專利名稱：南非Ⅱ型口蹄疫多抗原表位蛋白、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種南非Ii型口蹄疫多抗原表位 VPl VP3蛋白、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動物 的一種急性、高度接觸性傳染病，一度被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疫病之首?？谔?疫屬于世界流行性傳染病，它的爆發(fā)給全球人類健康以及畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了極大的危害。FMDV為正二十面體的單股正鏈RNA病毒，基因組長約8. 5kb，含有一個(gè)大的開放 性讀碼框，分為L、Pl、P2和P3四個(gè)區(qū)域，其中Pl區(qū)編碼病毒的衣殼蛋白VP4、VP2、VP3和 VPl，各60個(gè)分子的VP4、VP2、VP3和VPl構(gòu)成病毒衣殼蛋白，VPl大部分暴露在病毒粒子的 表面，是決定病毒抗原性的主要成分，可誘導(dǎo)感染動物產(chǎn)生中和抗體，VP4大部分埋在病毒 內(nèi)部，VP2和VP3介于VP4和VPl之間，四種結(jié)構(gòu)多肽都參與免疫原性的構(gòu)成。VPl VP3 組成衣殼蛋白亞單位，VP4位于病毒顆粒內(nèi)部。P2基因編碼3種病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，2A、2B、 2C。P3基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白3A、Vpg、3Cpro和3Dpol?？谔阋卟《居衅邆€(gè)血清型，即0、A、C、SAT I、SAT II、SATIII和Asia I型。這七 個(gè)血清型可根據(jù)同源性分為兩群，0、A、C和Asia I型為第一群，SAT I、SAT II、SATIII為 第二群，群內(nèi)各型同源性達(dá)60 % 70 %，但兩群之間同源性僅為25 % 40 %，口蹄疫病毒 各血清型間無交叉反應(yīng)，即使在同一血清型內(nèi)，不同病毒的抗原性也有差別，這就給口蹄疫 的檢疫和防控增加了難度。傳統(tǒng)的口蹄疫診斷和檢疫方法主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、間接血凝試驗(yàn)(PHA)、 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、病毒中和試驗(yàn)(VNT)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等血清學(xué)方法，隨著 分子生物學(xué)的發(fā)展，RT-PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)的應(yīng)用，使口蹄疫病毒的檢測向著更敏感、 特異、方便、快速的方向發(fā)展。1952年，Brooksby建立了 CFT，病毒分離增殖和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 相結(jié)合的方法在口蹄疫診斷中沿用了近30年，盡管這種技術(shù)準(zhǔn)確可靠，但不夠敏感，而且 有些樣品中存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測效果。間接血凝試驗(yàn)以紅細(xì)胞為載體，根據(jù)致敏紅細(xì) 胞的抗原、抗體的特性，可用已知的抗原或抗體檢測未知的抗體或抗原。目前已有商品化的 口蹄疫間接血凝試劑盒，廣泛應(yīng)用于口蹄疫的抗體檢測。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)既可檢測抗原，也可 檢測抗體。根據(jù)抗原抗體在凝膠中相互擴(kuò)散，在最適比例產(chǎn)生沉淀線的原理，可用已知的抗 原或抗體檢測相應(yīng)的抗體或抗原。病毒中和試驗(yàn)(VNT)也稱血清中和試驗(yàn)，VNT既可鑒定抗 原，又可對抗體定量測定，具有型特異性，是最經(jīng)典的口蹄疫檢測方法，是評價(jià)其它方法的 金標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR技術(shù)用于口蹄疫病毒的檢測，具有敏感性高、特異性好、快速，準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)， PCR產(chǎn)物還可以用來測序，進(jìn)而得到更詳細(xì)的流行病學(xué)信息，為研究口蹄疫病毒毒株演化提 供資料。ELISA檢測口蹄疫具有特異性好、敏感性強(qiáng)、快速、簡便、可靠等優(yōu)點(diǎn)，且能自動化 操作，適合于大量樣品的快速檢測，在口蹄疫的診斷中日益受到人們的重視，現(xiàn)已成為國際上檢測口蹄疫的常規(guī)方法之一。傳統(tǒng)的檢測口蹄疫血清抗體的方法主要是采用BHK細(xì)胞培 養(yǎng)的FMDV為抗原的間接ELISA方法，雖然這種方法的特異性和靈敏度較高，但在病毒的生 產(chǎn)過程中易造成病毒的擴(kuò)散，存在著許多安全隱患，需要BSL-3實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。為此，許多研 究者在大腸桿菌中表達(dá)了 FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，將其作為檢測抗原，建立了多種 FMDV的間接ELISA檢測方法。非洲是口蹄疫的自然疫源地，歷史上南非II型(SAT II型)口蹄疫從未跨過赤道 傳播，這使得一些學(xué)者認(rèn)為南非型口蹄疫需要非洲特殊的生存環(huán)境。但2000年發(fā)生在科威 特和沙特阿拉伯的南非II型口蹄疫疫情，使人們發(fā)現(xiàn)，SAT II型口蹄疫不但可跨過赤道， 還可跨過紅海，到達(dá)亞洲大陸。特別是隨著非洲經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和世界市場的聯(lián)系日益頻繁，非 洲大陸對外的逐步開放也將會使原本定居于非洲的疫病向世界各地散播。隨著我國與非洲國家的建交和貿(mào)易往來的頻繁，我國受南非型口蹄疫的威脅越來 越大，其中SAT II型對我國的威脅最大。我國目前在口蹄疫方面的研究只局限于0、A、C、 Asia I型口蹄疫病毒，而對于SAT II型的研究，包括檢測技術(shù)、疫苗完全處于空白狀態(tài)。本發(fā)明在將SAT II型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3抗原表位基因采用柔性氨基酸 串聯(lián)并在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)的基礎(chǔ)上，以其作為包被抗原建立了 SAT II型口蹄疫病 毒特異的血清型檢測方法，以滿足相關(guān)動物及產(chǎn)品的特異性檢測、監(jiān)測需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種南非II型口蹄疫多抗原表位VPl VP3蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供該多抗原表位蛋白的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供該多抗原表位蛋白的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白，其具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供編碼上述南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白的基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明還提供含有上述核苷酸序列的表達(dá)載體。前述的表達(dá)載體，其出發(fā)載體為pGEX-6P-l。本發(fā)明還提供含有上述核苷酸序列的重組表達(dá)菌。前述的重組表達(dá)菌，其出發(fā)菌株為BL21(DE3)plysS。本發(fā)明還提供南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白的制備方法，其包 括如下步驟1)將SEQ ID NO 2所示的DNA片段連入載體pMD_19T中，經(jīng)BamHI和SalI雙 酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的PGEX-6P-1連接構(gòu)建得到表達(dá)載體pGEX-VPl VP3 ；2)將步 驟1)的表達(dá)載體pGEX-VPl VP3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性 克隆并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白；3)酶切和純化步驟2)的重組蛋白。本發(fā)明還提供南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白在檢測南非II型 口蹄疫病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明另外提供一種用于檢測南非II型口蹄疫病毒的含有所述多抗原表位 VPl VP3蛋白包被抗原的試劑盒。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，采用本發(fā)明方法制備南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白，安全系數(shù)較高，對環(huán)境友好，制備方法簡便易行；采用本發(fā)明試劑盒檢測南非II 型口蹄疫病毒，具有特異性好、敏感性強(qiáng)、快速、簡便、可靠等優(yōu)點(diǎn)，適合于大量樣品的快速 檢測。


圖1為本發(fā)明重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-VPl VP2的構(gòu)建流程圖；圖2為本發(fā)明重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果示意圖，其中，M為蛋白標(biāo)記，1為 空載體菌誘導(dǎo)表達(dá)，2為重組表達(dá)菌未誘導(dǎo)對照3和4為重組表達(dá)菌在誘導(dǎo)后3h表達(dá)的融 合蛋白；圖3為本發(fā)明融合蛋白用抗GST單抗進(jìn)行Western Blot的檢測結(jié)果示意圖，其中， M為蛋白標(biāo)記，1為GST-VPl VP3融合蛋白，2為GST載體蛋白；圖4為本發(fā)明融合蛋白用SAT II型FMDV陽性血清進(jìn)行WesternBlot的檢測結(jié)果 示意圖，其中，M為蛋白標(biāo)記，1為GST-VPl VP3融合蛋白，2為GST載體蛋白；圖5為本發(fā)明南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白的酶切及純化 結(jié)果示意圖，其中，M為蛋白標(biāo)記，1和2為空白對照，3為液相直接酶切產(chǎn)物，4和5為 PGEX-VP1-VP3融合蛋白，6為GST蛋白，7為純化后目的抗原。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1南非II型口蹄疫病毒多抗原表位原核表達(dá)載體pGEX-VPl VP3的構(gòu)建采用柔性氨基酸linker連接抗原性良好的六條肽段VP2 (60-73)、VP2 (163-176)、 VP3 (58-71)、VP3 (127-140)、VPl (132-146)、VPl (199-211)，化學(xué)合成相應(yīng)的 DNA 片段，其核 苷酸序列如SEQ IDNO :2所示。然后，將上述DNA片段連入克隆載體pMD-19T中，以BamH I 和Sal I雙酶切pMD-19T-VPl VP3質(zhì)粒，同時(shí)將pGEX_6P_l質(zhì)粒進(jìn)行同樣的雙酶切，并膠 回收二者的目的片段，經(jīng)連接構(gòu)建成原核表達(dá)載體pGEX-VPl VP3，如圖1所示。實(shí)施例2南非II型口蹄疫病毒多抗原表位基因VPl VP3 DNA序列的克隆提取pGEX-VPl VP3質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增南非II型口蹄疫病毒 多抗原表位VPl VP3的DNA序列，以多抗原表位的核苷酸序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物P1、P2，P1 和P2引物中分別含有BamH I.Sal I酶切位點(diǎn)，引物序列如下Pl :5，- GGATCO CGCTTCTTTAAGGA-3，P2 5，- GTCGAC CCAGCTGTTTTTCCA-3，其中，BamH I、Sal I酶切位點(diǎn)分別以斜體表示。PCR 反應(yīng)體系為重組質(zhì)粒 1 μ L, 10XPCR Buffer (Mg2+) 2. 5 μ L, dNTP 2 μ L, PI、 Ρ2引物各1μ L，rTaq DNA聚合酶0. 5 μ L，滅菌ddH20補(bǔ)充至25 μ L0反應(yīng)程序-MV 5min ； 94°C lmin，50°C 50s, 72°C lmin，共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。酶切鑒定小提重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-VPl VP3，用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I.Sal I進(jìn)行酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系為質(zhì)粒DNA2y g，10XT buffer 7. 5 μ L, BamH I 2 μ L，Sal I 2 μ L，用滅菌ddH20補(bǔ)足50 μ L體系，混勻后37°C水浴酶切3h。
將經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定均為陽性的重組表達(dá)菌株送北京諾賽基因組研究中心 測序。實(shí)施例3重組大腸桿菌BL21 (DE3) plysS/pGEX-VPl VP3的構(gòu)建將經(jīng)過鑒定的重組表達(dá)載體pGEX-VPl VP3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)plysS 感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/氨芐青霉素(Amp)平板，挑選多個(gè)菌落放入LB液體培養(yǎng)基中37°C培 養(yǎng)12小時(shí)后分別用異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，然后進(jìn)行SDS-PAGE和 Western-blot檢測，結(jié)果如圖2至圖5所示。從中篩選出能夠在大腸桿菌BL21 (DE3)中誘 導(dǎo)表達(dá)南非II型口蹄疫病毒多抗原表位基因VPl VP3蛋白的重組大腸桿菌BL21(DE3) plysS/pGEX-VPl VP3。實(shí)施例4最佳誘導(dǎo)物濃度及最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定挑取單個(gè)重組大腸桿菌BL21 (DE3) plysS/pGEX-VPl VP3菌落至3mL LB培養(yǎng)基 中，加氨芐青霉素(Amp)至終濃度5(^8*!11171，371搖床培養(yǎng)1211后，將該菌液按1%的接 種量轉(zhuǎn)接至3mL新鮮的2 X YT (含50 μ g -mL^Amp)培養(yǎng)基中，37°C 200r .mirT1,培養(yǎng)到OD600 為0. 6 0. 8左右，加入終濃度為Immol · L—1的IPTG，37°C誘導(dǎo)表達(dá)，并在誘導(dǎo)后2h、4h、 6h、8h各收集ImL菌液，12000r .mirT1離心收集菌體。用50 μ L ρΗ7· 4 PBS懸浮，加入等量 的2 X上樣緩沖液，經(jīng)沸水浴處理lOmin，處理后的菌樣室溫IOOOOr · mirT1離心3min。取 10 μ L上清進(jìn)行SDS-PAGE，設(shè)未誘導(dǎo)菌液作為對照。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色，乙酸 脫色觀察結(jié)果。根據(jù)多抗原表位蛋白的表達(dá)情況確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6小時(shí)。確定了誘導(dǎo)時(shí)間后，在IPTG濃度分別為0. 1,0. 5,1. 0和1. 5mmol · Γ1的條件下 誘導(dǎo)6h，各收集ImL菌液，離心收集菌體。菌樣按上述方法處理后進(jìn)行SDS-PAGE確定蛋 白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)濃度。根據(jù)多抗原表位蛋白的表達(dá)情況確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為 1. Ommol · L-1。實(shí)施例5南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)和純 化挑取單個(gè)重組大腸桿菌BL21 (DE3)plysS/pGEX-VPl VP3菌落至3mL LB培養(yǎng) 基，加氨芐青霉素至終濃度為50μ g/mL，37°C搖床過夜培養(yǎng)，次日取10 μ L過夜菌液加入到 30mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，置37 °C搖床培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6 0. 8左右， 加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液(pGEX-VPl VP3) 30mL 12000r/min離心2min收集菌體，加 3mL MagneGST溶菌試劑，重懸細(xì)菌沉淀。加入300 μ L的RNase-Free DNase I，室溫，在搖 床上溫育細(xì)菌懸液30min，使其充分裂解。將裂解液與谷胱甘肽瓊脂糖 _4B (2ml勻漿液) 填料混勻，于室溫下，搖床吸附30min。用PBS充分洗去雜蛋白。按凝血酶剪切捕獲試劑盒 操作說明，加入酶切反應(yīng)液輕輕混勻，使二者充分混勻。于20. 5°C下放置，不斷輕輕搖勻，反 應(yīng) 12h。酶切體系如下IOx凝血酶剪切捕獲緩沖液稀釋的凝血酶(1 100)目的蛋白Ix PBS
300 μ L
1000 μ L 柱吸附蛋白量(yg) 1700 μ L
反應(yīng)結(jié)束后垂直固定GST柱，收集流出液，即為目的抗原的初產(chǎn)物。將收集的目的抗原液加入到處理好的透析袋中，透析液為lXPBS(pH7. 4)，每2h 換透析液一次。收集純化好的目的抗原，SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的酶切及純化效果。實(shí)施例6南非II型口蹄疫病毒的間接ELISA檢測方法1、ELISA相關(guān)溶液配方包被緩沖液(0.lmol/L 碳酸鹽緩沖液 ρΗ9· 6) =Na2CO3 3. 18g，NaHCO3 5. 86g，加蒸 餾水至1000mL。洗滌緩沖液(0.01mol/L PBST ρΗ7· 4，含 0· 05 % Tween-20) =Na2HPO4 · 12H20 2. 91g, NaH2PO4 · 2H20 0. 30g, NaCl 8. 50g, Tween-200. 5mL，加蒸溜水至 1000mL。封閉液明膠Ig溶于IOOmL PBS中。稀釋液雞卵清白蛋白(OVA)O. lg，加洗滌緩沖液至100mL。底物緩沖液(0.05mol/L 磷酸-檸檬酸 ρΗ5· 0) 0. 2mol/LNa2HP04 (28 . 4g/ L)25. 7mL,0. lmol/L 檸檬酸(19. 2g/L) 24. 3mL，加蒸餾水至 100mL。TMB使用液TMB(10mg/mL，溶解于二甲基甲酰胺DMF)150yL，底物緩沖液10mL， H2O2 6 μ L0終止液(lmol/LH2SO4)蒸餾水 578. 3mL，逐滴加入濃硫酸(98% )217. 7mL。2、南非II型口蹄疫間接ELISA檢測方法的步驟及判定標(biāo)準(zhǔn)(1)抗原包被濃度和血清最佳稀釋度的確定A、包被抗原用包被緩沖液(pH9. 6Na2C03-NaHC03)將目的抗原分別稀釋成 0. 1 μ g/ml、0. 2μ g/ml、0. 4μ g/ml、0. 8μ g/m、l. 6μ g/ml、3. 2μ g/ml、6. 4μ g/ml、12. 8μ g/ ml，每孔加入 100μ L，37°C 2h。B、封閉除去包被液，在紙上輕輕扣打以吸去殘留液體，加入洗滌緩沖液 (PBST) 300 μ L/孔，共洗滌3次；加入1 %明膠200 μ L/孔，37°C封閉2h。C、洗滌封閉完成后棄去板內(nèi)液體，用PBST洗滌5次。D、加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別稀釋為1 50、1 IOOU 200,1 400,1 800、 1 1600、1 3200、1 6400，以胎牛血清作為陰性對照血清，100 μ L/孔，37°C，lh。Ε、洗滌棄去板內(nèi)液體，用PBST洗滌5次。F、加入酶標(biāo)二抗加入1 10000稀釋的HRP-兔抗牛IgG，100yL/孔，37°C，lh。G、加底物液顯色用PBST洗滌5次后，在紙上輕輕扣干板內(nèi)殘留液體，加入新鮮配 制的TMB使用液，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)15min。H、終止反應(yīng)每孔加入50 μ L IM H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀下檢測OD45tl的值。測出0隊(duì)5(|值，根據(jù)陽性值(P)/陰性值(N)最高，陰性值最小的原則，棋盤分布法確 定最佳標(biāo)準(zhǔn)抗原的包被濃度為6. 4μ g/ml，最佳血清檢測的稀釋濃度為1 200，如表1和 表2所示。表1最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度的確定(OD45tl)
權(quán)利要求
一種南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VP1～VP3蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID No1所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述的南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白的基因，其 核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其出發(fā)載體為PGEX-6P-1。
5.含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的重組表達(dá)菌。
6.如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)菌，其出發(fā)菌株為BL21(DE3)plysS。
7.一種制備權(quán)利要求1所述多抗原表位VPl VP3蛋白的方法，其包括如下步驟1)將SEQID NO 2所示的DNA片段連入載體pMD_19T中，經(jīng)BamHI和SalI雙酶切后， 與經(jīng)過同樣雙酶切的PGEX-6P-1連接構(gòu)建得到表達(dá)載體pGEX-VPl VP3 ；2)將步驟1)的表達(dá)載體pGEX-VPl VP3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS感受態(tài)細(xì) 胞，篩選陽性克隆并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白；3)酶切和純化步驟2)的重組蛋白。
8.權(quán)利要求1所述的南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VPl VP3蛋白在檢測南非II 型口蹄疫病毒中的應(yīng)用。
9.一種用于檢測南非II型口蹄疫病毒的含有權(quán)利要求1所述多抗原表位VPl VP3 蛋白包被抗原的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了南非II型口蹄疫病毒多抗原表位VP1～VP3蛋白，以及編碼該多抗原表位蛋白核苷酸序列與原核表達(dá)載體pGEX-6P-1構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-VP1～VP3，將pGEX-VP1～VP3轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)plysS得到重組表達(dá)菌株，對重組表達(dá)菌表達(dá)的蛋白進(jìn)行酶切和純化，利用純化的表達(dá)蛋白建立南非II型口蹄疫特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測方法，該方法具有特異性好、敏感性強(qiáng)、快速、簡便、可靠等優(yōu)點(diǎn)，適合于大量樣品的快速檢測。
文檔編號C12N15/42GK101979406SQ201010111699
公開日2011年2月23日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者吳紹強(qiáng), 林祥梅, 王彩霞, 鄧俊花 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院