專利名稱：：一種能用于構建cDNA文庫篩選的質粒載體的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說是一種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法。
背景技術：
：目前對于新基因的發(fā)現(xiàn)和功能研究往往要經過幾次的亞克隆，而對于一個cDNA文庫來說，要研究其功能要將整個文庫上百萬個基因通過亞克隆轉移到另一載體上研究功能，就會顧慮低拷貝基因被丟失等問題。而酵母雙雜交是常用的篩選基因功能的方法之一，但是很難獲得一個cDNA的定向克隆，因此，本發(fā)明在酵母雙雜交質粒pGADT7的基礎上進行改造，獲得一個既可用于全長cDNA的定向克隆、文庫構建、測序又能用于酵母雙雜交的篩選文庫的質粒pGADT7M。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在提供一種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法，以解決
背景技術：
中的不足?！N能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法，主要包括以下步驟1、將空載體pDNR-LIB的一個單克隆質粒，用Ndel和Xhol雙酶切后，回收短片段；2、將質粒pGADT7也用Ndel和Xhol雙酶切后回收大片段；3、這兩個片段通過T4DNA連接酶連接、轉化和測序鑒定。這個質粒載體就改造成了酵母雙雜交文庫的載體，命名為pGADT7M，這個載體上就含有兩個Sfil酶切位點，該載體是以pGADT7為基礎改造的，具備pGADT7所具備的用于細菌中復制、酵母中復制和表達，和酵母雙雜交等所具備的元件pUCori，Ampr，2iiori，LEU2，GAL4AD，PADH1，TADH1，SV40NLS，HATag等。有益效果本發(fā)明獲得一個既可用于全長cDNA的定向克隆、文庫構建、測序又能用于酵母雙雜交的篩選文庫的質粒pGADT7M。圖lpGADT7多克隆位點；圖2pDNR-LIB多克隆位點；圖3pGADT7M多克隆位點；圖4部分重組子的菌落PCR結果圖。具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明所涉及一種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法作進一步說明。實施例1:—種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法—、cDNA文庫構建l總RNA的提取與檢測在整個操作過程中戴手套；用新鮮的去離子水(Milli-Q-Grade)溶解RNA，不要用DEPC水，也不要使用滅菌過的水，滅菌時蒸氣污染的水會干擾后續(xù)的PCR反應。(1)取50-100mg組織樣品，用0.75mlTRIZOL豕丄S試劑勻槳，15-30。C靜置5min。(2)加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s后，15-3(TC靜置2-15min。(3)4。C、12，000g離心15min，取上層水相。(4)加入O.5ml異丙醇，15-30。C靜置10min后，4°C、12，OOOg離心10min，棄上清。(5)再加lml75%乙醇漂洗沉淀，5，OOOg離心5min，棄上清，真空干燥去除樣品中痕量的乙醇，加入適量無RNase的去離子水。(6)取1iU進行1%甲醛變性膠電泳，1y1用紫外分光光度計分別測定樣品在260nm、280nm波長上的光密度及初步估算RNA的純度，-S(TC保存?zhèn)溆谩μ崛〉腞NA進行甲醛變性膠電泳。加樣前，甲醛變性膠先預電泳5min，電壓降為5v/cm;隨后將樣品加至凝膠孔，可用已知大小的RNA作分子量標準參照物，按3-4v/cm的電壓進行電泳；紫外燈下觀察電泳結果。2磁珠法分離mRNA(1)在RNase-free的Eppendorf管中加入0.11.Omg的總RNA和RNase-free水至終體積為500(2)65。C加熱10min。(3)加入3ii1生物素標記的Oligo(dT)禾P13iil20XSSC于RNA中，輕輕混合，室溫放置逐漸冷卻至室溫，一般需10min左右。(4)同時配0.5XSSC1.2ml和0.1XSSC1.4ml.(5)將磁珠(SA-PMPs)輕晃散開，放入磁性分離架上，使SA-PMPs集中于管的一側(約30sec)，小心去上清，切不可離心。用0.3ml0.5Xssc漂洗SA-PMPs，用磁性分離架集中磁珠，去除上清，重復3次。(6)將漂洗后的SA-PMPs重新懸浮于0.lml0.5Xssc，注意漂洗后的SA-PMPs應在30min內使用。(7)將(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反應物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，輕輕搖勻，室溫下放10min。(8)用磁性分離架捕獲SA-PMPs，小心去上清，但不要棄去。用O.1XSSC，每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs懸浮，最后一次漂洗后盡可能多的吸取水相，而不攪動SA-PMPs.將SA-PMPs重新懸浮在0.lmlRNase-free水中，反復顛倒，使SA-PMPs散開，洗脫mRNA。(9)用磁性分離架捕獲SA-PMPs，將洗脫的mRNA吸入另一個新的E卯endorf管中。(10)將SA-PMPs再懸浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脫，與(11)步洗脫液合并。(11)將得到的mRNA溶液取幾微升進行凝膠電泳分析，若mRNA濃度不足以進行下一步的反轉錄，則需將得到的mRNA溶液濃縮(濃縮步驟見14-18)。(12)加0.1體積的3MNaAc和1.0體積的異丙醇于洗脫液中，-2(TC沉淀過夜。(13)4。C，13，000g離心60min。去上清，加入500ii170%乙醇混勻。(14)4°C，7，500g離心10min。(15)去上清，真空或空氣中自然風干，但不要太干，加適量RNase-free水溶解。(16)重復步驟5-12，將步驟8保留下的樣品重新上柱。注意事項所有操作均需要嚴格戴手套，戴口罩進行；如果totalRNA質量高，雜質少，就選擇Oligotex的方法分離mRNA，相反則可以用磁珠法。3cDNA的合成按CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit說明書操作。其原理是利用真核生物mRNA5'端的甲基化G(m76)且5'三磷酸鍵連接的特殊的帽子結構和3'端的PolyA尾的特點設計錨定引物，分別進行第一鏈合成，引物延伸合成第二鏈，酶切消化和柱回收cDNA，從而實現(xiàn)富集全長cDNA的目的。l)cDNA第一鏈的合成在5ill反應體系中加入下列組分(于冰上操作)1yg芋螺毒腺mRNA，SMARTIVolig皿cleotide和CDSIII/3'PCR引物各1y1，以超純水補齊體積，混勻，短暫離心。72。C溫育2min，冰浴2min，短暫離心，使混合物集于管底。依次加入2iU5XFirstStrandBuffer、1ii120,1/L的DTT、1ii110,1/L的d證Mix禾口1ii1PowerScriptRT(CLONTECH)后輕彈管壁，混勻并短暫離心。置PCR儀42。C反應lhr逆轉錄合成第一鏈，冰浴終止反應。加入1y1NaOH，68t:放置30min，冰上冷卻，短暫離心，-2(TC保存。2)引物延伸法擴增cDNA第二鏈在lOOiil的反應體系中加入下列組分lliU第一鏈產物，10XAdvantage2PCRBufferlOii1，50XdNTPsMix2ii1，20iimol/L上下游錨定引物各2ii1，50XAdvantage2PolymeraseMix2和超純水80補齊體積，然后將全部反應物混勻，放入預熱至95。C的PCR儀，運行如下反應程序95。C變性lmin后，繼續(xù)循環(huán)程序95。C15sec、68。C8min共3個循環(huán)，冷卻至4t:后取5iUPCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。剩余PCR產物于-2(TC保存。3)蛋白酶K消化在50iU上一步的PCR產物(2-3iigdscDNA)中力口入2iU蛋白酶K(20iig/iU)滅活DNApolymerase，45。C溫育20min，再經酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)和氯仿/異戊醇(24:1)混合液各抽提一次，取上清，加入10iU的3M乙酸鈉，1.3iU的糖原(20yg/yl)，260iil的室溫放置的95%乙醇，室溫14，OOOg離心20min，用80%乙醇洗滌沉淀，空氣干燥，加入79iU去離子水充分溶解沉淀。4)Sfil酶切消化在100iil的酶切體系中加入下列組分79ill的dscDNA，10iU10XSfiIBuffer，liU100XBSA和10ii1SfiI內切酶。充分混勻，短暫離心。5(TC溫育2hr后，加入2iU1%的二甲苯腈藍(xylenecyanol)混勻。5)cDNA的分級分離柱回收將上一步酶切消化好的dscDNA上樣到預處理好的CHR0MASPIN-400柱，分管收集5大小不一的dscDNA，每管1滴，當收集完16滴后，蓋上柱子上蓋；從每支收集管中取出5y1樣品進行電泳檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳確定符合要求的收集管號，集中后加入0.1倍體積的3MNaAc(pH4.8)、1.3yl的20mg/ml糖原及2.5倍體積的95%乙醇，-2(TC放置沉淀過夜；室溫14，OOOg離心20min;吸去上清，沉淀用80%乙醇洗滌，室溫14，OOOg離心5min，吸去上清，沉淀在空氣中干燥10min左右；用7iU去離子水溶解干燥后的dscDNA，-2(TC保存?zhèn)溆?，也可直接與載體連接。4dscDNA與載體的連接建立如下三個連接反應體系，同時設定對照反應體系，16t:連接16hr，以確定最佳連接比例。力B95iil滅菌的DEPC水到每個管中，加1.5iil甘糖原。吸打混勻。加入280y1冰冷的95%乙醇，混勻。-7(TC放置l-2hr。15，OOOg室溫離心20min。小心移走上清，干燥沉淀。分別用5iUDEPC水溶解干燥的核酸沉淀。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5cDNA文庫的轉化1)電轉化感受態(tài)細胞的制備(1)挑取單克隆菌落，投入盛有10mlLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中(同時做培養(yǎng)基的空白對照)。37。C，220rpm，培養(yǎng)14-16個小時。(2)第二天，以1:100的比例將這10ml菌液倒入1000mlLB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3小時，每半小時測一次0D，當OD值達到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)。(3)將菌液在冰上預冷30min，隨后將菌液分裝到500ml預冷的離心杯中，4。C，2500g離心10min。(4)棄上清，離心杯中加入少量去離子水，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4°C，4，OOOg離心10min。(5)棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯，4000g，4°C，離心10min。(6)棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油(滅菌，預冷)，重懸菌體，再加滿10%甘油，4。C，4，OOOg，離心10min。(7)棄上清，每個離心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300ii1/管分裝于1.5ml的離心管中，-80°〇冰箱中保存。(8)同時取100iil感受態(tài)加0.OlngpUC18直接電穿孔轉化，檢測轉化效率。(9)次日觀察轉化子生長情況，并記錄。2)電轉化連接產物電轉化DH5a感受態(tài)細胞每100y1菌液加入5y1連接產物或對照質粒溶液，混勻，轉入電轉化杯，冰浴不超過5min，用巻紙擦干外壁，馬上置于BioRad電穿孔儀進行電擊，電轉化參數(shù)電壓2.0kV;電流25iiF;電阻200Q;電擊時間4.5ms。電擊后立刻與800iU37t:預熱的S0C培養(yǎng)基混合，用槍混勻，盡量吸出杯內菌液，裝于干凈無菌的離心管中。37°C、225rpm復蘇細胞lhr，稀釋103，104，105分別涂布于Cm+的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16hr，觀察菌落生長情況，統(tǒng)計文庫滴度。轉化產物4t:存放備用。3)電擊杯清洗流程用清水將電擊杯稍沖一下。向電擊杯中加入的75X酒精浸泡2hr。棄去酒精，再用蒸餾水沖洗23遍，然后用lml的槍吸取超純水反復吹打電擊杯IO遍以上。加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30min。棄去無水乙醇，于通風廚內揮干乙醇。將清洗好的電擊杯放入-20°〇冰箱內待用。注1.不同樣品使用的電擊杯應分開；2.每周用75%酒精浸泡30min。6質粒文庫的擴增和保存將4。C存放轉化率最高的一個電轉產物涂布于105個15cm含Cm+的LB平板上，37t:培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16hr。留5個平板4t:存放測序，50個平板上的菌收集保存于-7(TC，另50個平板上的菌落用于堿裂解法提取質粒。7cDNA克隆PCR分析隨機挑取單菌落，分別溶于滅菌的去離子水中。建立一個25iU的PCR反應體系含菌落水1ii1，10XPCRBuffer2.5iil，dNTPMix，5'，3'引物和Taq酶各0.5ii1，用去離子水補足25iU。擴增循環(huán)95。C變性4min后，94。C30sec，68。C2min25個循環(huán)，68。C5min。取5iU電泳。電泳片段>500的克隆于LB/Cm+中擴增培養(yǎng)，進行序列測定并保存一份于-70。C。隨機挑取24個單克隆，利用載體多克隆位點兩端的M13正向和反向引物進行PCR擴增鑒定，兩引物之間約為280bp。PCR產物電泳表明，大小多在500bp以上，為重組子，文庫重組率超過99%?？紤]到毒素分子的長度較小(3-7kDa)，因此文庫中所包含的cDNA插入序列也會相對較短。以上結果和分析可以顯示該cDNA文庫在文庫重組子數(shù)、重組率和插入片段大小等方面均符合良好文庫的質量標準。二、酵母雙雜交1提取文庫質粒首先擴增構建cDNA文庫原始文庫取30iiL加入到3mL的S0C液體中混勻，均勻的涂布在12cm的含CM+的LB平板上，每板150yL，37。C過夜，用3mL的S0C刮取每個平板上的菌落，收集所有的克隆后，部分用20%的甘油LB液體培養(yǎng)基-7(TC保種，取200mL用QIAGEN公司的大提質粒試劑盒提取質粒。2Bait質粒自主轉錄活性的測定酵母AH109菌株的Trpl、Leu2、Ura3以及His3基因被敲除，因此，該菌株不能在缺乏TRP、LEU、URA或HIS任意一種營養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基上生長。此外，該菌株中還含有3個報告基因，分別為受GAL1啟動子控制的HIS3基因，受GAL2啟動子控制的ADE2基因和受MEL1啟動子控制的LacZ基因。經過測序鑒定，提取構建正確的Bait質粒，分別用醋酸鋰方法轉化到感受態(tài)酵母AH109細胞中。簡化的醋酸鋰轉化酵母細胞的方法如下挑取直徑為4-6mm的單克隆酵母至1.5mL的小離心管中，加50-100yL的1XTE，高速離心10-15s收集酵母細胞；然后加入1ygBait質粒、10mgcarrierDNA和PEG8000液體(800iiL50g/100mLPEG8000、200iiL1MpH7.5LiAc和100iiLDTT)，混勻后，45。C水浴45min，直接涂板在含X--gal的SD/-Trp平板上，3(TC培養(yǎng)4_6天，檢測是否有自激活現(xiàn)象。由于pGBKT7質粒中含有Trpl基因，因此，經轉化后含有Bait質粒的AH109細胞可以在SD/_Trp培養(yǎng)基上生長。3對毒腺酵母雙雜交cDNA文庫進行篩選本發(fā)明選擇順序轉化的方法(即在已攜帶Bait的AH109酵母細胞中轉入毒腺的酵母雙雜交cDNA文庫)來進行篩選，過程如下(1)將帶有Bait的AH109酵母在SD/_Trp平板上劃板，3-4天后，酵母長成直徑為2-3mm菌斑。挑取2_3個菌斑放入lmLSD/_Trp培養(yǎng)液中，漩渦分散酵母細胞，然后轉入50mLSD/-Trp培養(yǎng)液中；(2)250rpm、30。C搖菌16-18小時至穩(wěn)定期(菌濃度0D600>1.5);(3)酵母轉瓶至300mLSD/_trp培養(yǎng)液中，使0D6。。=0.2-0.3;(4)230-270rpm，30。C搖菌3小時左右，至0D600=0.4-0.6;(5)把酵母細胞倒入50mL離心管中，室溫下lOOOg，離心5min;(6)棄上清，用40mL滅菌水懸浮細胞，并將細胞打散，室溫下lOOOg，離心5min;(7)小心棄上清，用1.5mL新鮮配制的滅菌的1XTE/LiAc(TE:LiAc:ddH20=1:1:8)懸浮細胞，即含Bait質粒的酵母感受態(tài)細胞；(8)取出lmL酵母感受態(tài)細胞，加入50iig文庫DNA，2mgHerringtestscarrierDNA，6mL滅菌PEG/LiAc混合液(PEG:LiAc:TE=1:1:8)混勻，30°C、200rpm、培養(yǎng)30min;(9)取出加入700iiLDMSO、混勻；42。C水浴15min，每隔3min上下顛倒EP管以防酵母沉淀，冰浴l-2min;(10)1000g室溫下離心，棄上清、用lmL1XTE重懸細胞，取1iiL細胞用99iiL1乂1￡稀釋后，涂在50/-1卬/-1^11板上，用來測定轉化率；剩下的用0.99mL細胞用1XTE稀釋后均在涂數(shù)個SD/-Trp/-Leu/-His板上。同時轉化陽性對照pGADT7-T(0.1yg)+pGBKT7-53(0.1iig)+carrierDNA+感受態(tài)AH109酵母細胞(0.lmL)+PEG/LiAc混合液(0.6mL);陰性對照pGADT7-T(0.1iig)+pGBKT7_lam(0.1iig)+carrierDNA+感受態(tài)AH109酵母細胞(0.lmL)+PEG/LiAc混合液(0.6mL)，分別轉化后涂在SD/-Trp/-Leu板上培養(yǎng)。酵母細胞中的HIS基因敲除后經常出現(xiàn)泄漏(Leakage)，這也是在雙雜交技術應用過程中產生假陽性的原因之一。在SD/-Trp/-LeU/-His板上長出來的酵母仍然需要進行進一步嚴格的篩選。用滅菌濾紙影印在四缺板上SD/-HiS/-Trp/-Leu/Ade/X-gal繼續(xù)培養(yǎng)。該培養(yǎng)基中缺失的營養(yǎng)成分ADE對于酵母細胞的生長狀態(tài)具有顯著的影響，如果細胞中的Ade2基因沒有得到強表達，細胞即使能夠存活，其生長速度也會顯著降低，而且菌落將呈粉紅色；而X--gal的存在，則是對LacZ基因表達效率的測定，LacZ表達效率越高，菌落所呈現(xiàn)的藍色越深。在SD/-Trp/-Leu/-His板上長出來的酵母單克隆也可以用濾紙分析法進行進一步鑒定。溶液的的配置:Z-buffer(Na2HP04.7H2016.lg/L;NaH2P04.H205.50g/L;KCl0.75g/L;MgS04.7H200.246g/L)、Z-buffer/X-gal(Z-bufferlOOmL;P_巰基乙醇0.27mL;X-gal1.67mL)，具體操作步驟如下將濾紙剪成適當大小，挑取直徑為2-5mm的新鮮酵母菌于濾紙上，放在液氮中浸泡lOs，注意含酵母細胞的濾紙面朝上；另一塊同樣大小的濾紙放入盛有Z-buffer/X-gal的培養(yǎng)皿中，將其浸濕；取出液氮中的濾紙，待恢復至室溫后，覆蓋在培養(yǎng)皿中另一塊已浸濕的濾紙上，含酵母細胞的濾紙面朝上，避免產生氣泡，使其與溶液充分接觸；將培養(yǎng)皿蓋上，放置于3(TC溫育，并定期觀察了藍色克隆出現(xiàn)的時間。不同克隆顯色的時間不同，一般是30分鐘到8個小時，超過8個小時可視為假陽性。4藍色酵母中質粒的提取(1)接種一個藍色的單克隆至lmLSD/-trp-leu液體培養(yǎng)基中，轉速為260rpm、30。C培養(yǎng)24h;(2)14000g、室溫離心30s，徹底棄上清；(3)100iiL新配制3XSDS、0.2NNaOH(20%SDS15yL、2NNaOH10iiL、ddH2075iiL)，室溫放置15min、反復顛倒混勻，加500yLpH7.5的TE、顛倒混勻，加60yL3MNaAC，顛倒混勻；(4)力口600uLphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1)、漩渦混勻2min，14000g2min取上清至一新Enppendorf管中；(5)重復(4)(6)加650iiL冰異丙醇、顛倒混勻，-2(TC放置20min;(7)14000g離心5min，棄上清，加100yL的70%的乙醇;(8)14000g離心5min，棄上清，重懸在10yL的TE(pH7.5)中，取lyL電轉化，剩余的放-2(TC保存。5自激活實驗酵母雙雜交中假陽性出現(xiàn)還存在另外一種可能性如果cDNA文庫基因編碼的多肽或蛋白質片段具有與DNA結合的能力，那么該質粒所表達的AD/文庫蛋白融合蛋白自身即可以激活AH109細胞中報告基因的表達，而無須依賴于文庫蛋白與Bait蛋白之間的相互9作用。因此，對于篩選得到的文庫質粒DNA有必要進行進一步的假陽性排除。將在藍色酵母中提取的文庫質粒DNA轉入AH109中，涂在SD/-Leu平板上；3_4天后，克隆直徑長至2_3mm時，挑單克隆做顯色實驗。將在藍色酵母中提取的文庫質粒DNA和Bait質粒共轉入AH109酵母中，涂在SD/-Trp/-Leu平板上；3-4天后，克隆長至直徑為2_3mm時，挑單克隆至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上劃線，做顯色實驗。以順序轉化的方法，通過計算在SD/-Trp/-LeU板上長出的克隆數(shù)目，得出此方法的轉化率為3.9X104cfu/yg，篩選的文庫克隆數(shù)目有2.54X106個。在不加3-AT的SD/-His/-Trp/-Leu平板上，長出與pGBKT7DI和pGBKT7DII相互作用的克隆大約都有300個左右，這些陽性克隆繼續(xù)影印在SD/-His/-Trp/-Leu/Ade/X-gal的平板上培養(yǎng)，結果僅僅長出與pGBKT7DI和pGBKT7DII相互作用的克隆各一個。而在加3-AT的SD/-His/-Trp/-Leu平板上，長出與pGBKT7DI11和pGBKT7DIV相互作用的克隆分別有50個和80個，在SD/-His/-Trp/-Leu/Ade/X-gal的平板上沒有長出與pGBKT7DIII相互作用的陽性克隆，與pGBKT7DIV相互作用的克隆長出18個。濾紙分析方法鑒定相互作用的陽性克隆在8小時以內顯藍色。實施例2:—種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法—、cDNA文庫構建1總RNA的提取與檢測在整個操作過程中戴手套；用新鮮的去離子水(Milli-Q-Grade)溶解RNA，不要用DEPC水，也不要使用滅菌過的水，滅菌時蒸氣污染的水會干擾后續(xù)的PCR反應。(1)取50-100mg組織樣品，用0.75mlTRIZOL吐S試劑勻槳，15-30。C靜置5min。(2)加入O.2mL氯仿，劇烈振蕩15s后，15-3(TC靜置2-15min。(3)4。C、12，000g離心15min，取上層水相。(4)加入O.5ml異丙醇，15-30。C靜置10min后，4°C、12，OOOg離心10min，棄上清。(5)再加lml75X乙醇漂洗沉淀，5，000g離心5min，棄上清，真空干燥去除樣品中痕量的乙醇，加入適量無RNase的去離子水。(6)取1iU進行1%甲醛變性膠電泳，1P1用紫外分光光度計分別測定樣品在260nm、280nm波長上的光密度及初步估算RNA的純度，-S(TC保存?zhèn)溆?。對提取的RNA進行甲醛變性膠電泳。加樣前，甲醛變性膠先預電泳5min，電壓降為5v/cm;隨后將樣品加至凝膠孔，可用已知大小的RNA作分子量標準參照物，按3-4v/cm的電壓進行電泳；紫外燈下觀察電泳結果。2磁珠法分離mRNA(1)在RNase-free的Eppendorf管中加入0.11.Omg的總RNA和RNase-free水至終體積為500(2)65。C加熱10min。(3)加入3iU生物素標記的01igo(dT)和13iU20XSSC于RNA中，輕輕混合，室溫放置逐漸冷卻至室溫，一般需10min左右。(4)同時配0.5XSSC1.2ml和0.1XSSC1.4ml.(5)將磁珠(SA-PMPs)輕晃散開，放入磁性分離架上，使SA-PMPs集中于管的一側(約30sec)，小心去上清，切不可離心。用0.3ml0.5Xssc漂洗SA-PMPs，用磁性分離架集中磁珠，去除上清，重復3次。(6)將漂洗后的SA-PMPs重新懸浮于0.lml0.5Xssc，注意漂洗后的SA-PMPs應在30min內使用。(7)將(3)中的0ligo(dT)/mRNA退火反應物全部加人含漂洗好的SA-PMPs管中，輕輕搖勻，室溫下放10min。(8)用磁性分離架捕獲SA-PMPs，小心去上清，但不要棄去。用O.1XSSC，每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs懸浮，最后一次漂洗后盡可能多的吸取水相，而不攪動SA-PMPs.將SA-PMPs重新懸浮在0.lmlRNase-free水中，反復顛倒，使SA-PMPs散開，洗脫mRNA。(9)用磁性分離架捕獲SA-PMPs，將洗脫的mRNA吸入另一個新的E卯endorf管中。(10)將SA-PMPs再懸浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脫，與(11)步洗脫液合并。(11)將得到的mRNA溶液取幾微升進行凝膠電泳分析，若mRNA濃度不足以進行下一步的反轉錄，則需將得到的mRNA溶液濃縮(濃縮步驟見14-18)。(12)加0.1體積的3MNaAc和1.0體積的異丙醇于洗脫液中，-2(TC沉淀過夜。(13)4。C，13，000g離心60min。去上清，加入500ii170%乙醇混勻。(14)4°C，7，500g離心10min。(15)去上清，真空或空氣中自然風干，但不要太干，加適量RNase-free水溶解。(16)重復步驟5-12，將步驟8保留下的樣品重新上柱。注意事項所有操作均需要嚴格戴手套，戴口罩進行；如果totalRNA質量高，雜質少，就選擇Oligotex的方法分離mRNA，相反則可以用磁珠法。3cDNA的合成按CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit說明書操作。其原理是利用真核生物mRNA5'端的甲基化G(m76)且5'三磷酸鍵連接的特殊的帽子結構和3'端的PolyA尾的特點設計錨定引物，分別進行第一鏈合成，引物延伸合成第二鏈，酶切消化和柱回收cDNA，從而實現(xiàn)富集全長cDNA的目的。l)cDNA第一鏈的合成在5ill反應體系中加入下列組分(于冰上操作)1yg芋螺毒腺mRNA，SMARTIVolig皿cleotide和CDSIII/3'PCR引物各1y1，以超純水補齊體積，混勻，短暫離心。72。C溫育2min，冰浴2min，短暫離心，使混合物集于管底。依次加入2iU5XFirstStrandBuffer、1ii120,1/L的DTT、1ii110,1/L的d證Mix禾口1ii1PowerScriptRT(CLONTECH)后輕彈管壁，混勻并短暫離心。置PCR儀42。C反應lhr逆轉錄合成第一鏈，冰浴終止反應。加入1y1NaOH，68t:放置30min，冰上冷卻，短暫離心，-2(TC保存。2)引物延伸法擴增cDNA第二鏈在lOOiil的反應體系中加入下列組分11y1第一鏈產物，10XAdvantage2PCRBufferlOii1，50XdNTPsMix2ii1，20iimol/L上下游錨定引物各2ii1，50XAdvantage2PolymeraseMix2iU和超純水80iU補齊體積，然后將全部反應物混勻，放入預熱至95°C的PCR儀，運行如下反應程序95。C變性lmin后，繼續(xù)循環(huán)程序95。C15sec、68。C8min共3個循環(huán)，冷卻至4t:后取5iaPCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢領纟。剩余PCR產物于-2(TC保存。3)蛋白酶K消化在50iU上一步的PCR產物(2-3iigdscDNA)中加入2iU蛋白酶K(20yg/yl)滅活DNApolymerase，45。C溫育20min，再經酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)和氯仿/異戊醇(24:1)混合液各抽提一次，取上清，加入10iU的3M乙酸鈉，1.3iU的糖原(20yg/yl)，260ii1的室溫放置的95%7醇，室溫14，000g離心20min，用80%乙醇洗滌沉淀，空氣干燥，加入79iU去離子水充分溶解沉淀。4)Sfil酶切消化在100iil的酶切體系中加入下列組分79ii1的dscDNA，10ii1lOXSfiIBuffer，liU100XBSA和10ii1SfiI內切酶。充分混勻，短暫離心。5(TC溫育2hr后，加入2iU1%的二甲苯腈藍(xylenecyanol)混勻。5)cDNA的分級分離柱回收將上一步酶切消化好的dscDNA上樣到預處理好的CHR0MASPIN-400柱，分管收集大小不一的dscDNA，每管1滴，當收集完16滴后，蓋上柱子上蓋；從每支收集管中取出5y1樣品進行電泳檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳確定符合要求的收集管號，集中后加入0.1倍體積的3MNaAc(pH4.8)、1.3yl的20mg/ml糖原及2.5倍體積的95%乙醇，-2(TC放置沉淀過夜；室溫14，OOOg離心20min;吸去上清，沉淀用80%乙醇洗滌，室溫14，OOOg離心5min，吸去上清，沉淀在空氣中干燥10min左右；用7iU去離子水溶解干燥后的dscDNA，-2(TC保存?zhèn)溆茫部芍苯优c載體連接。4dscDNA與載體的連接建立如下三個連接反應體系，同時設定對照反應體系，16t:連接16hr，以確定最佳連接比例。力B95iil滅菌的DEPC水到每個管中，加1.5iil甘糖原。吸打混勻。加入280y1冰冷的95%乙醇，混勻。-7(TC放置l-2hr。15，OOOg室溫離心20min。小心移走上清，干燥沉淀。分別用5iUDEPC水溶解干燥的核酸沉淀。組分連接A(W)連接B(W)連接C(W)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5cDNA文庫的轉化1)電轉化感受態(tài)細胞的制備(1)挑取單克隆菌落，投入盛有10mlLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中(同時做培養(yǎng)基的空白對照)。37。C，220rpm，培養(yǎng)14-16個小時。(2)第二天，以1:100的比例將這10ml菌液倒入1000mlLB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3小時，每半小時測一次0D，當0D值達到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)。(3)將菌液在冰上預冷30min，隨后將菌液分裝到500ml預冷的離心杯中，4t:，2500g離心10min。(4)棄上清，離心杯中加入少量去離子水，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4°C，4，OOOg離心10min。(5)棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯，4000g，4°C，離心10min。(6)棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油(滅菌，預冷)，重懸菌體，再加滿10%甘油，4。C，4，OOOg，離心10min。(7)棄上清，每個離心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300ii1/管分裝于1.5ml的離心管中，-80°〇冰箱中保存。(8)同時取100iil感受態(tài)加0.OlngpUC18直接電穿孔轉化，檢測轉化效率。(9)次日觀察轉化子生長情況，并記錄。2)電轉化連接產物電轉化DH5a感受態(tài)細胞每100y1菌液加入5y1連接產物或對照質粒溶液，混勻，轉入電轉化杯，冰浴不超過5min，用巻紙擦干外壁，馬上置于BioRad電穿孔儀進行電擊，電轉化參數(shù)電壓2.0kV;電流25iiF;電阻200Q;電擊時間4.5ms。電擊后立刻與800iU37t:預熱的SOC培養(yǎng)基混合，用槍混勻，盡量吸出杯內菌液，裝于干凈無菌的離心管中。37°C、225rpm復蘇細胞lhr，稀釋103，104，105分別涂布于Cm+的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16hr，觀察菌落生長情況，統(tǒng)計文庫滴度。轉化產物4t:存放備用。3)電擊杯清洗流程用清水將電擊杯稍沖一下。向電擊杯中加入的75X酒精浸泡2hr。棄去酒精，再用蒸餾水沖洗23遍，然后用lml的槍吸取超純水反復吹打電擊杯IO遍以上。加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30min。棄去無水乙醇，于通風廚內揮干乙醇。將清洗好的電擊杯放入-20°〇冰箱內待用。注1.不同樣品使用的電擊杯應分開；2.每周用75%酒精浸泡30min。6質粒文庫的擴增和保存將4t:存放轉化率最高的一個電轉產物涂布于105個15cm含Cm+的LB平板上，37t:培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16hr。留5個平板4t:存放測序，50個平板上的菌收集保存于-7(TC，另50個平板上的菌落用于堿裂解法提取質粒。7cDNA克隆PCR分析隨機挑取單菌落，分別溶于滅菌的去離子水中。建立一個25iU的PCR反應體系含菌落水1ii1，10XPCRBuffer2.5iil，dNTPMix，5'，3'引物和Taq酶各0.5iil，用去離子水補足25ii1。擴增循環(huán):95。C變性4min后，94。C30sec，68。C2min25個循環(huán)，68°C5min。取5iU電泳。電泳片段>500的克隆于LB/Cm+中擴增培養(yǎng)，進行序列測定并保存一份于-70。C。隨機挑取24個單克隆，利用載體多克隆位點兩端的M13正向和反向引物進行PCR擴增鑒定，兩引物之間約為280bp。PCR產物電泳表明，大小多在500bp以上，為重組子，文庫重組率超過99%。考慮到毒素分子的長度較小(3-7kDa)，因此文庫中所包含的cDNA插入序列也會相對較短。以上結果和分析可以顯示該cDNA文庫在文庫重組子數(shù)、重組率和插入片段大小等方面均符合良好文庫的質量標準。二、酵母雙雜交l提取文庫質粒首先擴增構建cDNA文庫原始文庫取30iiL加入到3mL的SOC液體中混勻，均勻的涂布在12cm的含CM+的LB平板上，每板150yL，37。C過夜，用3mL的SOC刮取每個平板上的菌落，收集所有的克隆后，部分用20%的甘油LB液體培養(yǎng)基-7(TC保種，取200mL用QIAGEN公司的大提質粒試劑盒提取質粒。2Bait質粒自主轉錄活性的測定酵母AH109菌株的Trpl、Leu2、Ura3以及His3基因被敲除，因此，該菌株不能在缺乏TRP、LEU、URA或HIS任意一種營養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基上生長。此外，該菌株中還含有3個報告基因，分別為受GAL1啟動子控制的HIS3基因，受GAL2啟動子控制的ADE2基因和受MEL1啟動子控制的LacZ基因。經過測序鑒定，提取構建正確的Bait質粒，分別用醋酸鋰方法轉化到感受態(tài)酵母AH109細胞中。簡化的醋酸鋰轉化酵母細胞的方法如下挑取直14徑為4-6mm的單克隆酵母至1.5mL的小離心管中，加50-100yL的1XTE，高速離心10_15s收集酵母細胞；然后加入1ygBait質粒、10mgcarrierDNA和PEG8000液體(800iiL50g/100mLPEG8000、200iiL1MpH7.5LiAc和100iiLDTT)，混勻后，45。C水浴45min，直接涂板在含X--gal的30/-1"平板上，301:培養(yǎng)4-6天，檢測是否有自激活現(xiàn)象。由于pGBKT7質粒中含有Trpl基因，因此，經轉化后含有Bait質粒的AH109細胞可以在SD/_Trp培養(yǎng)基上生長。3對毒腺酵母雙雜交cDNA文庫進行篩選本發(fā)明選擇順序轉化的方法(即在已攜帶Bait的AH109酵母細胞中轉入毒腺的酵母雙雜交cDNA文庫)來進行篩選，過程如下(1)將帶有Bait的AH109酵母在SD/_Trp平板上劃板，3_4天后，酵母長成直徑為2-3mm菌斑。挑取2_3個菌斑放入ImLSD/_Trp培養(yǎng)液中，漩渦分散酵母細胞，然后轉入50mLSD/-Trp培養(yǎng)液中；(2)250rpm、30。C搖菌16-18小時至穩(wěn)定期(菌濃度0D6。。>1.5);(3)酵母轉瓶至300mLSD/_trp培養(yǎng)液中，使0D6。。=0.2-0.3;(4)230-270rpm，30。C搖菌3小時左右，至0D6。。=0.4-0.6;(5)把酵母細胞倒入50mL離心管中，室溫下1000g，離心5min;(6)棄上清，用40mL滅菌水懸浮細胞，并將細胞打散，室溫下1000g，離心5min;(7)小心棄上清，用1.5mL新鮮配制的滅菌的1XTE/LiAc(TE:LiAc:ddH20=1:1:8)懸浮細胞，即含Bait質粒的酵母感受態(tài)細胞；(8)取出lmL酵母感受態(tài)細胞，加入50iig文庫DNA，2mgHerringtestscarrierDNA，6mL滅菌PEG/LiAc混合液(PEG:LiAc:TE=1:1:8)混勻，30°C、200rpm、培養(yǎng)30min;(9)取出加入700iiLDMSO、混勻；42。C水浴15min，每隔3min上下顛倒EP管以防酵母沉淀，冰浴l-2min;(10)1000g室溫下離心5min，棄上清、用ImL1XTE重懸細胞，取1yL細胞用99iiL1XTE稀釋后，涂在SD/-Trp/-Leu板上，用來測定轉化率；剩下的用0.99mL細胞用1XTE稀釋后均在涂數(shù)個SD/-Trp/-Leu/-His板上。同時轉化陽性對照pGADT7-T(0.1yg)+pGBKT7-53(0.1iig)+carrierDNA+感受態(tài)AH109酵母細胞(0.ImL)+PEG/LiAc混合液(0.6mL);陰性對照pGADT7-T(0.1iig)+pGBKT7_lam(0.1iig)+carrierDNA+感受態(tài)AH109酵母細胞(0.lmL)+PEG/LiAc混合液(0.6mL)，分別轉化后涂在SD/-Trp/-Leu板上培養(yǎng)。酵母細胞中的HIS基因敲除后經常出現(xiàn)泄漏(Leakage)，這也是在雙雜交技術應用過程中產生假陽性的原因之一。在SD/-Trp/-LeU/-His板上長出來的酵母仍然需要進行進一步嚴格的篩選。用滅菌濾紙影印在四缺板上SD/-HiS/-Trp/-Leu/Ade/X-gal繼續(xù)培養(yǎng)。該培養(yǎng)基中缺失的營養(yǎng)成分ADE對于酵母細胞的生長狀態(tài)具有顯著的影響，如果細胞中的Ade2基因沒有得到強表達，細胞即使能夠存活，其生長速度也會顯著降低，而且菌落將呈粉紅色；而X--gal的存在，則是對LacZ基因表達效率的測定，LacZ表達效率越高，菌落所呈現(xiàn)的藍色越深。在30/-1卬/-1^11/-附8板上長出來的酵母單克隆也可以用濾紙分析法進行進-步鑒定。溶液的的配置:Z-buffer(Na2HP04.7H2016.lg/L;NaH2P04.H205.50g/L;KC10.75g/15L;MgS04.7H200.246g/L)、Z-buffer/X-gal(Z-bufferl00mL;P_巰基乙醇0.27mL;X-gal1.67mL)，具體操作步驟如下將濾紙剪成適當大小，挑取直徑為2-5mm的新鮮酵母菌于濾紙上，放在液氮中浸泡lOs，注意含酵母細胞的濾紙面朝上；另一塊同樣大小的濾紙放入盛有Z-buffer/X-gal的培養(yǎng)皿中，將其浸濕；取出液氮中的濾紙，待恢復至室溫后，覆蓋在培養(yǎng)皿中另一塊已浸濕的濾紙上，含酵母細胞的濾紙面朝上，避免產生氣泡，使其與溶液充分接觸；將培養(yǎng)皿蓋上，放置于3(TC溫育，并定期觀察了藍色克隆出現(xiàn)的時間。不同克隆顯色的時間不同，一般是30分鐘到8個小時，超過8個小時可視為假陽性。4藍色酵母中質粒的提取(1)接種一個新鮮藍色的酵母菌單克隆至4.5mLSD/-trp-leu液體培養(yǎng)基中，轉速為260rpm、30。C培養(yǎng)約48h;(2)14000g、室溫離心5min，棄上清，殘留液約50iiL;(3)力卩50iiLlyticas(母液5units/iiL)，漩渦混勻；(4)37°C、200-250rpm溫育2h，加50yLSDS，漩渦混勻，放-2(TC冰箱反復凍融5次；(5)接細菌質粒抽提試劑盒的操作往下做，最后水洗60iiL，旋轉濃縮至10iiL，取2yL電轉化，剩余的放-2(rc保存。5自激活實驗酵母雙雜交中假陽性出現(xiàn)還存在另外一種可能性如果cDNA文庫基因編碼的多肽或蛋白質片段具有與DNA結合的能力，那么該質粒所表達的AD/文庫蛋白融合蛋白自身即可以激活AH109細胞中報告基因的表達，而無須依賴于文庫蛋白與Bait蛋白之間的相互作用。因此，對于篩選得到的文庫質粒DNA有必要進行進一步的假陽性排除。將在藍色酵母中提取的文庫質粒DNA轉入AH109中，涂在SD/-Leu平板上；3_4天后，克隆直徑長至2-3mm時，挑單克隆做顯色實驗。將在藍色酵母中提取的文庫質粒DNA和Bait質粒共轉入AH109酵母中，涂在SD/-Trp/-Leu平板上；3-4天后，克隆長至直徑為2_3mm時，挑單克隆至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上劃線，做顯色實驗。以順序轉化的方法，通過計算在SD/-Trp/-LeU板上長出的克隆數(shù)目，得出此方法的轉化率為3.9X104cfu/yg，篩選的文庫克隆數(shù)目有2.54X106個。在不加3-AT的SD/-His/-Trp/-Leu平板上，長出與pGBKT7DI和pGBKT7DII相互作用的克隆大約都有300個左右，這些陽性克隆繼續(xù)影印在SD/-His/-Trp/-Leu/Ade/X-gal的平板上培養(yǎng)，結果僅僅長出與pGBKT7DI和pGBKT7DII相互作用的克隆各一個。而在加3-AT的SD/-His/-Trp/-Leu平板上，長出與pGBKT7DI11和pGBKT7DIV相互作用的克隆分別有50個和80個，在SD/-His/-Trp/-Leu/Ade/X-gal的平板上沒有長出與pGBKT7DIII相互作用的陽性克隆，與pGBKT7DIV相互作用的克隆長出18個。濾紙分析方法鑒定相互作用的陽性克隆在8小時以內顯藍色。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。權利要求一種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法，其特征在于，主要包括以下步驟(1)、將空載體pDNR-LIB的一個單克隆質粒，用NdeI和XhoI雙酶切后，回收短片段；(2)、將質粒pGADT7也用NdeI和XhoI雙酶切后回收大片段；(3)、這兩個片段通過T4DNA連接酶連接、轉化和測序鑒定，這個質粒載體就改造成了酵母雙雜交文庫的載體，為pGADT7M，這個載體上就含有兩個SfiI酶切位點，以pGADT7為基礎改造的，具備pGADT7所具備的用于細菌中復制、酵母中復制和表達，和酵母雙雜交等所具備的元件pUCori，Ampr，2μori，LEU2，GAL4AD，PADH1，TADH1，SV40NLS，HATag。2.根據權利要求l所述的一種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法，其特征在于，構建全長cDNA文庫，測序時可用T7通用測序引物。3.根據權利要求l所述的一種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法，其特征在于，用pGADT7M構建的全長cDNA文庫質粒，可轉化酵母，用于酵母雙雜交。全文摘要本發(fā)明公開了一種能用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法，該方法制備的載體包含單酶切而產生兩個不同粘末端的酶切位點SfiI，即可用于全長cDNA的定向克隆、文庫構建和測序；同時插入基因與GAL4的激活域融合，是一個酵母表達載體，可作為酵母雙雜交的篩選文庫。本發(fā)明獲得一個既可用于全長cDNA的定向克隆、文庫構建、測序又能用于酵母雙雜交的篩選文庫的質粒pGADT7M。文檔編號C12N1/19GK101775441SQ20101011698公開日2010年7月14日申請日期2010年3月3日優(yōu)先權日2010年3月3日發(fā)明者佘瑋,彭迎春申請人:彭迎春