專利名稱：一種快速高效dna重組的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體為可對靶標(biāo)DNA進(jìn)行缺失、突變和插入外源DNA片 段，一種快速高效DNA重組的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
DNA重組技術(shù)自從20世紀(jì)70年代初期問世以來，經(jīng)過了近40年的發(fā)展歷程，無論 是在基礎(chǔ)理論研究領(lǐng)域，還是在生產(chǎn)實際應(yīng)用方面，都已經(jīng)取得了驚人的成績。DNA重組技 術(shù)不僅使整個生命科學(xué)的研究發(fā)生了前所未有的深刻變化，同時也有力地促進(jìn)了醫(yī)學(xué)科學(xué) 研究的發(fā)展，在疾病的臨床診斷、遺傳病的基因治療、新型疫苗的研制以及癌癥和艾滋病的 研究等諸多科學(xué)均已取得了相當(dāng)?shù)某删?。然而，利用限制性?nèi)切酶和連接酶為主要工具的傳統(tǒng)DNA重組技術(shù)，很難對像BAC 文庫這樣的大分子DNA進(jìn)行修飾。傳統(tǒng)DNA重組技術(shù)中，大多要求DNA片段上存在單一的 限制性內(nèi)切酶位點，而在大分子DNA中一般的內(nèi)切酶都存在多個位點。另外，大分子DNA的 體外操作困難、易斷裂，連接、轉(zhuǎn)化效率也隨DNA片段長度的增加而下降。如果可以在細(xì)菌體內(nèi)完成DNA重組操作，將可以解決以上傳統(tǒng)DNA重組技術(shù)中 存在的不足之處。研究發(fā)現(xiàn)，來自發(fā)光桿菌(Photorhabdusluminescens)的重組酶—— Plu2935和Plu2936可以在細(xì)菌體內(nèi)協(xié)同作用，完成DNA分子之間的重組。Plu2936為5，-3， 核酸外切酶，Plu2935為單鏈DNA退火蛋白。在進(jìn)行DNA重組時，Plu2936與雙鏈線性DNA片 段結(jié)合并按5，-3，方向降解DNA單鏈，在另外一條DNA鏈上產(chǎn)生3，突出端。接著，Plu2935 便與DNA 3，突出端結(jié)合，形成蛋白-DNA復(fù)合體。在受體DNA進(jìn)行復(fù)制時，蛋白-DNA復(fù)合體 尋找同源序列的DNA并退火，新成新的DNA分子。在Plu2935和Plu293重組酶的配合作用 下，帶有短同源臂(35 50bp)的供體DNA分子可以在體內(nèi)重組到受體DNA分子的同源區(qū) 域上，從而實現(xiàn)對DNA分子的替換、插入、刪除、突變等多種修飾。該重組酶體系對靶標(biāo)DNA 分子的大小沒有限制，不受內(nèi)切酶位點的限制，不需要體外鏈接和轉(zhuǎn)化過程，可以對各種大 小DNA分子進(jìn)行操作，尤其DNA大分子修飾方面具有獨特的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種快速高效DNA重組的方法及試劑盒，以 解決背景技術(shù)中的問題。一種快速高效DNA重組的方法包括以下兩步1.引物設(shè)計與PCR擴增因為Plu2935和Plu2936重組酶進(jìn)行DNA重組時，需要兩DNA片段之間有40bp以 上的同源序列，所以在擴增供體DNA的引物5’端應(yīng)引入40個堿基以上、與受體DNA片段同 源的序列。PCR擴增的條件一般為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45sec，58°C退火1. 5min， 72°C延伸1 3min(時間長短根據(jù)PCR產(chǎn)物大小設(shè)定，一般是lmin/lkb DNA)，30個循環(huán)， 最后72°C延伸IOmin0
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PCR產(chǎn)物用試劑盒進(jìn)行純化，去除模板DNA和剩余的引物。因為模板DNA可能會被 轉(zhuǎn)化進(jìn)BL-REC的感受態(tài)細(xì)胞，在抗性平板上生長，給陽性轉(zhuǎn)化子的篩選帶來困難。引物則 可以與PCR產(chǎn)物競爭受體DNA的同源序列，從而導(dǎo)致重組效率下降。2. DNA電轉(zhuǎn)化入重組酶表達(dá)工程菌的感受態(tài)細(xì)胞 將純化的PCR產(chǎn)物(供體DNA)與受體DNA片段按照摩爾比1 1混勻，取DNA混 合物(< IOyg)加入到BL-REC感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后加入到電轉(zhuǎn)杯中，1250v電擊一次。 在電擊杯中加入ImL復(fù)蘇液(S0C培養(yǎng)基，0. ImM的MgCl2溶液)，將細(xì)菌懸浮并轉(zhuǎn)移至Ep管 中，37°C復(fù)蘇lh，涂板，37°C倒置培養(yǎng)。挑轉(zhuǎn)化子，對重組DNA進(jìn)行酶切和PCR鑒定。一種快速高效DNA重組的試劑盒，本發(fā)明在大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá) 來自發(fā)光桿菌的重組酶基因——plu2935和plu2936，利用重組酶Plu2935和Plu2936共同 作用，在不需要體外酶切、鏈接的情況下完成DNA重組，達(dá)到快速、高效修飾DNA的目的，由 表達(dá)重組酶的感受態(tài)細(xì)胞、對照感受態(tài)細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)樣品、復(fù)蘇液組成。在本發(fā)明中，所述的重組酶的感受態(tài)細(xì)胞，由經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過的BL-REC工程菌制 備，所述的BL-REC工程菌，由克隆有發(fā)光桿菌重組酶基因的pET32a質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌 BL21 (DE3)中構(gòu)建而成，所述的發(fā)光桿菌重組酶基因，由plu2935和plu2936基因組成的共 表達(dá)框，所述的對照感受態(tài)細(xì)胞，由未經(jīng)誘導(dǎo)的BL-REC工程菌制備，所述的標(biāo)準(zhǔn)樣品，包括 PUC19質(zhì)粒和含同源序列的氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物組成，氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物，所述 的pUC19質(zhì)粒，200ng/l·! L的水溶液，所述的氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物，200ng/μ L的水溶 液，所述的復(fù)蘇液，由SOC培養(yǎng)基和0. ImM MgCl2溶液均勻混合而成。有益效果本發(fā)明操作簡單，效率較高，尤其在DNA大分子修飾方面具有獨特的優(yōu)勢。


圖1重組酶Plu2935和Plu2936的工作模型圖2重組酶表達(dá)質(zhì)粒pET-plu構(gòu)建圖3試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)樣品重組效率的檢測
具體實施例方式為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。一種快速高效DNA重組的方法及試劑盒，首先制備DNA重組試劑盒1.抽提發(fā)光桿菌總DNA將發(fā)光桿菌接種到LB斜面，30°C培養(yǎng)6 8h進(jìn)行活化，然后接一環(huán)于50ml LB液 體培養(yǎng)基中，30°C，200r/min搖床培養(yǎng)過夜。離心收集菌體，用TES溶液(lOmMTris-HCl， pH8. 0, ImM EDTA, IOOmM NaCl)沖洗一次。離心，沉淀重懸于TEl (25%蔗糖，25mM Tris-HCl, pH8.0,25mM EDTA)中，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為2 %，混勻使細(xì)胞裂解，加入 IM NaCl溶液，37°C溫育5min。離心，取上清，等體積酚氯仿抽提，2倍體積乙醇沉淀，70% 乙醇洗滌，吹干，用溶于一定體積的溶液TE2 (lOmMTris-HCl，pH8.0，ImM EDTA)中，再加入 IMNaCl, 10μ g/mlRNase,0. 6mg/ml蛋白酶K，37°C溫育30min。等體積酚氯仿抽提，乙醇沉淀，加IOOml水溶解沉淀，_20°C保存。2. PCR 擴增 plu2935 和 plu2936 基因設(shè)計引物兩對引物Plu5-F/Plu5-R，Plu6_F/Plu6-R。Plu5_F :5，-GCCCATGGCCA TGAGCACAGCAGTACAAAAAG-3‘ (Nco I), Plu5~R :5’ CTAGGGATCCTTATGATGCCTTTTTCC-3，(Bam H I) :Plu6~F 5’ -AAGGATCCCTAGCAGGAGGAATTCATATGATCAGCAATGAACTCATTC-3’ (BamH I)， Plu6~R :5’ GCGAGCTCTCATTTCCATTGATCGCCAAATTTG-3’ (Sac I)。以發(fā)光桿菌總 DNA 為模板， 以 Plu5-F/Plu5-R 或 Plu6_F/Plu6_R 為引物，分別 PCR 擴增 plu2935 基因和 plu2936 基因。 PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45sec，58°C退火 1. 5min，72°C延伸 1. 5min，30 個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。采用試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，_20°C保存。3.重組酶基因plu2935和plu2936克隆入pET32a載體Nco I和BamH I雙酶切pET32a和plu2935基因的PCR產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化DH5 α，獲 得的質(zhì)粒命名為pET-plu2935。BamH I和Sac I雙酶切pET_plu2935和plu2936基因的 PCR產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化DH5a，獲得重組酶表達(dá)質(zhì)粒pET-plu。將pET-plu轉(zhuǎn)入宿主菌BL(DE3) 中，獲得工程菌BL21-REC。4.制備高效表達(dá)重組酶的工程菌感受態(tài)細(xì)胞將工程菌BL21-REC接入5ml LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。按2%接種量轉(zhuǎn)接到 50ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)1. 5h左右，至OD600值達(dá)0. 2 0. 3，加入終濃度為lmmol/ L 的 IPTG，37°C培養(yǎng) lh，誘導(dǎo)表達(dá)重組酶 Plu2935 和 Plu2936。4°C，IOOOOrpm 離心 5min 收 集菌體，倒凈培養(yǎng)基，加入IOmL預(yù)冷無菌水，充分懸浮菌體。4°C，IOOOOrpm離心5min收集 菌體，倒凈無菌水，加入IOmL預(yù)冷無菌水，充分懸浮菌體。4°C，IOOOOrpm離心5min收集 菌體，倒凈無菌水，加入0. 5mL無菌水懸浮菌體，將感受態(tài)細(xì)胞按每管50 μ L分裝到EP管 中，_80°C保存。5.制備重組效率測試標(biāo)準(zhǔn)樣品和對照樣品為了檢測4中感受態(tài)細(xì)胞中重組酶Plu2935和Plu2936的重組活性，我們制備了 用于重組效率測定的標(biāo)準(zhǔn)樣品，包括氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物和pUC19質(zhì)粒。設(shè)計引物 對 Chl-F/Chl-R，PCR 擴增氯霉素抗性基因。Chl-F 5’ -ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAA AGGAAGAGTTACCTGTGACGGAAGATCACTTC-3，(下劃線部分40的堿基為pUC19質(zhì)粒同源序列，其 余部分為卡那霉素抗性基因的引物部分)，Chl-R :5’ -AATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG GTCTGACAGCATCCGCTTATTATCACTTATTC-3 ‘(下劃線部分40的堿基為pUC19質(zhì)粒同源序列，其 余部分為氯霉素抗性基因的引物部分)。氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物中存在40bp與pUC19 質(zhì)粒同源序列。同時，我們還設(shè)置了對照感受態(tài)細(xì)胞(Control)。除了不加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)外，對 照感受態(tài)細(xì)胞的制備與4中表達(dá)重組酶的BL21-REC工程菌制備完成一致。因為沒有進(jìn)行 IPTG誘導(dǎo)，對照感受態(tài)細(xì)胞中沒有重組酶Plu2935和Plu2935表達(dá)，無法進(jìn)行DNA重組，在 相應(yīng)抗生素平板上不會有克隆子出現(xiàn)。一種快速高效DNA重組的方法1.引物設(shè)計與PCR擴增因為Plu2935和Plu2936重組酶進(jìn)行DNA重組時，需要兩DNA片段之間有40bp以 上的同源序列，所以在擴增供體DNA的引物5’端應(yīng)引入40個堿基以上、與受體DNA片段同
5源的序列。PCR擴增的條件一般為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45sec，58°C退火1. 5min， 72°C延伸1 3min(時間長短根據(jù)PCR產(chǎn)物大小設(shè)定，一般是lmin/lkb DNA)，30個循環(huán)， 最后72°C延伸IOmin0PCR產(chǎn)物用試劑盒進(jìn)行純化，去除模板DNA和剩余的引物。因為模板DNA可能會被 轉(zhuǎn)化進(jìn)BL-REC的感受態(tài)細(xì)胞，在抗性平板上生長，給陽性轉(zhuǎn)化子的篩選帶來困難。引物則 可以與PCR產(chǎn)物競爭受體DNA的同源序列，從而導(dǎo)致重組效率下降。2. DNA電轉(zhuǎn)化入重組酶表達(dá)工程菌的感受態(tài)細(xì)胞將純化的PCR產(chǎn)物(供體DNA)與受體DNA片段按照摩爾比1 1混勻，取DNA混 合物(< IOyg)加入到BL-REC感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后加入到電轉(zhuǎn)杯中，1250v電擊一次。 在電擊杯中加入ImL復(fù)蘇液(S0C培養(yǎng)基，0. ImM的MgCl2溶液)，將細(xì)菌懸浮并轉(zhuǎn)移至Ep管 中，37°C復(fù)蘇lh，涂板，37°C倒置培養(yǎng)。挑轉(zhuǎn)化子，對重組DNA進(jìn)行酶切和PCR鑒定。利用本發(fā)明測定的plu2935和plu2936共表達(dá)框序列ATGAGCACAGCAGTACAAAAAGTTTATGAAATCATCAACCCGCTCAAGACTGAATTTGAGCAAATTTGTAGTGAGCCGGGCATAGTATTTAAACGTG
AGTCTGAATTTGCTATGCAGATATTCGCAAATAATGATTTTTTAGCCACAACTGCATTAAATAATCCGGTTTCAGCGCGTAGCGCAGTAATGAACATTGCAGCAATTGGCATTAGTCTAAACCCTGCGCAAAAGCTGGCTTATCTAGTGCCACGAAACAAAAGCGTGTGTCTTGATATCAGTTACATGGGTTTGATGCACATCGCTCAACAATCGGGTGCTATTAAGTGGTGTCAATCCGCTGTTGTTCGAAAAAATGACATATTCAAGCGCACATCTATTGATACTGCGCCAATTCACGAATACAACGAATTCGACACAGCGCAATCGAGGGGGGACATTGTCGGCGCGTATACAGTAATCAAAACGGATGACTGTGATTACATTACTCACACAATGAGAGCATCAGCTATATTTGATATCAGAGATAGATCATCGGCATGGATAGCATATAAAACAAAAGGGAAATCGTGTCCGTGGGTCACGGACGA
GGAACAAATGATTTTAAAAACCGTAGTCAAGCAGGCGGCTAAGTATTGGCCTCGCAGGGAGCGATTAGATAAAGCCATTGACTATGTAAACACAGAGGCGGGTGAAGGAATTGATTTTAGCAAAGGTCAAAACTCTTACATTGACGTAACTCCCGCAGCAGATAGCACAATCGAAAGTATAACAAACTTACTTACAACAATGAATAAAACTTGGGACGATGATTTACTTCCACTTTGTTCAAAGATATTCAGACGACAAATATTATCACCCGCCGAATTAACAGAGTCGGAGGCAATTAAAGCATCTGATTTTTTAAGGAAAAAGGCATCATAAGGATCCCTAGCAGGAGGAATTCATATGATCAGCAATGAACTCATTCTCAGCAAAACAGGGGTTGATTTGCTCACAGTCGAACAGGGAAGTCATGATTGGCAGCGGTTAAGATTGGGAGTAATAACGGCATCGGAAGCCGGAAAAGTGATATCAAAACCGCGTAGTGGTACAAAATGGACAGACATGAAGCTGACATATTTCTATACACTTCTGGGCGAAGTGTGCACAGGTAGTACGCCGGAAGTAAATGCAAAAACATTAGCGTGGGGAAAAAATTACGAAGAATCAGCAAGAGCAACTTTTGAATTTGTAGCTGATGTAAATGTAACGGAAACTTCAATTCTATTTAAAGATGAATCGCTCAGAACCGCATGCTCACCAGATGGTATTTG[0066TAGTGACGGACTTGGGCTTGAACTTAAATGTCCTTTTACTACTGCTGTA[0067TTTATGAAATTCCGCTTGGGTGGTTTTGATGCTATTAAATCTGAATATAT[0068GGCTCAAGTTCAATATTCGATGTGGGTCACAGGTAAAAATGAATGGTAC[0069TTTGCTAATTATGACCCGCGTATGACTCGTGAAGGGATTCATTACGTTGT[0070TGTTGAGCGTGACAACGAATATATGAGTCAGTTTAATGATATGGTTCCC[0071GATTTCATAGAAAAAATGGACGAATCATTAAATGAAATCGGCTTCAAAT[0072TTGGCGATCAATGGAAATGA[0073利用本發(fā)明測定的含同源序列的氯霉素抗性基因序列[0074ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTTACCTGTGA[0075CGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATAC[0076CGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC[0077ACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGG[0078CGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATG[0079GAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATC[0080GTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAA[0081CCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAA[0082AAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGA[0083TGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGG[0084TGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAAC[0085TGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCA[0086GTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTG[0087GCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAA[0088TCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGAC[0089AACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCG[0090ACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGA[0091TGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGAT[0092GAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTT[0093AAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGCTGTC[0094AGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATT[0095以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實施
例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也 應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種快速高效DNA重組的方法包括以下兩步(1).引物設(shè)計與PCR擴增Plu2935和Plu2936重組酶進(jìn)行DNA重組時，需要兩DNA片段之間有40bp以上的同源序列，所以在擴增供體DNA的引物5’端應(yīng)引入40個堿基以上、與受體DNA片段同源的序列。PCR擴增的條件一般為94℃預(yù)變性5min，94℃變性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min(時間長短根據(jù)PCR產(chǎn)物大小設(shè)定，一般是1min/1kb DNA)，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物用試劑盒進(jìn)行純化，去除模板DNA和剩余的引物，因為模板DNA可能會被轉(zhuǎn)化進(jìn)BL REC的感受態(tài)細(xì)胞，在抗性平板上生長，給陽性轉(zhuǎn)化子的篩選帶來困難，引物則可以與PCR產(chǎn)物競爭受體DNA的同源序列，從而導(dǎo)致重組效率下降；(2).DNA電轉(zhuǎn)化入重組酶表達(dá)工程菌的感受態(tài)細(xì)胞將純化的PCR產(chǎn)物(供體DNA)與受體DNA片段按照摩爾比1∶1混勻，取DNA混合物(＜10μg)加入到BL REC感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后加入到電轉(zhuǎn)杯中，1250v電擊一次。在電擊杯中加入1mL復(fù)蘇液(SOC培養(yǎng)基，0.1mM的MgCl2溶液)，將細(xì)菌懸浮并轉(zhuǎn)移至Ep管中，37℃復(fù)蘇1h，涂板，37℃倒置培養(yǎng)。挑轉(zhuǎn)化子，對重組DNA進(jìn)行酶切和PCR鑒定。
2.一種快速高效DNA重組的試劑盒，其特征在于由表達(dá)重組酶的感受態(tài)細(xì)胞、對照感 受態(tài)細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)樣品、復(fù)蘇液組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速高效DNA重組的試劑盒，其特征在于所述的重組 酶的感受態(tài)細(xì)胞，由經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過的BL-REC工程菌制備，所述的BL-REC工程菌，由克隆有 發(fā)光桿菌重組酶基因的pET32a質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中構(gòu)建而成，所述的發(fā)光桿菌 重組酶基因，由plu2935和plu2936基因組成的共表達(dá)框，所述的對照感受態(tài)細(xì)胞，由未經(jīng) 誘導(dǎo)的BL-REC工程菌制備，所述的標(biāo)準(zhǔn)樣品，包括pUC19質(zhì)粒和含同源序列的氯霉素抗性 基因PCR產(chǎn)物組成，氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物，所述的pUC19質(zhì)粒，200ng/ μ L的水溶液，所 述的氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物，200ng/ μ L的水溶液，所述的復(fù)蘇液，由SOC培養(yǎng)基和0. ImM MgCl2溶液均勻混合而成。
全文摘要
一種快速高效DNA重組的方法及試劑盒，通過提取發(fā)光桿菌的總DNA，以此為模板PCR擴增plu2935和plu2936基因，將plu2935和plu2936基因克隆入pET32a載體，構(gòu)建獲得重組酶表達(dá)載體pET-plu，將pET-plu導(dǎo)入BL21(DE3)中，獲得可表達(dá)重組酶Plu2935和Plu2936的工程菌BL21-REC。IPTG誘導(dǎo)BL21-REC，表達(dá)Plu2935和Plu2936重組酶，并制備成感受態(tài)細(xì)胞。將含有同源序列的兩DNA片段工轉(zhuǎn)化入BL21-REC感受態(tài)細(xì)胞，在相應(yīng)抗性平板上篩選獲得含重組DNA的轉(zhuǎn)化子。
文檔編號C12N15/09GK101899431SQ20101011340
公開日2010年12月1日 申請日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月25日
發(fā)明者萬俊松 申請人:萬俊松