cm處，用花無缺復(fù)合肥(N、P、K=20%,20%,20%)，完全浸透；b)移栽選取MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)生長7-10d，健壯、生長一致的苗移栽到事先用花無缺浸過的培養(yǎng)土中，其上覆蓋保鮮膜，轉(zhuǎn)入22°C，24h連續(xù)光照的人工氣候室中培養(yǎng)，到苗生長正常后揭去。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法對擬南芥的轉(zhuǎn)化a)培養(yǎng)在土壤中的擬南芥在蛭石培養(yǎng)基中(1/3XMS培養(yǎng)液澆灌)以(22士2)°C，相對濕度70%，光照16h的生長條件培養(yǎng)至莖高3-lOcm時，去其頂生花序，刺激腋生花序的生長。b)繼續(xù)生長7-9d后，將農(nóng)桿菌按密度IXIOVmL接種于ILLB液體培養(yǎng)基中(含50μg/mL的利福平和卡那霉素)；28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至0D_為1.2-1.8；收集菌體，重懸于IL轉(zhuǎn)化液(50mLMS營養(yǎng)液；5%蔗糖；1XVb5有機培養(yǎng)基ImL；0.044mol/L6-BA；50μLSilwet-77；用0.4mol/LNaOH調(diào)pH至5.8)中。c)將準備好的植株倒置于含轉(zhuǎn)化緩沖液的玻璃瓶中，抽真空，維持0.05MPa壓力5min。d)取出種植盆，避光側(cè)放24h，然后將種植盆直立。e)按常規(guī)的方法培育植株至結(jié)實，收獲成熟種子(Ttl代)。轉(zhuǎn)基因擬南芥微量DNA提取及陽性植株的篩選a)將種子置于75%乙醇中消毒5min，15%漂白劑中消毒lOmin，無菌水沖洗3-5遍，均勻散布于含50μg/mL卡那霉素和250μg/mL頭孢霉素的MS選擇培養(yǎng)基(1XMS大量；IXVb5微量元素培養(yǎng)基；IX鐵鹽；IXVb5有機培養(yǎng)基；IOOmg肌醇；3%蔗糖；瓊脂粉7.8g,pH5.8)上(平均1000-2000粒種子/皿)。置22°C光照16h培養(yǎng)。b)生長一周后挑選綠色陽性植株轉(zhuǎn)至正常的MS培養(yǎng)基中，1Od后轉(zhuǎn)入蛭石中培養(yǎng)。c)取少量轉(zhuǎn)基因植株葉片，剪碎，置研缽中，加入ImL提取緩沖液(1OOmmol/LTris·Cl(pH8.0)，20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS)，研磨成漿。d)吸入1.5mLEP管中，劇烈搖動混勻。e)60°C水浴保溫30_60min，不時顛倒混勻。f)室溫下1OOOOrpm離心5min。g)小心吸上清于新的離心管中，加入等體積氯仿，劇烈震動。h)室溫下1OOOOrpm離心5min。i)小心將上清吸入新的離心管中。j)加入1倍體積異丙醇，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。8OOOrpm離心5min，棄掉上清；75%酒精洗一次，晾干沉淀。k)力口入5yLRNaseAdOyg/μL),37°ClOmin，除去RNA。1)力口50-100μ1水融解，-20°C貯存。m)提取出的DNA為模板，以表達載體自帶HYG基因引物及LEA基因特異性引物分別進行PCR反應(yīng)，鑒定目的基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組中的表達狀況。含麻瘋樹LEA基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性鑒定將含有50μg/mL卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選出的陽性轉(zhuǎn)基因植株(5_6片葉)以及對照植株幼苗分別轉(zhuǎn)到含有O、10%、15%濃度的PEG4000和含0、0.8%、1.5%濃度的NaCl的MS培養(yǎng)基上，(22士2)°C，相對濕度70%，光照16h的條件下培養(yǎng)，15d后觀察植株的生長情況K并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，在1.5%濃度的NaCl脅迫下，野生和轉(zhuǎn)基因擬南芥分化和生長情況沒有區(qū)別，均死亡。但在0.8%濃度的NaCl脅迫下，它們的分化和生長情況差異明顯，野生擬南芥均呈萎蔫態(tài)，而轉(zhuǎn)基因擬南芥長勢良好(3次重復(fù)均有一致結(jié)果)。同樣，在含10%、15%的PEG4000的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥的長勢明顯優(yōu)于對照種K兩者的分化和生長情況差異明顯。提示麻瘋樹LEA基因編碼的蛋白可能在植物水分調(diào)節(jié)方面有重要作用。本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下<110>復(fù)旦大學(xué)<120>麻瘋樹LEA蛋白編碼序列<160>2<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1070<212>DNA<213>麻瘋樹(JatrophacarcasL.)<220><221>CDS<222>(59)..(820)<223><400>1ACGCGGGAACAGAGGTGGCCACTGCAATCACCGCTTGAGTTTTGAGAAGAAGTAAAAAATGAGCCAGGGGCAACCACGAAGAACTCAATACGACCAGGAGCCAATCMetSerGlnGlyGlnProArgArgThrGlnTyrAspGlnGluProlie151015AAATACGGCGATGTGTTTAATGTCGGAGGCGATGTCGCCTCCCAGCCGLysTyrGlyAspValPheAsnValGlyGlyAspValAlaSerGlnPro202530ATTGCACCAGTAGACGCTGCTAACATGCAGTCTGCTGAGAGCCAAGTClieAlaProValAspAlaAlaAsnMetGlnSerAlaGluSerGlnVal354045CTTGGAGAGCCTCAGAGAGGCGGCCCTGCCTCAGTCATGCAATCTGCGLeuGlyGluProGlnArgGlyGlyProAlaSerValMetGlnSerAla505560GCAAACGTCAACGTTAGGACTGGTGCCGTCGAGCGGGATGATGTGAGTAlaAsnValAsnValArgThrGlyAlaValGluArgAspAspValSer65707580GATGTTGTTAGAGAACAGGGCATTAACGTTGCTGAAATAGATATCGGCAspValValArgGluGlnGlylieAsnValAlaGlulieAsplieGly859095GGCACTCGCGTTATCACAGAGAAAGTCGGTGGAGAGGTTGTGGGACAAGlyThrArgVallieThrGluLysValGlyGlyGluValValGlyGln100105110TATGTTCAGCCAAGAGTTCCAGCGACATATCCAATGCCAGGTATGGATTyrValGlnProArgValProAlaThrTyrProMetProGlyMetAsp115120125ATTACAATGGGTGAAGCTTTAGAGGCAACTGCTTATTCTGCCGCAGGAlieThrMetGlyGluAlaLeuGluAlaThrAlaTyrSerAlaAlaGly130135140GACAAACCAATTGATCAAAGCGACGCCGCTGCTATAAAAGCTGCAGAGAspLysProlieAspGlnSerAspAlaAlaAlalieLysAlaAlaGlu145150155160GTGAGAGCTCTTCGCAGTACTCAAACCCCGGCGGGTGGAATAGGCGCAValArgAlaLeuArgSerThrGlnThrProAlaGlyGlylieGlyAla165170175GAAGCACAGTCGGCAGCTGATCGTAATACCAGAGTTATGCTCGACGAAGluAlaGlnSerAlaAlaAspArgAsnThrArgValMetLeuAspGlu180185190GATAAGACTACCCTCTCTGATGTTTTAGCGGACGCGACTGCCAAGTTGAspLysThrThrLeuSerAspValLeuAlaAspAlaThrAlaLysLeu195200205CCTAGAGACAAGACGGTAACTCGGGATGATGCTGAAGGTGTGATTGGAProArgAspLysThrValThrArgAspAspAlaGluGlyVallieGly210215220GCGGAAATAAGAAACAAACCTAATATGAGGACTACGCCTGGTGGAGTTAlaGlulieArgAsnLysProAsnMetArgThrThrProGlyGlyVal225230235240GCTGCTTCTGTGGCTGCAGCTGCTAGGCTTAATCAGAACCCATAATACCAlaAlaSerValAlaAlaAlaAlaArgLeuAsnGlnAsnPro245250ATTCACGTTCTGTTTTCTTTTTCTTTCTTTTTATAGAGAAGTTGCCTTCGTTTTATATAATTGCTGCACTGTCGCTTGCTATATGAACCGTTCCCCTGTTTTGCTAGTTACGAATGATGGTGGCCAAAGTGATACACTTTTTGTCGTGTCCTTTCGAGAATGTATAAACTTTGAATCTCTATGTAAATAGACTTTTACTTGGTTTCCTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA<210>2<211>324<212>PRT<213>麻瘋樹(JatrophacarcasL.)<400>2MetSerGlnGlyGlnProArgArgThrGlnTyrAspGlnGluProlie151015LysTyrGlyAspValPheAsnValGlyGlyAspValAlaSerGlnPro202530lieAlaProValAspAlaAlaAsnMetGlnSerAlaGluSerGlnVal354045LeuGlyGluProGlnArgGlyGlyProAlaSerValMetGlnSerAla505560AlaAsnValAsnValArgThrGlyAlaValGluArgAspAspValSer65707580AspValValArgGluGlnGlylieAsnValAlaGlulieAsplieGly859095GlyThrArgVallieThrGluLysValGlyGlyGluValValGlyGln100105110TyrValGlnProArgValProAlaThrTyrProMetProGlyMetAsp115120125lieThrMetGlyGluAlaLeuGluAlaThrAlaTyrSerAlaAlaGly130135140AspLysProlieAspGlnSerAspAlaAlaAlalieLysAlaAlaGlu145150155160ValArgAlaLeuArgSerThrGlnThrProAlaGlyGlylieGlyAla165170175GluAlaGlnSerAlaAlaAspArgAsnThrArgValMetLeuAspGlu180185190AspLysThrThrLeuSerAspValLeuAlaAspAlaThrAlaLysLeu195200205ProArgAspLysThrValThrArgAspAspAlaGluGlyVallieGly210215220AlaGlulieArgAsnLysProAsnMetArgThrThrProGlyGlyVal225230235240AlaAlaSerValAlaAlaAlaAlaArgLeuAsnGlnAsnPro245250<210>3<211>25<212>DNA<213>(Jartrophacurcas)<400>3ATGAGCCAGGGGCAACCACGAAGAA<210>4<211>30<212>DNA<213>(Jatrophacurcas)<400>4TTATGGGTTCTGATTAAGCCTAGCAGCTGC權(quán)利要求一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有麻瘋樹JcLEA蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列雜交。2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列。4.一種分離出的麻瘋樹JcLEA蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQIDN0.2序列的多肽。6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體為p3301-BI121、pB1121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。8.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其特征在于它是原核或真核細胞。9.一種產(chǎn)生具有麻瘋樹JcLEA蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，特征在于其步驟如下(1)將編碼具有麻瘋樹JcLEA蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成麻瘋樹JcLEA蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成麻瘋樹JcLEA蛋白的重組細胞；(3)在適合表達麻瘋樹JcLEA蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有麻瘋樹JcLEA蛋白活性的基本純的多肽。10.一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有麻瘋樹JcLEA蛋白活性多肽的核昔酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物對干旱耐受性增強的方法，其特征在于其步驟如下(1)將編碼具有麻瘋樹JcLEA蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達調(diào)控序列，形成含麻瘋樹JcLEA蛋白的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第59-820位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入植物宿主細胞。其特征在于所述植物宿主為水稻、小麥、大豆、玉米、煙草、油菜、高粱、棉花、苜蓿、麻瘋樹或擬南芥。(3)通過篩選如抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)化細胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。11.一種探針，其特征是能與權(quán)利要求4所述的麻瘋樹JcLEA蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體。12.一種核酸分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。13.一種用于檢測樣品中麻瘋樹JcLEA核苷酸序列的方法，其特征在于采用權(quán)利要求11所述探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合.14.按權(quán)利要求13所述的方法，其特征是所述樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于麻瘋樹JcLEA核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度為15-50個核苷酸。全文摘要本發(fā)明屬分子生物學(xué)、基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種在麻瘋樹中表達的新的晚期胚胎豐富蛋白(LateEmbryogenesisAbundantprotein，簡稱為“LEA蛋白”)、編碼序列及其在改良植物對干旱的耐受上的應(yīng)用。涉及包含所說基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達載體，及轉(zhuǎn)化植物細胞，以及由轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的所說基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。將本發(fā)明的基因?qū)胫参锼拗?，可得到抗干旱脅迫能力增強的轉(zhuǎn)基因植物(作物)，對于培育抗旱性提高的作物新品種具有重要的理論及實際意義，可應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定。文檔編號C12N15/63GK101798576SQ20101010615公開日2010年8月11日申請日期2010年1月19日優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日發(fā)明者周明琦,林娟,金元杰申請人:復(fù)旦大學(xué)