專利名稱：一種制備β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶酶制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶酶制劑的方法。
背景技術(shù)：
0 -半乳糖苷酶(0 -D-galactosido-galatohydrolase, ^ _D_ 半乳糖苷半乳糖 水解酶，EC 3. 2. 2. 23)通常被稱為乳糖酶(Lactase)。這種酶能將乳糖水解成半乳糖和葡 萄糖，也具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用(張樹政等，酶制劑工業(yè)，科學(xué)出版社，1984，p818、19)。 乳糖酶存在于植物(尤其在杏、桃、蘋果)、細(xì)菌(乳酸菌、大腸桿菌等)、真菌(米曲酶、黑 曲霉、琉球曲霉、脆壁酵母、乳結(jié)合酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母)以及放線菌(天藍(lán)鏈霉 菌)、動(dòng)物腸道(特別是乳嬰)中。乳糖則是牛奶乳清中的主要成分，乳糖約占牛奶干物質(zhì) 的30%，但溶解度低，在20°C水中溶解度僅為20%，而其甜度僅為蔗糖的16%。久貯的乳制 品由于乳糖析出，呈砂樣感覺，影響風(fēng)味。此外，許多成人，特別是嬰兒(因人種而異，西歐 占2 8%，亞洲、非洲占6(T90% )體內(nèi)缺乏乳糖酶，因此他們很難消化牛奶，飲用牛奶后，乳 糖到了腸里，被腸道細(xì)菌分解發(fā)酵，產(chǎn)生大量二氧化碳?xì)怏w，使腸道膨脹，并興奮腸道蠕動(dòng)， 使收縮加強(qiáng)，造成腸鳴和腹瀉，這種疾病稱作乳糖不耐受癥(G.G.伯奇等，酶與食品加工， 輕工業(yè)出版社，1991，p93 110)。乳糖酶主要用來治療乳糖不耐受癥、處理加工牛乳、乳清等，生產(chǎn)低乳糖牛奶和低 乳糖乳制品及減少環(huán)境污染。1.解決乳糖不耐受癥患者使用乳制品的問題(G.G.伯奇等，酶與食品加工，輕工 業(yè)出版社，1991，p93 110)。由于乳糖不耐受癥患者體內(nèi)缺乏乳糖酶，他們就不能充分利用 乳制品中乳糖所提供的能量，乳糖在其體內(nèi)不能被吸收，就成為腸道微生物菌系的能源，這 就導(dǎo)致乳酸和二氧化碳的形成，他們對腸道有刺激作用，并造成機(jī)體脫水進(jìn)入結(jié)腸，最終會(huì) 出現(xiàn)腹瀉，同時(shí)發(fā)生腸梗塞和脹氣等，造成腸道蠕動(dòng)加快，還會(huì)減少蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽類等營 養(yǎng)物質(zhì)的吸收。腹瀉還會(huì)帶來衛(wèi)生學(xué)方面的問題和造成重復(fù)感染的機(jī)會(huì)。通過口服乳糖酶 或?qū)⑷樘敲钢苯蛹尤氲饺橹破分锌山鉀Q這一問題。在工業(yè)生產(chǎn)中可將乳糖酶加到乳制品中 制成低乳糖的乳制品，一方面減輕乳糖不耐受癥的影響，另一方面可提高乳制品的營養(yǎng)。2.改良濃縮乳和濃縮乳清的質(zhì)量。由于乳糖的溶解度低，在低溫下極易從濃縮乳 和濃縮乳清中結(jié)晶析出，加入乳糖酶可防止冷凍乳及濃縮乳清中的乳糖結(jié)晶而引起乳酪蛋 白的凝固。此外，乳清作為飼料的利用價(jià)值很高，但乳糖對家畜的生長有一定的限制，使用 乳糖酶將乳糖分解為單糖既提高了消化率，同時(shí)也消除了乳糖結(jié)晶所產(chǎn)生的操作不便。3.改良冰淇淋混合物中，如有12%以上的脫脂乳圓形物時(shí)，貯藏及銷售中會(huì)產(chǎn) 生乳糖結(jié)晶，此結(jié)晶在口中呈砂樣感，降低了商品價(jià)值，乳脫脂固形物為16%，用酶分解其 50%的乳糖后，在冰箱中放置四個(gè)月仍穩(wěn)定，而且增加了甜味，冰淇淋混和物中的砂糖可減 少廣2%用量。此外，水解乳清和乳糖在三明治、軟飲料和紡織品上漿中都有很大的用途，在 紡織上漿中使用水解乳清省去使用白蛋白，降低生產(chǎn)成本。近年來，利用3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶生產(chǎn)低聚半乳糖也受到重視。因此，乳糖酶在食品工業(yè)中作用日益顯著。但目前乳糖酶并未在食品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用，主要 原因是目前乳糖酶的產(chǎn)量較低，銷售價(jià)格過高，添加成本昂貴。市場上銷售的乳糖酶主要 來源于酵母，此種酶耐熱性差，適用范圍窄，不能滿足食品工業(yè)多方面的需要。隨著基因工 程技術(shù)的發(fā)展，尋找研制出成本低，產(chǎn)量高，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，更合適食品工業(yè)生產(chǎn)的乳糖酶，已 成為研究熱點(diǎn)。膜分離技術(shù)作為一種新型、高效的流體分離技術(shù)，近年來取得了令人矚目的發(fā)展， 已廣泛應(yīng)用于國民經(jīng)濟(jì)得各個(gè)領(lǐng)域。在節(jié)能減排清潔生產(chǎn)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用。 在酶技術(shù)領(lǐng)域，首先引入的膜分離是用于濃縮，在發(fā)酵領(lǐng)域，微孔膜的出現(xiàn)被應(yīng)用于抗生 素、氨基酸的除雜除菌分離，從而使工藝流程縮短，產(chǎn)品質(zhì)量提高，收率增加，大大節(jié)約了能 源。但目前生產(chǎn)食品級(jí)酶制劑還是比較困難的，主要是因?yàn)樯a(chǎn)過程中容易受環(huán)境中微生 物的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備酶制劑的方法。本發(fā)明所提供的制備酶制劑的方法，包括如下步驟1)將含目的酶的發(fā)酵液進(jìn)行微孔膜過濾，得到含目的酶的澄清液；2)將所述含目的酶的澄清液依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，收集目的酶液；所述超濾柱組1和所述超濾柱組2沿著含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接； 所述超濾柱組1和超濾柱組2均至少含有一支超濾柱；所述超濾柱由壁卷成；所述壁由至少二層超濾膜和至少一層導(dǎo)流網(wǎng)組成，超濾膜 和導(dǎo)流網(wǎng)相間排列，每層導(dǎo)流網(wǎng)均夾設(shè)在兩層超濾膜之間；所述含目的酶的澄清液沿所述 導(dǎo)流網(wǎng)流動(dòng)；所述超濾柱組1中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為24密爾-46密爾，所述 超濾柱組2中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為54密爾-86密爾；3)向所述目的酶液中加入助劑，干燥，得到目的酶制劑；所述步驟1)和步驟2)在密閉條件下進(jìn)行。上述過程中，所述超濾柱組1中含有3支所述超濾柱，且3支所述超濾柱沿含目的 酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接；和所述超濾柱組2中含有3支所述超濾柱，/且3支所述 超濾柱沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接。上述過程中，所述超濾柱組1含有12支所述超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄 清液的流動(dòng)方向串聯(lián)形成一小組，共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組1 ；和所述超濾柱 組2含有12支所述超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)形成一小組， 共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組2。上述過程中，所述超濾柱組1中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為24密爾， 所述超濾柱組2中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為54密爾；或所述超濾柱組1中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為35密爾，所述超濾柱 組2中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為60密爾；或所述超濾柱組1中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為46密爾，所述超濾柱 組2中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為86密爾。
上述過程中，所述超濾柱組1中每支所述超濾柱中各層超濾膜的總面積為 28m2-31m2,具體為30m2、32m2或28m2 ；所述超濾柱組2中每支所述超濾柱中各層超濾膜的總 面積為 24m2-27m2，具體為 26m2、27m2 或 24m2。上述過程中，所述超濾柱組1中每支所述超濾柱和所述超濾柱組2中每支所述超 濾柱均沿含目的酶澄清液的流動(dòng)方向長0. 5m或lm ；所述超濾柱組1中每支所述超濾柱和 所述超濾柱組2中每支所述超濾柱的橫截面的外直徑均為2英寸或8英寸；所述超濾柱組 1中每支所述超濾柱的壁中和所述超濾柱組2中每支所述超濾柱的壁中的超濾膜均為3-4 層、導(dǎo)流網(wǎng)均為2-3層。上述過程中，所述超濾柱組1中每支所述超濾柱的平均通透量為40-52升/m2/h， 具體為40升/m2/h、45升/m2/h或52升/m2/h ；所述超濾柱組2中每支所述超濾柱的平均通 透量為30-35升/m2/h，具體為30升/m2/h、32升/m2/h或35升/m2/h ；所述超濾膜的截留 分子量為1-3萬道爾頓，優(yōu)選為2萬道爾頓。上述過程中，所述超濾膜帶孔；所述超濾膜的孔分布均勻；所述超濾膜的孔徑大 小均一；所述將含目的酶的澄清液直接依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，在外界壓力下進(jìn) 行；外界壓力大小恒定，外界壓力大小為IMpa。上述過程中，所述方法中，在所述微孔膜過濾前，包括將所述含目的酶的發(fā)酵液用 壓濾機(jī)進(jìn)行過濾的步驟；所述步驟1)中的微孔膜過濾為循環(huán)錯(cuò)流過濾；所述微孔膜為孔徑 為0. lum-0. 5um的陶瓷膜；所述壓濾機(jī)為充氣壓濾機(jī)或板框壓濾機(jī)；所述助劑為奶粉、麥芽 糊精或可溶性淀粉；所述干燥為噴霧干燥。上述過程中，所述目的酶為0 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶；所述含目的酶的發(fā)酵液是按照包括如下步驟的方法得到的誘導(dǎo)發(fā)酵巴斯德畢赤 酵母(Pichia pastoris)LAC0 Y12 CGMCC NO. 3630，得到0 _D_半乳糖苷半乳糖水解酶。所述誘導(dǎo)發(fā)酵的方法包括如下步驟1)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合微量元素，再接種巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LAC0 Y12 CGMCC NO. 3630，培養(yǎng) 16 小時(shí)；2)向步驟1)的發(fā)酵體系中流加葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5小 時(shí)；3)向步驟2)的發(fā)酵體系中流加甲醇，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到3-D-半乳糖苷半乳糖 水解酶；所述步驟2)中，所流加的葡萄糖的總量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20% (體積百分 含量)；所述葡萄糖在所述葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液中的濃度為450g/L ；所述復(fù) 合微量元素在所述葡萄糖與復(fù)合微量元素的混合溶液中的濃度為7. 5ml/L ；所述葡萄糖和 復(fù)合微量元素的混合溶液的流加速度為16ml/hr/L ；所述培養(yǎng)的過程中，所述發(fā)酵體系的 溶氧量為25% (體積百分含量)；所述步驟3)中，所流加的甲醇總量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的75% (體積百分含 量)；流加過程中，使添加的甲醇在所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積中的濃度保持在0.3% (體積百分 含量)；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，發(fā)酵體系的溶氧量為25% (體積百分含量)；所述誘導(dǎo)培 養(yǎng)的時(shí)間為96小時(shí)或100小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為如下培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60g/l，硫酸鉀在發(fā) 酵培養(yǎng)基中的濃度為17. 2g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15. 85g/l，磷酸二氫鉀在 發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 93g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵 培養(yǎng)基中的濃度為1. 6g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為50g/l ； 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生 物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為70g/l，氯化鋅在所述復(fù)合 微量元素中的濃度為25g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為8g/l，一水硫酸 錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為2. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 7g/ 1，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 3g/l ；所述誘導(dǎo)發(fā)酵是在50L發(fā)酵罐中進(jìn)行的。本發(fā)明的生產(chǎn)乳糖酶的工藝中，首次采用雙膜組合(微孔膜和超濾膜)，尤其是 在超濾膜通道中使用了不同厚度的導(dǎo)流網(wǎng)，使料液通過超濾膜通道的過程中始終保持較 快的速度，進(jìn)而快速的完成超濾濃縮，解決了傳統(tǒng)技術(shù)中在超濾后期由于料液濃度增高而 引起膜堵塞致使料液流速變緩的問題；本發(fā)明方法中，在超濾濃縮的步驟中，在進(jìn)液量為 16000L、進(jìn)液中酶濃度為3000U/mL，被濃縮至3_4倍的前提下，僅需要1小時(shí)；而傳統(tǒng)技術(shù) (用超濾膜反復(fù)循環(huán)分離)，在相同的前提下需要3-4小時(shí)?？梢姳景l(fā)明方法大大縮短了濃 縮時(shí)間，進(jìn)一步縮短了工藝流程，提高了酶制劑的生產(chǎn)效率。而且，本發(fā)明方法的酶提取率 很高，可達(dá)70%。另一方面，本發(fā)明方法中，經(jīng)過微孔膜過濾后的無菌含酶澄清液在超濾的過程中， 只需一次流經(jīng)超濾膜通道即可，無需循環(huán)的步驟，與現(xiàn)有技術(shù)相比，避免了料液與環(huán)境的接 觸，從而保證產(chǎn)品在提取過程中不遭受污染，還省去了再除菌的步驟。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方 法得到的酶制劑成品中菌的數(shù)量少于100個(gè)/g，而現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的酶制劑中菌的數(shù)量一般 為 1000 個(gè)/g。綜上，本發(fā)明方法獲得的酶制劑達(dá)到了食品級(jí)，本發(fā)明方法在制備酶制劑領(lǐng)域中 將有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、制備β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的酶制劑一、發(fā)酵制酶本實(shí)驗(yàn)為重組酵母在50升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)β -D-半乳糖苷半乳糖水解 酶。質(zhì)粒pPIC9購自農(nóng)科院生物技術(shù)研究所。按照專利(申請?zhí)?2108141. 7)中所述 的方法構(gòu)建重組酵母菌，將乳糖酶的編碼基因?qū)胼d體PPIC9中，再轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115， 篩選得到重組酵母菌。將其中產(chǎn)酶效果好的一株記作巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris) LACO Y12 ；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) LACO Y12已于2010年2月8日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3630。
1、種子培養(yǎng)將重組酵母菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) LACO Y12 CGMCCNo. 3630接種于預(yù)培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)24小時(shí)，得到種子培養(yǎng)液。預(yù)培養(yǎng)基的組成由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、 葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的 濃度為17. 2g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15. 85g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中 的濃度為5g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 93g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為1.6g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為50g/l。2、發(fā)酵培養(yǎng)1)菌株培養(yǎng)階段向30L發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合微量元素，使復(fù)合微量元素與發(fā) 酵培養(yǎng)基的體積比為4. 37ml 1L，再按8%的接種量向其中接入種子培養(yǎng)液，攪拌培養(yǎng) 16hr。在此培養(yǎng)的過程中，向發(fā)酵體系中加入液態(tài)氨，以使發(fā)酵體系的pH值保持在5. 0， 同時(shí)液態(tài)氨也作為菌株生長的氮源。在此培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧由 100%逐漸降低，當(dāng)碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80%以上，然后進(jìn)入碳源飼喂階段。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為如下培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸 鈣、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60g/l，硫酸鉀在發(fā) 酵培養(yǎng)基中的濃度為17. 2g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15. 85g/l，磷酸二氫鉀在 發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 93g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵 培養(yǎng)基中的濃度為1. 6g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為50g/l。所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生 物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為70g/l，氯化鋅在所述復(fù)合 微量元素中的濃度為25g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為8g/l，一水硫酸 錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為2. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 7g/ 1，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 3g/l。生物素購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為14J0102 ；2)碳源飼喂階段步驟1)完成后，向步驟1)的發(fā)酵體系中流加葡萄糖和復(fù)合 微量元素的混合溶液，混合溶液的流加速度為16ml/hr/L，葡萄糖在混合溶液中的濃度為 450g/l，葡萄糖的流加總量占初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積(即30L)的20% (體積百分含量)，復(fù) 合微量元素在混合溶液中的濃度為7. 5ml/L ；此培養(yǎng)過程中，通氣使發(fā)酵體系的溶氧量保 持在25% (體積百分含量)；此培養(yǎng)過程的時(shí)間為5hr。3)誘導(dǎo)表達(dá)階段步驟2)完成后，向發(fā)酵體系中流加甲醇繼續(xù)培養(yǎng)，使甲醇在發(fā) 酵體系中的濃度保持在0. 3% (體積百分含量)，甲醇的流加總量占初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積 (即30L)的75% (體積百分含量)；此過程中，通氣使發(fā)酵體系的溶氧量保持在25% (體 積百分含量)。在此誘導(dǎo)過程中每12個(gè)小時(shí)取樣一次測定表達(dá)的β-D-半乳糖苷半乳糖水 解酶的累積量及酶活。共誘導(dǎo)表達(dá)100小時(shí)。取上述發(fā)酵過程中，誘導(dǎo)不同時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測酶的表達(dá)量。蛋白的酶活性檢測(即酶的效 價(jià)檢測)酶活定義1單位乳糖酶為在pH5. 2、60°C下每分鐘分解oNPG產(chǎn)生Iymol的 oNP (鄰硝基酚)所需要的酶量；
酶活檢測方法1.取0. 5ml發(fā)酵液，稀釋100倍，得到酶檢測液。2.吸取底物溶液 (2. 5g/L的oNPG的水溶液)800yL放在試管中，在60°C的水浴中平衡3min。3.在誘導(dǎo)表 達(dá)的不同時(shí)間點(diǎn)，吸取200 μ L待測酶檢測液加入試管中，震蕩混勻。在空白對照管中加入 200 μ L的0. 1Μ、ρΗ5. 2,HAc-NaAc緩沖液。4. 15min反應(yīng)之后，吸取ImL的10% TCA溶液加 入每個(gè)試管中，震蕩混勻。5.從水浴鍋中取出反應(yīng)液試管，每個(gè)試管中加入Im0VLmNa2CO3 溶液2mL。6.反應(yīng)液置于Icm光程的比色皿中，用分光光度計(jì)測定420nm下的吸光值，記錄 數(shù)據(jù)。
實(shí)驗(yàn)組用由巴斯德畢赤酵母(Pichia pastor is) LACO Y12的發(fā)酵液稀釋得到的 酶檢測液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對照組用由對照菌GS115-pPIC9的發(fā)酵液稀釋得到的酶檢測液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。換算公式根據(jù)乳糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出乳糖酶酶活單位計(jì)算公式酶活力(U/ml)= (YX5XN)/15Y:生成產(chǎn)物oNP的量(μ mol)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算得出?？蓪?20nm光吸收 值x(扣除空白對照)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到Y(jié)值。5 將200 μ L稀釋酶液中的酶活折算為ImL酶液的活性。N:酶液的稀釋倍數(shù)15:反應(yīng)時(shí)間，min。共進(jìn)行5罐批實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均數(shù)。誘導(dǎo)表達(dá)100小時(shí)，平均效價(jià)為7000U/ml發(fā)酵液。同時(shí)在相同的條件下發(fā)酵對照菌GS115-pPIC9，作為對照組。對照組中沒有檢測到 酶活性蛋白。二、過濾將實(shí)驗(yàn)一得到的發(fā)酵液進(jìn)行如下過濾步驟。1、發(fā)酵液除雜除菌發(fā)酵液經(jīng)充氣壓濾機(jī)過濾，濾除菌體及其它固形物，收集濾 液，濾液中固形物含量大大降低；2、進(jìn)一步除菌將步驟1得到的濾液用0. 1-0. 5μπι的微孔陶瓷膜進(jìn)行循環(huán)錯(cuò)流 過濾，并不斷補(bǔ)充蒸汽冷凝水，逐步將酶趕出，得到無菌含酶澄清液；無菌含酶澄清液中酶 活為3000U/ml無菌含酶澄清液；因?yàn)槲⒖走^濾過程中要加入冷凝水，所以酶的濃度被稀釋 了。3、超濾濃縮將步驟2得到的無菌含酶澄清液進(jìn)行超濾(微孔膜過濾及超濾是在 密閉的條件下進(jìn)行的)；超濾方法如下將所述含目的酶的澄清液依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，得到 含酶的濃縮液，含酶的濃縮液直接進(jìn)入無菌儲(chǔ)罐。所述超濾柱組1含有12支超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串 聯(lián)形成一小組，共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組1 (即第一道膜分離系統(tǒng))；所述超 濾柱組2含有12支超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)形成一小組， 共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組2 (即第二道膜分離系統(tǒng))。所述超濾柱組1和所 述超濾柱組2沿著含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接。所述超濾柱組1中，每支所述超濾柱均由壁卷成；所述壁由3層超濾膜和2層導(dǎo)流網(wǎng)組成，超濾膜和導(dǎo)流網(wǎng)相間排列，每層導(dǎo)流網(wǎng)均夾設(shè)在兩層超濾膜之間；所述含目的酶的澄清液沿所述導(dǎo)流網(wǎng)流動(dòng)；每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為35密爾；每支所述超濾柱中各層超濾膜 的總面積為30m2 ；每支所述超濾柱均沿含目的酶澄清液的流動(dòng)方向長Im ；每支所述超濾柱 的橫截面的外直徑為8英寸；每支所述超濾柱的平均通透量均為40升/m2/h ；所述超濾膜 的截留分子量為2萬道爾頓。所述超濾柱組2中，每支所述超濾柱均由壁卷成；所述壁由3層超濾膜和2層導(dǎo)流 網(wǎng)組成，超濾膜和導(dǎo)流網(wǎng)相間排列，每層導(dǎo)流網(wǎng)均夾設(shè)在兩層超濾膜之間；所述含目的酶的 澄清液沿所述導(dǎo)流網(wǎng)流動(dòng)；每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為60密爾；每支所述超濾柱中各層超濾膜 的總面積為26m2 ；每支所述超濾柱均沿含目的酶澄清液的流動(dòng)方向長Im ；每支所述超濾柱 的橫截面的外直徑為8英寸；每支所述超濾柱的平均通透量均為32升/m2/h ；所述超濾膜 的截留分子量為2萬道爾頓。所述超濾膜帶孔；所述超濾膜的孔分布均勻；所述超濾膜的孔徑大小均一；所述將含目的酶的澄清液直接依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，是在外界壓力 下進(jìn)行；外界壓力大小恒定，外界壓力大小為IMpa。結(jié)果，經(jīng)過步驟3的超濾濃縮，酶活為3000U/ml的無菌含酶澄清液被濃縮至3. 3 倍，得到的含酶濃縮液中酶活為10000U/mL。三、添加助劑及干燥向無菌儲(chǔ)罐中加入奶粉，攪勻后噴霧干燥，然后將噴粉用奶粉調(diào)制成規(guī)定的規(guī)格， 進(jìn)行包裝，包裝采用圓形纖維桶，內(nèi)用聚乙烯塑料袋存放，20kg/桶。檢測成品中酶活力，并換算酶的提取率，記錄超濾時(shí)間。酶的提取率=[成品重量(kg) X成品中酶活(U/g)]/[發(fā)酵液體積(m3) X發(fā)酵 液中酶活(U/ml)]；結(jié)果，發(fā)酵液酶活為7000U/ml發(fā)酵液，成品中酶活力為30000U/g ；酶的提取率為 70%。四、效果檢測對包裝后的成品進(jìn)行以下檢測1、成品酶活檢測方法將成品溶于pH5.2、0.2mol/L醋酸緩沖液中，作為酶檢測 液，然后按照實(shí)驗(yàn)一中所述方法檢測酶活；2、成品中水分含量檢測方法(QB/T 1803-1993工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法)；3、酶活力保存率檢測方法(QB/T 1804-1993工業(yè)酶制劑通用檢驗(yàn)規(guī)則和標(biāo)志、包 裝、運(yùn)輸、貯存)；4、成品形態(tài)、顏色、溶解性。5、細(xì)菌總數(shù)檢測方法(GB 4789. 2-1994食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定)；7、鉛(以Pb計(jì))灰分檢測方法(中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB\T 5009. 12-1996. 食品中鉛的測定方法)；8、砷(以As計(jì))檢測方法(GB/T 5009. 11-2003食品中總砷及無機(jī)砷的測定)；9、亞硝酸鹽檢測方法(食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定國家標(biāo)準(zhǔn)GB/ T5009. 33-2003)；10、致病菌(指腸道致病菌和致病性球菌)檢測方法(食品中多種致病菌快速檢測方法 SN T 1869-2007)；11、大腸菌群檢測方法(GB 4789-1994食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn))；理化指標(biāo)成品酶活力31200U/g成品中水分含量7· 5% (質(zhì)量百分含量)。酶活力保存率(20°C保存半年)86%形態(tài)具有流動(dòng)性干粉末顏色白色或奶粉色溶解性易溶于水灰分9.鉛(以Pb 計(jì))0· 8mg/kg砷(以As 計(jì))0. 39mg/kg亞硝酸鹽8ppm微生物指標(biāo)細(xì)菌總數(shù)86個(gè)/g致病菌(指腸道致病菌和致病性球菌)未檢出大腸菌群15個(gè)/g。實(shí)施例2、制備β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的酶制劑一、發(fā)酵制酶方法與實(shí)施例1中所述一致。二、過濾將實(shí)驗(yàn)一得到的發(fā)酵液進(jìn)行如下過濾步驟。1、發(fā)酵液除雜除菌發(fā)酵液經(jīng)充氣壓濾機(jī)過濾，濾除菌體及其它固形物，收集濾 液，濾液中固形物含量大大降低；2、進(jìn)一步除菌將步驟1得到的濾液用0. 1-0. 5 μ m的微孔陶瓷膜進(jìn)行循環(huán)錯(cuò)流過 濾，并不斷補(bǔ)充蒸汽冷凝水，逐步將酶趕出，得到無菌含酶澄清液；無菌含酶澄清液中酶活 為3000U/ml無菌含酶澄清液；3、超濾濃縮將步驟2得到的無菌含酶澄清液進(jìn)行超濾(微孔膜過濾及超濾是在 密閉的條件下進(jìn)行的)；超濾方法如下將所述含目的酶的澄清液依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，含酶 的濃縮液直接進(jìn)入無菌儲(chǔ)罐。所述超濾柱組1含有12支超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串 聯(lián)形成一小組，共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組1 (即第一道膜分離系統(tǒng))；所述超 濾柱組2含有12支超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)形成一小組， 共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組2 (即第二道膜分離系統(tǒng))。所述超濾柱組1和所 述超濾柱組2沿著含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接。所述超濾柱組1中，每支所述超濾柱均由壁 卷成；所述壁由4層超濾膜和3層導(dǎo)流 網(wǎng)組成，超濾膜和導(dǎo)流網(wǎng)相間排列，每層導(dǎo)流網(wǎng)均夾設(shè)在兩層超濾膜之間；所述含目的酶的 澄清液沿所述導(dǎo)流網(wǎng)流動(dòng)；每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為24密爾；每支所述超濾柱中各層超濾膜的總面積為32m2 ；每支所述超濾柱均沿含目的酶澄清液的流動(dòng)方向長Im ；每支所述超濾柱 的橫截面的外直徑為8英寸；每支所述超濾柱的平均通透量均為45升/m2/h ；所述超濾膜 的截留分子量為1萬道爾頓。所述超濾柱組2中，每支所述超濾柱均由壁卷成；所述壁由4層超濾膜和3層導(dǎo)流 網(wǎng)組成，超濾膜和導(dǎo)流網(wǎng)相間排列，每層導(dǎo)流網(wǎng)均夾設(shè)在兩層超濾膜之間；所述含目的酶的 澄清液沿所述導(dǎo)流網(wǎng)流動(dòng)；每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為54密爾；每支所述超濾柱中各層超濾膜 的總面積為27m2 ；每支所述超濾柱均沿含目的酶澄清液的流動(dòng)方向長Im ；每支所述超濾柱 的橫截面的外直徑為8英寸；每支所述超濾柱的平均通透量均為30升/m2/h ；所述超濾膜 的截留分子量為1萬道爾頓。
所述超濾膜帶孔；所述超濾膜的孔分布均勻；所述超濾膜的孔徑大小均一；所述將含目的酶的澄清液直接依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，是在外界壓力 下進(jìn)行；外界壓力大小恒定，外界壓力大小為IMpa。結(jié)果，經(jīng)過步驟3的超濾濃縮，酶活為3000U/ml的無菌含酶澄清液被濃縮至2. 7 倍，得到的含酶濃縮液中酶活為8000U/mL。三、添加助劑及干燥向無菌儲(chǔ)罐中加入麥芽糊精，攪勻后噴霧干燥，然后將噴粉用奶粉調(diào)制成規(guī)定的 規(guī)格，進(jìn)行包裝，包裝采用圓形纖維桶，內(nèi)用聚乙烯塑料袋存放，20kg/桶。檢測成品中酶活力，并換算酶的提取率，記錄超濾時(shí)間。酶的提取率=[成品重量(kg) X成品中酶活(U/g)]/[發(fā)酵液體積(m3) X發(fā)酵 液中酶活(U/ml)]；結(jié)果，成品中酶活力為30000U/g ；酶的提取率為72% ；四、效果檢測對包裝后的成品進(jìn)行以下檢測1、成品酶活檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致。；2、水分檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；3、酶活力保存率檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；4、成品形態(tài)、顏色、溶解性方法與實(shí)施例1中所述一致。5、細(xì)菌總數(shù)檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；7、鉛(以Pb計(jì))灰分檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；8、砷(以As計(jì))檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；9、亞硝酸鹽檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；10、致病菌(指腸道致病菌和致病性球菌)檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一 致；11、大腸菌群檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；理化指標(biāo)酶活力30800U/g水分7.6%酶活力保存率(20°C以下半年)86·2%形態(tài)具有流動(dòng)性干粉末
顏色白色或奶粉色溶解性易溶于水灰分9.3%鉛(以Pb計(jì))0.91mg/kg砷(以As計(jì))0. 34mg/kg ；亞硝酸鹽9. 2ppm ；微生物指標(biāo)細(xì)菌總數(shù)91個(gè)/g ； 致病菌(指腸道致病菌和致病性球菌)未檢出。大腸菌群20個(gè)/g。實(shí)施例3、制備β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的酶制劑一、發(fā)酵制酶方法與實(shí)施例1中所述一致。二、過濾將實(shí)驗(yàn)一得到的發(fā)酵液進(jìn)行如下過濾步驟。1、發(fā)酵液除雜除菌發(fā)酵液經(jīng)充氣壓濾機(jī)過濾，濾除菌體及其它固形物，收集濾 液，濾液中固形物含量大大降低；2、進(jìn)一步除菌將步驟1得到的濾液用0. 1-0. 5 μ m的微孔陶瓷膜進(jìn)行循環(huán)錯(cuò)流過 濾，并不斷補(bǔ)充蒸汽冷凝水，逐步將酶趕出，得到無菌含酶澄清液；無菌含酶澄清液中酶活 為3000U/ml無菌含酶澄清液；3、超濾濃縮將步驟2得到的無菌含酶澄清液進(jìn)行超濾(微孔膜過濾及超濾是在 密閉的條件下進(jìn)行的)；超濾方法如下將所述含目的酶的澄清液依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，含酶 的濃縮液直接進(jìn)入無菌儲(chǔ)罐。所述超濾柱組1含有12支超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串 聯(lián)形成一小組，共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組1 (即第一道膜分離系統(tǒng))；所述超 濾柱組2含有12支超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)形成一小組， 共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組2 (即第二道膜分離系統(tǒng))。所述超濾柱組1和所 述超濾柱組2沿著含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接。所述超濾柱組1中，每支所述超濾柱均由壁卷成；所述壁由3層超濾膜和2層導(dǎo)流 網(wǎng)組成，超濾膜和導(dǎo)流網(wǎng)相間排列，每層導(dǎo)流網(wǎng)均夾設(shè)在兩層超濾膜之間；所述含目的酶的 澄清液沿所述導(dǎo)流網(wǎng)流動(dòng)；每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為46密爾；每支所述超濾柱中各層超濾膜 的總面積為28m2 ；每支所述超濾柱均沿含目的酶澄清液的流動(dòng)方向長Im ；每支所述超濾柱 的橫截面的外直徑為8英寸；每支所述超濾柱的平均通透量均為52升/m2/h ；所述超濾膜 的截留分子量為3萬道爾頓。所述超濾柱組2中，每支所述超濾柱均由壁卷成；所述壁由3層超濾膜和2層導(dǎo)流 網(wǎng)組成，超濾膜和導(dǎo)流網(wǎng)相間排列，每層導(dǎo)流網(wǎng)均夾設(shè)在兩層超濾膜之間；所述含目的酶的 澄清液沿所述導(dǎo)流網(wǎng)流動(dòng)；每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為86密爾；每支所述超濾柱中各層超濾膜 的總面積為24m2 ；每支所述超濾柱均沿含目的酶澄清液的流動(dòng)方向長Im ；每支所述超濾柱 的橫截面的外直徑為8英寸；每支所述超濾柱的平均通透量均為35升/m2/h ；所述超濾膜 的截留分子量為3萬道爾頓。所述超濾膜帶孔；所述超濾膜的孔分布均勻；所述超濾膜的孔徑大小均一；
所述將含目的酶的澄清液直接依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，是在外界壓力下進(jìn)行；外界壓力大小恒定，外界壓力大小為IMpa。結(jié)果，經(jīng)過步驟3的超濾濃縮，酶活為3000U/ml的無菌含酶澄清液被濃縮至4倍， 得到的含酶濃縮液中酶活為12000U/mL。三、添加助劑及干燥向無菌儲(chǔ)罐中加入可溶性淀粉，攪勻后噴霧干燥，然后將噴粉用奶粉調(diào)制成規(guī)定 的規(guī)格，進(jìn)行包裝，包裝采用圓形纖維桶，內(nèi)用聚乙烯塑料袋存放，20kg/桶。檢測成品中酶活力，并換算酶的提取率，記錄超濾時(shí)間。酶的提取率=[成品重量(kg) X成品中酶活(U/g)]/[發(fā)酵液體積(m3)X發(fā)酵 液中酶活(U/ml)]；結(jié)果，成品中酶活力為30000U/g ；酶的提取率為65% ；四、效果檢測對包裝后的成品進(jìn)行以下檢測1、成品酶活檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致。；2、水分檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；3、酶活力保存率檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；4、成品形態(tài)、顏色、溶解性方法與實(shí)施例1中所述一致。5、細(xì)菌總數(shù)檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；7、鉛(以Pb計(jì))灰分檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；8、砷(以As計(jì))檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；9、亞硝酸鹽檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；10、致病菌(指腸道致病菌和致病性球菌)檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一 致；11、大腸菌群檢測方法方法與實(shí)施例1中所述一致；理化指標(biāo)酶活力31060U/g水分7.5%酶活力保存率(20°C以下半年)86%形態(tài)具有流動(dòng)性干粉末顏色白色或奶粉色溶解性易溶于水灰分9.鉛(以Pb 計(jì))0. 92mg/kg石申(以As 計(jì))0. 36mg/kg亞硝酸鹽9.Ippm微生物指標(biāo)細(xì)菌總數(shù)88個(gè)/g致病菌(指腸道致病菌和致病性球菌)未檢出大腸菌群18個(gè)/g。
權(quán)利要求
一種制備酶制劑的方法，包括如下步驟1)將含目的酶的發(fā)酵液進(jìn)行微孔膜過濾，得到含目的酶的澄清液；2)將所述含目的酶的澄清液依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，收集目的酶液；所述超濾柱組1和所述超濾柱組2沿著含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接；所述超濾柱組1和超濾柱組2均至少含有一支超濾柱；所述超濾柱由壁卷成；所述壁由至少二層超濾膜和至少一層導(dǎo)流網(wǎng)組成，超濾膜和導(dǎo)流網(wǎng)相間排列，每層導(dǎo)流網(wǎng)均夾設(shè)在兩層超濾膜之間；所述含目的酶的澄清液沿所述導(dǎo)流網(wǎng)流動(dòng)；所述超濾柱組1中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為24密爾-46密爾，所述超濾柱組2中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為54密爾-86密爾；3)向所述目的酶液中加入助劑，干燥，得到目的酶制劑；所述步驟1)和步驟2)在密閉條件下進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述超濾柱組1中含有3支所述超濾柱， 且3支所述超濾柱沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接；和所述超濾柱組2中含有3 支所述超濾柱，且3支所述超濾柱沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述超濾柱組1含有12支所述超濾柱， 其中每3支沿含目的酶的澄清液的流動(dòng)方向串聯(lián)形成一小組，共形成4小組，4小組并聯(lián)形 成超濾柱組1 ；和所述超濾柱組2含有12支所述超濾柱，其中每3支沿含目的酶的澄清液 的流動(dòng)方向串聯(lián)形成一小組，共形成4小組，4小組并聯(lián)形成超濾柱組2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述超濾柱組1中的各超濾柱中 的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為24密爾，所述超濾柱組2中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均 為54密爾；或所述超濾柱組1中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為35密爾，所述超濾柱組2 中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為60密爾；或所述超濾柱組1中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為46密爾，所述超濾柱組2 中的各超濾柱中的每層導(dǎo)流網(wǎng)的厚度均為86密爾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述超濾柱組1中每支所述超 濾柱中各層超濾膜的總面積為28m2-31m2，具體為30m2、32m2或28m2 ；所述超濾柱組2中每支 所述超濾柱中各層超濾膜的總面積為24m2-27m2，具體為26m2、27m2或24m2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述超濾柱組1中每支所述超 濾柱和所述超濾柱組2中每支所述超濾柱均沿含目的酶澄清液的流動(dòng)方向長0. 5m或lm ； 所述超濾柱組1中每支所述超濾柱和所述超濾柱組2中每支所述超濾柱的橫截面的外直徑 均為2英寸或8英寸；所述超濾柱組1中每支所述超濾柱的壁中和所述超濾柱組2中每支 所述超濾柱的壁中的超濾膜均為3-4層、和導(dǎo)流網(wǎng)均為2-3層。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述超濾柱組1中每支所述超 濾柱的平均通透量為40-52升/m2/h，具體為40升/m2/h、45升/m2/h或52升/m2/h ；和所 述超濾柱組2中每支所述超濾柱的平均通透量為30-35升/m2/h，具體為30升/m2/h、32升 /m2/h或35升/m2/h ；和所述超濾膜的截留分子量為1_3萬道爾頓，優(yōu)選為2萬道爾頓。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述超濾膜帶孔；和所述超濾膜的孔分布均勻；和所述超濾膜的孔徑大小均一；和所述將含目的酶的澄清液直接依次通過 超濾柱組1和超濾柱組2，在外界壓力下進(jìn)行；和外界壓力大小恒定，外界壓力大小為IMpa。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述微孔膜過濾 前，包括將所述含目的酶的發(fā)酵液用壓濾機(jī)進(jìn)行過濾的步驟；和所述步驟1)中的微孔膜過 濾為循環(huán)錯(cuò)流過濾；和所述微孔膜為孔徑為0. lum-0. 5um的陶瓷膜；所述壓濾機(jī)為充氣壓 濾機(jī)或板框壓濾機(jī)；和所述助劑為奶粉、麥芽糊精或可溶性淀粉；和所述干燥為噴霧干燥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述目的酶為3-D-半乳糖苷 半乳糖水解酶；所述含目的酶的發(fā)酵液是按照包括如下步驟的方法得到的誘導(dǎo)發(fā)酵巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)LAC0 Y12 CGMCC NO. 3630，得到 0 _D_ 半乳糖苷半乳糖水解酶；所述誘導(dǎo)發(fā)酵的方法包括如下步驟1)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合微量元素，再接種巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris) LACO Y12 CGMCC NO. 3630，培養(yǎng) 16 小時(shí)；2)向步驟1)的發(fā)酵體系中流加葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)；3)向步驟2)的發(fā)酵體系中流加甲醇，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到0-D-半乳糖苷半乳糖水解酶；所述步驟2)中，所流加的葡萄糖的總量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20% (體積百分含 量)；所述葡萄糖在所述葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液中的濃度為450g/L ；所述復(fù)合 微量元素在所述葡萄糖與復(fù)合微量元素的混合溶液中的濃度為7. 5ml/L ；所述葡萄糖和復(fù) 合微量元素的混合溶液的流加速度為16ml/hr/L ；所述培養(yǎng)的過程中，所述發(fā)酵體系的溶 氧量為25% (體積百分含量)；所述步驟3)中，所流加的甲醇總量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的75% (體積百分含量)； 流加過程中，使添加的甲醇在所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積中的濃度保持在0.3% (體積百分含 量)；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，發(fā)酵體系的溶氧量為25% (體積百分含量)；所述誘導(dǎo)培養(yǎng) 的時(shí)間為96小時(shí)或100小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為如下培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、 氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培 養(yǎng)基中的濃度為17. 2g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15. 85g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵 培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 93g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng) 基中的濃度為1. 6g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為50g/l ；所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生物素 和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為70g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微量 元素中的濃度為25g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為8g/l，一水硫酸錳在 所述復(fù)合微量元素中的濃度為2. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 7g/l，生 物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 3g/l ；所述誘導(dǎo)發(fā)酵是在50L發(fā)酵罐中進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶酶制劑的方法。該方法，包括如下步驟1)將含目的酶的發(fā)酵液進(jìn)行微孔膜過濾，得到含目的酶的澄清液；2)將所述含目的酶的澄清液依次通過超濾柱組1和超濾柱組2，收集目的酶液；3)向所述目的酶液中加入助劑，干燥，得到目的酶制劑；所述步驟1)和步驟2)在密閉條件下進(jìn)行。本發(fā)明方法中，經(jīng)過微孔膜過濾后的無菌含酶澄清液在超濾的過程中，只需一次流經(jīng)超濾膜通道即可，無需循環(huán)的步驟，與現(xiàn)有技術(shù)相比，避免了料液與環(huán)境的接觸，從而保證產(chǎn)品在提取過程中不遭受污染，還省去了再除菌的步驟。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方法得到的酶制劑成品中菌的數(shù)量少于100個(gè)/g，而現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的酶制劑中菌的數(shù)量一般為1000個(gè)/g。
文檔編號(hào)C12R1/84GK101845424SQ20101011021
公開日2010年9月29日 申請日期2010年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月20日
發(fā)明者張偉, 畢建成, 許建立, 谷海先 申請人:中諾生物科技發(fā)展江蘇有限公司