專利名稱：一種提高蠶絲產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種提高蠶絲產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)和鱗翅目昆蟲(chóng)模式生物。在過(guò)去幾千年中，家蠶的蠶絲產(chǎn)量的提高主要通過(guò)傳統(tǒng)育種的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，存在著育種周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜，性狀保持不穩(wěn)定，優(yōu)良性狀難以整合等問(wèn)題。隨著家蠶基因組框架圖O004)及精細(xì)圖譜Q008)繪制工作的陸續(xù)完成，標(biāo)志人類對(duì)家蠶的研究和認(rèn)識(shí)開(kāi)始進(jìn)入后基因組時(shí)代，利用高效穩(wěn)定的遺傳操作技術(shù)從基因組水平對(duì)家蠶的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行改良成為一種可能。在現(xiàn)代生物學(xué)研究中，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)揮著日益重要的作用，它通過(guò)將人工分離或修飾過(guò)的基因有效導(dǎo)入生物體基因組中，實(shí)現(xiàn)同源的基因過(guò)表達(dá)或失活，異源基因的過(guò)表達(dá)，是一種強(qiáng)有力的遺傳操作工具。以往的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中對(duì)外源基因的表達(dá)凋節(jié)主要有兩種方法第一種是將靶基因接入到特異性啟動(dòng)子的下游來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)，可對(duì)靶基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的具體功能進(jìn)行系統(tǒng)研究；第二種是利用熱休克蛋白啟動(dòng)子(Heat Shock Promotor, Hsp)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，可通過(guò)調(diào)節(jié)熱休克時(shí)間和溫度來(lái)控制調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的時(shí)間和表達(dá)水平。這兩種方法已得到廣泛的應(yīng)用，但由于在這兩種系統(tǒng)中都是啟動(dòng)子直接調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，因此存在一定的局限性。前者的靶基因表達(dá)水平只能通過(guò)插入點(diǎn)的位置效應(yīng)和改變基因拷貝數(shù)來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，操作上比較困難。此外，如果靶基因是致死基因，這種轉(zhuǎn)基因系則無(wú)法建立。而熱休克蛋白由于在生物體中普遍存在，可導(dǎo)致后者表達(dá)缺乏特異性，另外在表達(dá)量上也存在不足。來(lái)源于鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞系的桿狀病毒的轉(zhuǎn)座子PiggyBac由于其較廣的寄主范圍及較高的轉(zhuǎn)座效率自2000年開(kāi)始被利用為轉(zhuǎn)基因載體進(jìn)行家蠶的轉(zhuǎn)基因研究。通過(guò)國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的不懈努力，家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)日趨成熟穩(wěn)定，并在基礎(chǔ)科學(xué)及應(yīng)用研究等方面發(fā)揮較大的作用。鑒于目前大部分家蠶生產(chǎn)性品種為滯育性品種，而針對(duì)滯育性品種的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)也已建立(家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因方法，申請(qǐng)?zhí)?00910103397. 6)。盡管目前通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)改造家蠶以獲得改良的品種在理論上完全可以實(shí)現(xiàn)， 然而仍然缺乏可切實(shí)有效地通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)獲得高產(chǎn)蠶絲的家蠶的技術(shù)。因此，本領(lǐng)域還需要繼續(xù)進(jìn)行深入研究，以開(kāi)發(fā)出方便有效的提高家蠶蠶絲產(chǎn)量的產(chǎn)品和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高蠶絲產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶的方法，在家蠶后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的方法是轉(zhuǎn)基因方法。在另一優(yōu)選例中，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因促家蠶后絲腺增大。
在另一優(yōu)選例中，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因選自(但不限于)GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl基因，PII基因(胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因)，InR基因(胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因)，Akt基因(胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因)，Yorkie基因(Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因)。較佳地，采用選用家蠶本身的GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl基因。更佳地，采用Rasl基因點(diǎn)突變后形成具持久活性的Rasla，編碼Raslv12。在另一優(yōu)選例中，所述蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善包括蠶繭體積增大，蠶繭重量增加，蠶絲增長(zhǎng)，蠶絲強(qiáng)度增強(qiáng)或蠶絲韌性增加。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(1)提供一種構(gòu)建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ )家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件(GAL4)；將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，獲得家蠶轉(zhuǎn)基因后代1 ；(2)提供一種構(gòu)建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ )下游激活序列(UAQ，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的基因；將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，獲得家蠶轉(zhuǎn)基因后代2 ；和(3)將家蠶轉(zhuǎn)基因后代1和家蠶轉(zhuǎn)基因后代2進(jìn)行雜交，得到后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的家蠶。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括提供一種構(gòu)建物，含有構(gòu)建物1和構(gòu)建物2 ；所述的構(gòu)建物1依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ )家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件 (GAL4)；所述的構(gòu)建物2依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一3’)下游激活序列 (UAS)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的基因；將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，得到后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的家蠶。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(Si)提供一種構(gòu)建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5’一 3’)家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件(GAL4)；(S2)提供一種構(gòu)建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5’一 3’)下游激活序列(UAS)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的基因；(S3)將(Si)和(S》的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，得到后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的家蠶。在另一優(yōu)選例中，構(gòu)建物1中，還含有表達(dá)報(bào)告基因1的表達(dá)盒1 ；構(gòu)建物2中， 還含有表達(dá)報(bào)告基因2的表達(dá)盒2 ；且所述的報(bào)告基因1不同于報(bào)告基因2 ；選擇同時(shí)呈現(xiàn)報(bào)告基因1相應(yīng)表型和報(bào)告基因2相應(yīng)表型的家蠶，該家蠶是后絲腺變大、蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶。在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因1和報(bào)告基因2選自(但不限于)綠色熒光蛋白(GFP)基因，增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)基因，紅色熒光蛋白(DsRec^)基因。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒1依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’) 3XP3啟動(dòng)子，報(bào)告基因1，終止子(較佳地，所述終止子是SV40終止子)；或所述的表達(dá)盒2依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ ) :3XP3啟動(dòng)子，報(bào)告基因2，終止子(較佳地，所述終止子是SV40終止子)。在另一優(yōu)選例中，所述的家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子選自(但不限于)絲心蛋白輕鏈啟動(dòng)子(Fil)，絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子(Fih)，p25啟動(dòng)子。
在另一優(yōu)選例中，構(gòu)建物1中，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件(GAL4)下游還包括一終止子(較佳地，所述終止子是HSP70終止子)；或構(gòu)建物2中，促細(xì)胞生長(zhǎng)基因下游還包括一終止子(較佳地，所述終止子是SV40 終止子)。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物是以轉(zhuǎn)座子作為骨架的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是基于鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞系的桿狀病毒的轉(zhuǎn)座子PiggyBac的轉(zhuǎn)基因載體。在另一優(yōu)選例中，所述的家蠶后絲腺重增加(或后絲腺增大)；后絲腺中GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl表達(dá)水平增加；后絲腺中bHLH( —種與產(chǎn)絲量正相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子)表達(dá)水平增加；后絲腺中Ras-GTP表達(dá)水平增加；或后絲腺中磷酸化MAPK (與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān))、Akt (胰島素信號(hào)傳導(dǎo)下游重要調(diào)節(jié)因子)、S6K或4EBP (TOR信號(hào)途徑中調(diào)控蛋白合成的重要因子)的含量增加。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物中，各元件之間直接相連，或者，各元件之間還含有其它核苷酸序列。另一方面，提供一種由所述的方法制備獲得的家蠶，該家蠶是蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶。另一方面，提供一種用于制備蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶的試劑盒，所述試劑盒中含有(1) 一種構(gòu)建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ ):家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件(GAL4)；(2) 一種構(gòu)建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ ):下游激活序列 (UAS)，促細(xì)胞生長(zhǎng)基因。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有家蠶(如一種野生型家蠶，如大造)的卵。另一方面，提供一種促細(xì)胞生長(zhǎng)基因或其編碼的蛋白的用途，用于制備蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因或其編碼的蛋白還用于增加家蠶后絲腺中bHLH表達(dá)水平；增加家蠶后絲腺中Ras-GTP表達(dá)水平；或增加家蠶后絲腺中磷酸化 MAPK, Akt、S6K 或 4EBP 的含量。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因選自GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl基因，PII基因，InR基因，Yorkie基因。較佳地，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因是GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl基因。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1顯示了構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體的示意圖，其中圖IA為載體Fil-GAL4/3XP3-DsRed 的基本結(jié)構(gòu)，圖IB為轉(zhuǎn)基因載體UAS-Raslvl73XP3-EGFP的基本結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了兩種轉(zhuǎn)基因家蠶雜交試驗(yàn)獲得的子代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E(-) D⑴，E⑴D⑴)幼蟲(chóng)基因型的示意圖。圖3A顯示了兩種轉(zhuǎn)基因家蠶的雜交后代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E(_)D(+)，E(+) D(+))的后絲腺(左)，蠶繭(中)和蛹(右)的表型觀察。在比較時(shí)，將四種基因型分為兩組進(jìn)行比較，其中一組為E-D-E+D-和E-D+，另一組為E+D+，這兩組分別取一平均水平進(jìn)行比較。圖:3B顯示了兩種轉(zhuǎn)基因家蠶的雜交后代(E(-)D(-)，E(+)D(-)，E(-)D (+)，E(+) D(+))的后絲腺、總絲腺、總蟲(chóng)重及之間比例的生物學(xué)統(tǒng)計(jì)。圖3C顯示了兩種轉(zhuǎn)基因家蠶的雜交后代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E(_)D(+)，E(+) D (+))的后絲腺中的Rasl表達(dá)水平，以及bHLH表達(dá)水平的比較。圖4顯示了兩種轉(zhuǎn)基因家蠶的雜交后代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E㈠D(+)，E(+) D(+))的Ras-GTP的表達(dá)水平檢測(cè)和比較。圖5顯示了兩種轉(zhuǎn)基因家蠶的雜交后代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E(_)D(+)，E⑴ D (+))的絲腺中的磷酸化MAPK、Akt、S6K和4EBP含量比較。圖6顯示了 Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察家蠶后絲腺情況。a和b圖為100倍視野下野生型與雙陽(yáng)性家蠶后絲腺的橫切面比較。c和d圖是在200倍視野下野生型與雙陽(yáng)性家蠶后絲腺的橫切面比較。圖7上圖顯示了掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞核核區(qū)染色質(zhì)。圖7下圖顯示了掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞核四周粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、囊泡和線粒體的數(shù)量和分布。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)增大家蠶后絲腺可以提高蠶絲產(chǎn)量，可通過(guò)在家蠶后絲腺中特異性高表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因或促后絲腺增大基因，獲得后絲腺增大 (包括重量和體積增加)的家蠶，所述的家蠶高產(chǎn)蠶絲、且蠶絲性能改善。本發(fā)明人還找到了較佳的促后絲腺生長(zhǎng)的基因——GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl (后文簡(jiǎn)稱Rasl)。本發(fā)明人還設(shè)計(jì)了合適的在家蠶后絲腺中特異性高表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的表達(dá)系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。在本文中，所述的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)包括啟動(dòng)子的變體，其通過(guò)插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來(lái)獲得。組織或器官特異型啟動(dòng)子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官或組織中。如本文所用，所述的“可操作(性)地連接”或“操作性連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動(dòng)子區(qū)被置于相對(duì)于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來(lái)自不同來(lái)源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對(duì)于該目的基因來(lái)說(shuō)是外源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來(lái)說(shuō)是“外源的”。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異性表達(dá)”是指目的基因在特定的時(shí)間和/或特定的組織表達(dá)。“組織特異性”又稱“器官特異性”，在一些調(diào)控元件的調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出其相關(guān)的發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。本發(fā)明中，所述的“后絲腺特異性表達(dá)”是指在家蠶后絲腺中特異表達(dá)。通常，如果在家蠶后絲腺中mRNA以比在其它組織或器官中高至少5倍，優(yōu)選至少高10倍，更優(yōu)選至少高100倍，最優(yōu)選至少高1000倍水平被表達(dá)，則認(rèn)為相關(guān)基因的表達(dá)是家蠶后絲腺特異性的。如本文所用，所述的“蠶絲產(chǎn)量高的家蠶”是指一種轉(zhuǎn)基因家蠶的后代，其在同樣的生長(zhǎng)條件下比野生型家蠶的蠶絲產(chǎn)量高10 %或更高(較佳地高20 %或更高；更佳地高 40%或更高；如高 50%，60%，80%，100%，200%或更高)。如本文所用，所述的“后絲腺增大的家蠶”是指一種轉(zhuǎn)基因家蠶的后代，其在同樣的生長(zhǎng)條件下比野生型家蠶的后絲腺大10%或更大(較佳地大20%或更高；更佳地大 40%或更高；如大50%，60%，80%，100%，200%或更大)；或后絲腺重量增加10%或更多 (較佳地增加20%或更多；更佳地增加40%或更多；如增加50%,60%,80%,100%,200% 或更多)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“含有”、“包括”或“具有”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”。如本文所用，所述“蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善”包括蠶繭體積增大，蠶繭重量增加，蠶絲增長(zhǎng)，蠶絲強(qiáng)度增強(qiáng)或蠶絲韌性增加等。蠶絲屬于天然高分子材料，分子與分子間是比較弱的范德華力，但因?yàn)楹瑲滏I，并且分子鏈間相互絞合，這種力還是很大的，所以具有一定的強(qiáng)度。強(qiáng)度與韌性是做為蠶絲纖維經(jīng)濟(jì)性狀的重要衡量指標(biāo)，強(qiáng)度與韌性的增強(qiáng)可擴(kuò)大蠶絲的運(yùn)用范圍。促細(xì)胞生長(zhǎng)基因?yàn)榱颂岣咝Q絲的產(chǎn)量，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)增大家蠶的后絲腺 (即促進(jìn)家蠶的后絲腺生長(zhǎng))可以非常有效地提高蠶絲產(chǎn)量。后絲腺增大的家蠶其體重增加，且產(chǎn)生的蠶繭也明顯增大。本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)，促細(xì)胞生長(zhǎng)基因可增大家蠶后絲腺，增加蠶絲產(chǎn)量，提高蠶絲品質(zhì)。因此，一類促細(xì)胞生長(zhǎng)基因或后絲腺增大基因均包括在本發(fā)明中，作為對(duì)于提高蠶絲的產(chǎn)量有用的物質(zhì)。所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因或后絲腺增大基因包括(但不限于)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖或分裂的基因，如和營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)的胰島素信號(hào)通路重要基因 PI3K、InR、Akt (參考文獻(xiàn) Regulation of tissue growth throughnutrient sensing. Hietakangas V, Cohen SM. Annu Rev Genet. 2009 ；43 :389-410)以及參與細(xì)胞增長(zhǎng)的 Hippo ff ^ ^ W Yorkie S @ ( Yorkie ；Regulation ofOrgan Size Jnsights From theDrosophila Hippo Signaling Pathway 2009 MadhuriKango-Singhl and Amit Singh2,3DEVEL0PMENTAL DYNAMICS 238 :1627-1637 Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila andmammals. Dong J,Feldmann G,Huang J,Wu S, Zhang N,Comerford SA,GayyedMF,Anders RA,Maitra A,Pan D. Cell. 2007Sep 21 ；130(6) 1120-33)。這些促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的變體也可用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明人還找到了較佳的促后絲腺生長(zhǎng)的基因Rasl，其對(duì)于家蠶的后絲腺的增大具有明顯的促進(jìn)作用，該基因在后絲腺中過(guò)表達(dá)后，家蠶的體重、后絲腺重均有明顯增加，產(chǎn)生的蠶繭和蠶蛹也明顯增大；也即過(guò)表達(dá)Rasl基因使得家蠶的蠶絲產(chǎn)量有明顯的提高。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因或后絲腺增大基因是Rasl基因(參考文獻(xiàn) Ras Activity in theDrosophila Prothoracic Gland Regulates Body Size and Developmental Rate viaEcdysone Release Philip E. Caldwell, Magdalena ffalkiewicz,and Michael Stem2005 Current Biology 15 1785-179 。Rasl 基因編碼一種小GTP結(jié)合蛋白，具有控制細(xì)胞增殖的重要作用，它主要是通過(guò)調(diào)節(jié)下游MAPK及PI3K/ AKT信號(hào)通路來(lái)行使功能。其活性形式的體現(xiàn)是通過(guò)與GTP (三磷酸鳥(niǎo)苷)結(jié)合來(lái)激活下游通路，失活時(shí)則改為結(jié)合⑶P ( 二磷酸鳥(niǎo)苷)并無(wú)法激活下游通路。所述的Rasl基因編碼具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列(NCBI登錄號(hào) BAD13777. 1)的蛋白或其衍生蛋白。所述的衍生蛋白是將SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(如1-20個(gè)；較佳地1-10 ；更佳地1-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，該衍生蛋白也具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或增大家蠶后絲腺功能。較佳地，所述的Rasl基因具有SEQ ID N0:l(Abl76555核苷酸序列中第212-790位)所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及嚴(yán)格條件下能夠與Rasl基因的核苷酸序列雜交且編碼的蛋白也具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或增大家蠶后絲腺功能的核酸。多核苷酸的雜交是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，特定的一對(duì)核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發(fā)明還涉及與所述Rasl基因或其突變體(如Raslvl2)的核苷酸序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少80%，較佳地至少90%，更佳地至少95%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸?！皣?yán)格條件”是指⑴在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2X SSC, 0. 1% SDS, 600C ；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選60%以上、65%以上、 70%以上、75%以上、80%以上、85 %以上或90 %以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。 并且，可雜交的多核苷酸編碼的Rasl蛋白或其衍生蛋白也具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或增大家蠶后絲腺的功能。較佳地，本發(fā)明采用一種突變形式的Rasl基因(RaslGA，編碼Raslvl2蛋白)，其可保持持續(xù)活性表達(dá)形式。所述的突變形式的Rasl基因編碼的蛋白的第12位氨基酸甘氨酸 (Glycine，縮寫(xiě)G)突變?yōu)槔i氨酸(Valine，縮寫(xiě)V)，其可持續(xù)性結(jié)合GTP，從而一直激活其下游信號(hào)通路。而在正常情況下Rasl與GTP或⑶P的結(jié)合是由細(xì)胞根據(jù)需要維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。本發(fā)明還包括與本發(fā)明的Rasl基因序列具有80%以上，更優(yōu)選90%以上，最優(yōu)選 95%以上相同性的核酸，所述核酸編碼的蛋白也具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或增大家蠶后絲腺的功能?！跋嗤浴笔侵赴凑瘴恢孟嗤陌俜直龋瑑蓷l或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。所述的Rasl基因還用于增加家蠶后絲腺中bHLH表達(dá)水平；增加家蠶后絲腺中 Ras-GTP表達(dá)水平；或增加家蠶后絲腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量。提高蠶絲產(chǎn)量的方法在得知了所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的用途后，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)調(diào)節(jié)所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的表達(dá)。比如，可通過(guò)本領(lǐng)域人員已知的途徑將攜帶促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)(特別是家蠶后絲腺)上，并使之表達(dá)活性的促細(xì)胞生長(zhǎng)蛋白。例如可設(shè)計(jì)含有促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的表達(dá)盒，使該表達(dá)盒在家蠶(特別是家蠶后絲腺)中表達(dá)，從而使家蠶(特別是家蠶后絲腺)表達(dá)(或過(guò)表達(dá)) 促細(xì)胞生長(zhǎng)蛋白。所述的含有促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的表達(dá)盒通常含有促細(xì)胞生長(zhǎng)基因以及與之操作性相連的其它元件，這些元件包括但不限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等。所述的啟動(dòng)子可以是組織或器官特異性的；當(dāng)需要在家蠶后絲腺中特異性表達(dá)時(shí)，所述的啟動(dòng)子是后絲腺特異表達(dá)啟動(dòng)子。所述的表達(dá)盒通?？砂诒磉_(dá)載體中用于轉(zhuǎn)化動(dòng)物。為了通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法提高蠶絲的產(chǎn)量，本發(fā)明人長(zhǎng)期以來(lái)作過(guò)多方面的嘗試，最終發(fā)現(xiàn)利用GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)在家蠶后絲腺中過(guò)表達(dá)Rasl對(duì)于提高家蠶蠶絲的產(chǎn)量是非常高效的。GAL4 (Galactose-Regulated Upstream Promoter Element 4，GAL4)是半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件，是酵母中類似于原核生物乳糖操縱子的一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子。下游激活序列UAS(upstream active sequence，UAQ是酵母中另一種類似高等真核生物增強(qiáng)子的序列。GAL4通過(guò)與UAS相結(jié)合，調(diào)節(jié)與半乳糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)。GAL4/UAS系統(tǒng)的基本原理在于GAL4-組織特異性啟動(dòng)子和UAS驅(qū)動(dòng)靶基因分別存在于兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系中。GAL4轉(zhuǎn)基因系中有轉(zhuǎn)錄激活子，但沒(méi)有靶基因；在UAS-靶基因系中，轉(zhuǎn)錄激活子不存在，因而靶基因處于沉默狀態(tài)，只有將GAL4轉(zhuǎn)基因系與UAS-靶基因系進(jìn)行雜交，才可能產(chǎn)生表達(dá)靶基因的后代。因此，本發(fā)明提供一種制備蠶絲產(chǎn)量高的家蠶的方法，所述方法包括(1)提供一種構(gòu)建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ )家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件(GAL4)；將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，獲得家蠶轉(zhuǎn)基因后代1 ；(2)提供一種構(gòu)建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ )下游激活序列(UAQ，促細(xì)胞生長(zhǎng)基因；將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，獲得家蠶轉(zhuǎn)基因后代2 ；和(3)將家蠶轉(zhuǎn)基因后代1和家蠶轉(zhuǎn)基因后代2進(jìn)行雜交，得到后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的家蠶。參照以上方法，還可以進(jìn)行合理的變通，這是本領(lǐng)域人員在參考了以上方法后易于做到的。例如也可以將兩個(gè)構(gòu)建物(較佳地還包括輔助質(zhì)粒)一起轉(zhuǎn)入到家蠶中，直接篩選陽(yáng)性后代；以及將兩個(gè)構(gòu)建物直接接入到一個(gè)載體中，轉(zhuǎn)入(較佳地還同時(shí)轉(zhuǎn)入輔助質(zhì)粒)到家蠶中，篩選陽(yáng)性后代。所述的家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子可以是任何特異性指導(dǎo)基因在家蠶后絲腺表達(dá)的基因。例如可選自(但不限于)絲心蛋白輕鏈啟動(dòng)子(Fil)，絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子 (Fih)或p25啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的變體也包括在本發(fā)明中，例如與所述啟動(dòng)子在嚴(yán)格條件下可雜交；或與所述啟動(dòng)子具有80%以上相同性，較佳地90% (更佳地95%以上，如98%， 99%)以上序列相同性的變體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子是絲心蛋白輕鏈啟動(dòng)子，其核苷酸序列如GenBank登錄號(hào)gi J89362中第378-1078位所示。在該片段內(nèi)進(jìn)行l(wèi)_30bp(較佳地l-20bp;更佳地I-IObp)內(nèi)核苷酸缺失或突變，不會(huì)影響該序列啟動(dòng)子活性。該啟動(dòng)子特別適合于與GAL4共同作用，驅(qū)動(dòng)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的表達(dá)。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)，絲心蛋白輕鏈啟動(dòng)子的非常適合于本發(fā)明的方法。蠶繭主要由在后絲腺分泌絲心蛋白和中絲腺分泌的絲膠蛋白兩部分組成，其中絲心蛋白在蠶繭中比例達(dá)到70-80%。作為絲素蛋白的重要組成部分絲心蛋白輕鏈(Fibroin light chain)，其啟動(dòng)子具有很高的活性，且不同家蠶品種的絲心蛋白輕鏈同源性很高，核苷酸序列同源性可達(dá)到95. 6%。較佳地，步驟(1)的構(gòu)建物中，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件(GAL4)下游還包括一終止子；較佳地，所述終止子是HSP70終止子。步驟O)的構(gòu)建物中，促細(xì)胞生長(zhǎng)基因下游還包括一終止子；較佳地，所述終止子是SV40終止子。從效果來(lái)看，分別采用不同的終止子 (HSP70終止子和SV40終止子)優(yōu)于都用SV40終止子這一情況。為了便于雜交后代的篩選，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，可以在兩種構(gòu)建物中分別插入報(bào)告基因。當(dāng)兩種構(gòu)建物分別被轉(zhuǎn)入家蠶后，獲得的轉(zhuǎn)基因后代可顯示出各自體內(nèi)存在的報(bào)告基因的相關(guān)特性或表型。當(dāng)分別攜帶各自的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行雜交獲得雜交后代后，可通過(guò)鑒定報(bào)告基因的表達(dá)情況，從而選擇到同時(shí)攜帶兩種報(bào)告基因的雜交后代。對(duì)于報(bào)告基因的選擇沒(méi)有特別的限制，只要其能夠呈現(xiàn)出一種獨(dú)特的、便于選擇的特性或表型。所述的報(bào)告基因例如可選自(但不限于)綠色熒光蛋白(GFP)基因，增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)基因，紅色熒光蛋白(DsRec^)基因，β-半乳糖苷酶(IacZ)基因。 如本文所用，“綠色熒光蛋白，，是指一種標(biāo)記蛋白，其內(nèi)源熒光基團(tuán)在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可高效發(fā)射清晰可見(jiàn)的綠光，且見(jiàn)光不易淬滅。綠色熒光蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)為了解和研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和光譜學(xué)功能關(guān)系提供了一個(gè)極好的機(jī)會(huì)?！霸鰪?qiáng)的綠色熒光蛋白” 為對(duì)綠色熒光蛋白進(jìn)行改進(jìn)后的蛋白，例如，可克隆自質(zhì)粒PEGFP-Nl (購(gòu)自Clontech)。如本文所用，“DsRed2”是指來(lái)源于珊瑚蟲(chóng)紅色熒光蛋白，其內(nèi)源熒光基團(tuán)在受到黃光激發(fā)時(shí)高效發(fā)射清晰可見(jiàn)的紅光，波長(zhǎng)范圍廣且不易淬滅，經(jīng)常與其它熒光蛋白配合使用進(jìn)行多禾中標(biāo)記。本發(fā)明所述的報(bào)告基因的表達(dá)盒是指一套可表達(dá)報(bào)告基因的基因系統(tǒng)，通常在5’ 至3’方向上包括了元件啟動(dòng)子、報(bào)告基因和終止子。以上構(gòu)建物中，各元件之間直接相連，或者，各元件之間還含有其它核苷酸序列， 所述其它核苷酸序列的長(zhǎng)度在l_500bp，較佳地l-200bp，更佳地l-50bp，更佳地l_30bp，更佳地l-15bpm^p，10bp。當(dāng)然，其它長(zhǎng)度(如更長(zhǎng))的間隔序列也是可以存在的，只要其存在不影響上述各元件之間的操作性相連，不抑制基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體?！氨磉_(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)?；蚱渌d體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可用的。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件，優(yōu)選地還包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明的多核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的重組表達(dá)載體。較佳地，所述的表達(dá)載體是以轉(zhuǎn)座子作為骨架的轉(zhuǎn)基因載體。多種轉(zhuǎn)基因都是可用的，例如 PiggyBac轉(zhuǎn)基因載體或Minos轉(zhuǎn)基因載體(參考文獻(xiàn)Uchino K等；2008. Construction of a piggyBac-basedenhancer trap system for the analysis of gene function in silkworm Bombyx mori. Insect Biochem Mol Biol.38,1165—1173)。
較佳地，所述的表達(dá)載體是基于鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞系的桿狀病毒的轉(zhuǎn)座子PiggyBac 的轉(zhuǎn)基因載體。在基于PiggyBac的轉(zhuǎn)化方法中，可以分別將兩個(gè)構(gòu)建物連同輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到家蠶中，篩選到陽(yáng)性后代再進(jìn)行雜交；也可以將兩個(gè)構(gòu)建物與輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入到家蠶中，直接篩選陽(yáng)性后代；以及將兩個(gè)構(gòu)建物直接接入到一個(gè)載體中，和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到家蠶中。將構(gòu)建物轉(zhuǎn)入家蠶的轉(zhuǎn)化方法除顯微注射法外，不排除用其他方法進(jìn)行家蠶轉(zhuǎn)基因，如精子介導(dǎo)法，參考文獻(xiàn)郭秀洋，周澤揚(yáng)，馮麗春，汪琳，魯成，向仲懷；2001 ；利用精子介導(dǎo)法向蠶卵導(dǎo)入外源基因的研究；生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展；28 03)423-425。在本發(fā)明的較佳實(shí)施方式中，利用在后絲腺特異性表達(dá)的絲心蛋白輕鏈啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GAL4系(Fil-GAL4)，而靶基因選用在多種模式動(dòng)物進(jìn)行廣泛及深入研究的可有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl，將其突變?yōu)槌掷m(xù)活性表達(dá)形式Raslv12連入到UAS 后(UAS-Raslvi2)，通過(guò)PiggyBac轉(zhuǎn)基因載體以二化性生產(chǎn)品種大造為材料顯微注射獲得兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因家蠶后代后，進(jìn)行雜交得到雙陽(yáng)性后代，發(fā)現(xiàn)其個(gè)體大小，后絲腺體積以及蠶繭大小與野生型或單陽(yáng)性后代相比都有顯著的提高，隨后用表型觀察，生物學(xué)統(tǒng)計(jì)，分子生物學(xué)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。本發(fā)明還包括利用上述方法獲得的體重增加、后絲腺增大、蠶絲產(chǎn)量高的轉(zhuǎn)基因家蠶的后代。此外，相對(duì)于野生型家蠶，本發(fā)明的方法獲得的家蠶還具有以下特性后絲腺中GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl表達(dá)水平增加；后絲腺中bHLH表達(dá)水平增加；后絲腺中Ras-GTP表達(dá)水平增加；或后絲腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量增加。本發(fā)明還包括利用上述方法獲得的各種家蠶轉(zhuǎn)基因后代，或者是它們的卵。試劑盒基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種用于制備蠶絲產(chǎn)量高的家蠶的試劑盒，所述試劑盒中含有(1) 一種構(gòu)建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ ):家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件(GAL4)；(2) 一種構(gòu)建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ ):下游激活序列 (UAS)，促細(xì)胞生長(zhǎng)基因。較佳地，每一構(gòu)建物中還分別含有一報(bào)告基因。上述的構(gòu)建物1和構(gòu)建物2可以存在于一個(gè)總的構(gòu)建物中，用于轉(zhuǎn)化家蠶；也可分別轉(zhuǎn)化家蠶。所述的試劑盒中還可含有家蠶(如一種野生型家蠶)卵。以便于人們將之作為轉(zhuǎn)基因的受體。所述的試劑盒中還可含有轉(zhuǎn)基因操作中有用的試劑和材料，以便于人們進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作。例如含有PBS注射緩沖液，注射用輔助質(zhì)粒(含有PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的編碼基因)， 顯微注射針等。此外，所述的試劑盒中還可含有使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.與家蠶傳統(tǒng)育種相比，首次直接在產(chǎn)絲的主要器官后絲腺表達(dá)(過(guò)表達(dá))促細(xì)胞生長(zhǎng)基因，從而促使后絲腺體積和重量增長(zhǎng)，進(jìn)而在產(chǎn)絲量上有了較為明顯的提高。為家蠶品種的產(chǎn)絲性狀改良提供一個(gè)新的手段和方法。2.作為一種優(yōu)選方法，本發(fā)明以GAL4/UAS雙熒光轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)為平臺(tái)，在家蠶后絲腺特異性過(guò)表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因或促后絲腺生長(zhǎng)的基因(Raslvl2)，發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)性后代的后絲腺體積和重量與野生型相比增加近1倍，上蔟吐絲形成的蠶繭與野生型相比也有明顯的增大，并且在個(gè)體總重量上與野生型相比也有一定的增加。為提高特定品種家蠶的產(chǎn)絲經(jīng)濟(jì)性狀提供了有力的途徑。3.利用本發(fā)明的方法針對(duì)生產(chǎn)性品種進(jìn)行蠶絲性狀的改良，可以直接將生產(chǎn)品種作為遺傳操作材料，避免煩瑣而漫長(zhǎng)的育種周期，直接利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出高蠶絲產(chǎn)量的品種，大大縮短育種周期，也節(jié)省大量的人力和物力。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體Fil-GAL4/3XP3-DsRed 見(jiàn)圖 1A。UAS-Ras 1V12/3XP3_EGFP 見(jiàn)圖 IB。上述兩種載體均以Piggybac轉(zhuǎn)座子為轉(zhuǎn)基因基本骨架，其中GAL4系選用在后絲腺特異性表達(dá)的絲心蛋白輕鏈作為啟動(dòng)子，篩選標(biāo)記選用在眼和神經(jīng)節(jié)特異性表達(dá)的人工啟動(dòng)子3XP3驅(qū)動(dòng)的紅色熒光DsRed2。UAS系攜帶持續(xù)活性形式的Raslvl2,篩選標(biāo)記改為綠色熒光EGFP。Fil-GAL4/3XP3-Dslted 載體構(gòu)建過(guò)程，其中原始載體為 pBacA3-GAL4/3XP3_DsIted (獲自日本國(guó)立農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，參考文獻(xiàn)AnjangTan，Hiromasa Tanaka，Toshiki Tamura, Takahiro Shiotsuki 2005. Precociousmetamorphosis in transgenic silkworms overexpressing juvenile hormone esterase. Proc Natl Acad Sci. 102 11751-11756), 該載體A3啟動(dòng)子兩端分別具有AscI與SacII位點(diǎn)，將Fil啟動(dòng)子利用引物上游 5，-attGGCGCGCCtgc atattggaca tcc_3，(大寫(xiě)為 AscI 限制性酶切位點(diǎn))，下游 5，-attCC GCGGtaggcttcattttagtggtctgt-3，(大寫(xiě)為^icII限制性酶切位點(diǎn))將Fil基因組序列上游692bp包含了 TATA box的啟動(dòng)子序列用PCR方法從家蠶基因組中擴(kuò)增出來(lái)連入T載體測(cè)序確認(rèn)后，利用AscI酶與SacII酶將該片段與pBacA3-GAL4/3XP3-DSRed進(jìn)行酶切連接， 得到 pBacFil-GAL4/3XP3-DsRed 載體。UAS-Ras 1V12/3XP3-EGFP 載體構(gòu)建利用 pUAS-EGFP-m 載體(獲自 clontec 公司； 目錄號(hào)6085-1)。將Rasl蛋白(GenBank登錄號(hào)abl76555)編碼序列克隆入T載體，利用Overlapping PCR方法將Rasl蛋白第12位氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子GGA突變?yōu)镚TA(甘氨酸一纈氨酸)，將突變后的Raslvl2利用引物上游5，-cgcGAATTCatgaccgag tacaaattgg tggt-3，(大寫(xiě)為 EcoRI 限制性酶切位點(diǎn))，下游 5，-taaGCGGCCGCttaaaaaagggtgcaatcttt aat-3’ (大寫(xiě)為NotI限制性酶切位點(diǎn))從包含該片段的T載體擴(kuò)增出后，用EcoRI與NotI 分別將Raslvl2與pUAS-EGFP-Nl進(jìn)行酶切連接，得到UAS-Raslvi2片段，再次利用該片段兩端的NheI和AflII酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切連入到包含同樣位點(diǎn)的pBac3XP3-EGFP(獲自南方模式動(dòng)物研究中心，參考文獻(xiàn) Dai H，Jiang R，Wang J，Xu G，Cao M，Wang Z，F(xiàn)ei J. 2007. Development of a heat shock inducible and inheritabIeRNAi system in silkworm. Biomol Eng. 24,625-630)中得到 pBacUAS-Raslvl2/3XP3-EGFP。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因蠶獲得及雜交后代的實(shí)驗(yàn)分析在二化性品種大造(獲自西南大學(xué))上通過(guò)顯微注射方法分別獲得以上兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因家蠶。具體方法待蠶蛹羽化后收集同時(shí)化蛾的雌雄蠶蛾，在25°C弱光下交配4 小時(shí)候拆對(duì)，將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環(huán)境中產(chǎn)卵，每隔半小時(shí)收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25°C環(huán)境中保護(hù)。并在產(chǎn)卵3小時(shí)內(nèi)用Eppendorf顯微注射儀，將 10-15nl，總濃度 400ng/ul 的 Fil-GAL4/3XP3_DsRed 或 UAS-Ras 1V12/3XP3_EGFP 攜同輔助載體(pigA4，獲自西南大學(xué))，注射到蠶卵中，用無(wú)毒膠水封住注射口，經(jīng)35%的甲醛蒸汽消毒5分鐘后，置于25°C，相對(duì)濕度85%的環(huán)境中孵化，將孵化出的GO代蟻蠶用人工飼料飼養(yǎng)至化蛾，獲得的GO代蠶蛾，通過(guò)自交或回交得到Gl代蠶卵，用Olympus熒光顯微鏡篩選， 分別得到綠色熒光及紅色熒光陽(yáng)性的蛾圈。將前述分別轉(zhuǎn)入兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行雜交試驗(yàn)，對(duì)獲得的子代幼蟲(chóng)基因型進(jìn)行熒光鑒定(共四種，1.無(wú)任何熒光E(-)D(-)，2.只有綠色熒光E(+)D(-)，3.只有紅色熒光E(-)D(+)，4.既有紅色熒光又有綠色熒光E(+)D(+))。待發(fā)育至5齡末期(從卵中孵化出后經(jīng)4次蛻皮的家蠶)上蔟后，將蠶分別從總體重、總絲腺重、后絲腺重三方面進(jìn)行稱量并取出后絲腺進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，對(duì)上蔟后吐絲結(jié)成的蠶繭以及化蛹情況進(jìn)行了初步觀察。兩種轉(zhuǎn)基因家蠶雜交試驗(yàn)獲得的子代幼蟲(chóng)基因型鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。A.后絲腺，蠶繭和蛹的表型觀察在對(duì)四種基因型的家蠶后絲腺，蠶繭及蛹進(jìn)行表型觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，GAL4/UAS雙色熒光陽(yáng)性后代與單陽(yáng)性及野生型后代相比均有較顯著的增大，見(jiàn)圖3A。初步證實(shí)，在后絲腺中過(guò)表達(dá)Raslvl2可從后絲腺，蟲(chóng)重及蠶繭大小上對(duì)家蠶帶來(lái)正面的增強(qiáng)效應(yīng)。蠶繭變大也即表明蠶絲的產(chǎn)量增加。進(jìn)行比較時(shí)將四種不同基因型(包括雙陽(yáng)性單陽(yáng)性及野生型)分成兩大組，雙陽(yáng)性為一組，單陽(yáng)性及野生型為一組，進(jìn)行得組間比較。B.后絲腺、總絲腺、總蟲(chóng)重及之間比例的生物學(xué)統(tǒng)計(jì)通過(guò)對(duì)四種不同基因型家蠶的總體重，后絲腺重，以及后絲腺與總絲腺，后絲腺與總體重比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3B，可發(fā)現(xiàn)GAL4/UAS雙陽(yáng)性蠶(E(+)D(+))的這四項(xiàng)指標(biāo)與其它三種基因型相比具有顯著的提高。重要的是，后絲腺的重量，尤其是后絲腺與總體重的比值的增幅達(dá)到近一倍，證明利用GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)確實(shí)能提高家蠶蠶絲的產(chǎn)量。C.從分子生物學(xué)水平進(jìn)行的相關(guān)驗(yàn)證利用定時(shí)實(shí)量PCR(即RealtimePCR方法，試劑選用日本東洋紡公司的STOR Green Realtime PCR Master mix，儀器選用Biorad公司IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀，Rasl引物為rasl-s ggacgaatacgatcccacgat ；rasl-a :gacggcgaataccagcaaga。內(nèi)參基因選用Bmrp49引物為Rp49-s 5， -CGTCACCAGTCGGATCGTTAT-3，；Rp49-a 5， -AGCATGTGACGGGTCTTCTTA-3，。
反應(yīng)體系為模板1. 0μ 1 ；Realtime Master Mix 10 μ 1 ；
引物1 QO μ Μ)0. 5μ 1 ；引物2 QO μ Μ)0. 5μ 1 ；(MH2O至 20 μ 1。反應(yīng)條件選用三三步法條件為95°c預(yù)變性lmin，95°C變性k，55°C退火1 ，2°C延
伸15s，40個(gè)循環(huán)。以內(nèi)參基因的循環(huán)數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算目的基因相對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)水平的變化，將最低相對(duì)值設(shè)為1，其它值分別與最低值進(jìn)行比較即可。檢測(cè)Rasl在四種基因型后絲腺的轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)性后代的后絲腺中的 Rasl表達(dá)水平最高，可達(dá)到單陽(yáng)性及野生型后代的9-10倍，圖3C。檢測(cè)在高產(chǎn)絲家蠶品種高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子bHLH基因轉(zhuǎn)錄水平，引物為W!lh3s gacgactccaaccacgat ；bhlh3a :tccaagtggcgaatgtaa0也發(fā)現(xiàn)該基因在雙陽(yáng)性的后絲腺的表達(dá)水平比其它三種基因型的要高2-3倍。實(shí)施例3、Rasl-GTP的表達(dá)水平檢測(cè)利用Rasl活性檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自Millipore公司，目錄號(hào)17-218)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因家蠶雜交后代中活性形式的Ras即Ras-GTP的表達(dá)水平變化，分別將四種基因型蠶后絲腺稱取50mg，利用試劑盒提供的MLB裂解液裂解后離心吸取上清，每0. 5ml細(xì)胞提取液加入 IOul含有活性形式Rasl結(jié)合底物Raf-I RBD瓊脂糖。在4°C孵育45分鐘后，快速短暫離心，吸去上清，用MLB洗滌液洗三次，將瓊脂糖重懸到40ul 2 X Laemmli還原型上樣緩沖液中，沸水煮5分鐘，短暫離心取上清20ul進(jìn)行SDS蛋白質(zhì)電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST進(jìn)行封閉，按順序上Rasl —抗比例1 1000，4°C搖床過(guò)夜， 洗滌，加入Hrp標(biāo)記的二抗，比例1 2000室溫2小時(shí)，洗滌后用ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)活性形式Ras的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單陽(yáng)性及野生型后代相比，GAL4/UAS雙色熒光陽(yáng)性后代(E(+)D(+))的Rasl-GTP表達(dá)水平顯著提高，證實(shí)Raslv12的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)活性形式的 Ras-GTP表達(dá)量提高，進(jìn)而可對(duì)Ras下游的信號(hào)通路產(chǎn)生影響。實(shí)施例4、家蠶后絲腺中的磷酸化MAPK、Akt、S6K和4EBP含量分析以Rasl/MAPK信號(hào)通路下游的MAPK磷酸化水平作為指標(biāo)，用^festernblot的方法檢測(cè)四種基因型的后絲腺中的磷酸化MAHi含量。分別取四種基因型家蠶后絲腺組織，用碧云天公司的RIPA強(qiáng)裂解液抽提總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白量后，分別取20ug蛋白與5X 蛋白上樣緩沖液混合進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。其中磷酸化MAPK的兔源一抗購(gòu)自Cell Signaling 公司，內(nèi)參Tublin鼠源一抗購(gòu)自碧云天公司，抗鼠，抗兔二抗均購(gòu)自Santa Cruz公司。 ECLplus化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)GE公司。結(jié)果見(jiàn)圖5，發(fā)現(xiàn)GAL4/UAS雙色熒光陽(yáng)性后代(E(+)D(+))的磷酸化 MAPK(P-MAPK)水平顯著升高，說(shuō)明Ras/MAH(信號(hào)通路得到激活。而該信號(hào)通路直接參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，證明過(guò)表達(dá)的Rasl放大了下游的Ras/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，就與營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)相關(guān)的Rasl/PII信號(hào)通路下游重要因子Akt及S6K，4EBP磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。其中磷酸化MAPK、AKT、S6K、4EBP的兔源一抗均購(gòu)自Cell Signaling 公司。結(jié)果見(jiàn)圖5，發(fā)現(xiàn)在GAL4/UAS雙色熒光陽(yáng)性后代(E (+) D (+))中，磷酸化Akt、4EBP 及S6K(P-Akt，P-4EBP，P-S6K)的顯著上升。說(shuō)明該通路也得到激活，蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)物的增加。實(shí)施例5、顯微鏡觀察不同基因型家蠶后絲腺的情況對(duì)不同基因型家蠶后絲腺的橫切面進(jìn)行比較。取出各基因型家蠶的后絲腺后用石蠟切片，蘇木精染色，在Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖6。a和b圖為100倍視野下野生型與雙陽(yáng)性家蠶后絲腺的橫切面比較，可看出雙陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因家蠶后絲腺的橫截面粗明顯于野生型家蠶，后絲腺為管腔狀分泌器官，中間為分泌腔，外周為后絲腺分泌細(xì)胞，其中后絲腺分泌細(xì)胞在雙陽(yáng)性家蠶中的徑寬是在野生型中的 1.5倍以上。c和d圖是在200倍視野下野生型與雙陽(yáng)性家蠶后絲腺的橫切面比較，由圖中可看出雙陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因家蠶后絲腺分泌細(xì)胞的細(xì)胞核(藍(lán)色箭頭所指)在區(qū)域分布和分枝數(shù)上均高于野生型，后絲腺分泌細(xì)胞在家蠶整個(gè)生長(zhǎng)周期中只存在染色體組的多次復(fù)制和細(xì)胞體積的增大，其DNA含量與分泌蛋白的能力密切相關(guān)，細(xì)胞核核區(qū)的體積增大，分枝數(shù)增多， 說(shuō)明其DNA含量增多，提示其細(xì)胞活力增強(qiáng)，代謝旺盛，分泌蛋白能力增強(qiáng)。實(shí)施例6、顯微鏡觀察不同基因型家蠶細(xì)胞器結(jié)構(gòu)(1)細(xì)胞核核區(qū)染色質(zhì)數(shù)量的比較取出各基因型家蠶的后絲腺，按照常規(guī)的電鏡切片標(biāo)準(zhǔn)步驟處理后，置于掃描電子顯微鏡下，觀察細(xì)胞核核區(qū)染色質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)圖7上圖。由圖中可看出雙陽(yáng)性家蠶后絲腺分泌細(xì)胞核區(qū)的區(qū)域(黑色箭頭所指)面積明顯大于野生型，核區(qū)內(nèi)染色質(zhì)(黑色小點(diǎn))多倍化程度也大大提高，說(shuō)明其DNA含量的增高， 這與其分泌絲心蛋白的水平為正相關(guān)的。(2)細(xì)胞核四周粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、囊泡和線粒體的數(shù)量和分布取出各基因型家蠶的后絲腺，按照常規(guī)的電鏡切片標(biāo)準(zhǔn)步驟處理后，置于掃描電子顯微鏡下，觀察細(xì)胞核四周粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、囊泡和線粒體的數(shù)量和分布。結(jié)果見(jiàn)圖7下圖。由圖中可看出，在核區(qū)(黑色箭頭所指)附近，雙陽(yáng)性家蠶后絲腺分泌細(xì)胞中線粒體(紅色箭頭所指)數(shù)量顯著多于野生型，說(shuō)明其細(xì)胞代謝相當(dāng)?shù)幕钴S。而在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(綠色箭頭所指)分布上，雙陽(yáng)性家蠶后絲腺分泌細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布密度上也多于野生型。 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白的主要細(xì)胞器，與細(xì)胞蛋白合成水平正相關(guān)。在囊泡大小和分布量上，雙陽(yáng)性家蠶后絲腺分泌細(xì)胞也顯著多于野生型。細(xì)胞中蛋白的運(yùn)輸主要由從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中脫離出的囊泡來(lái)完成，其大小和分布量與蛋白合成和分布量正相關(guān)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種制備蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶的方法，其特征在于，在家蠶后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因促家蠶后絲腺增大。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因選自GTP結(jié)合蛋白 Rasl基因，PI3K基因，Akt基因，InR基因，Yorkie基因。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善包括蠶繭體積增大，蠶繭重量增加，蠶絲增長(zhǎng)，蠶絲強(qiáng)度增強(qiáng)或蠶絲韌性增加。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一種構(gòu)建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5’一 3’ )家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件；將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，獲得家蠶轉(zhuǎn)基因后代1 ；(2)提供一種構(gòu)建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5’一3’)下游激活序列， 促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的基因；將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，獲得家蠶轉(zhuǎn)基因后代2 ；和(3)將家蠶轉(zhuǎn)基因后代1和家蠶轉(zhuǎn)基因后代2進(jìn)行雜交，得到后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的家蠶。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括提供一種構(gòu)建物，含有構(gòu)建物1和構(gòu)建物2 ；所述的構(gòu)建物1依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ )家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件；所述的構(gòu)建物2依次含有以下可操作性相連的元件(5’一 3’)下游激活序列，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的基因；將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，得到后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的家蠶。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括(51)提供一種構(gòu)建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5’一3’)家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件；(52)提供一種構(gòu)建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5’一 3’ )下游激活序列，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的基因；(53)將(Si)和(S》的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化家蠶，得到后絲腺表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因的家蠶。
8.如權(quán)利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，構(gòu)建物1中，還含有表達(dá)報(bào)告基因1 的表達(dá)盒1 ；構(gòu)建物2中，還含有表達(dá)報(bào)告基因2的表達(dá)盒2 ；且所述的報(bào)告基因1不同于報(bào)告基因2 ；選擇同時(shí)呈現(xiàn)報(bào)告基因1相應(yīng)表型和報(bào)告基因2相應(yīng)表型的家蠶，該家蠶是后絲腺變大、蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的報(bào)告基因1和報(bào)告基因2選自綠色熒光蛋白基因，增強(qiáng)的綠色熒光蛋白基因，紅色熒光蛋白基因。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)盒1依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ ) :3XP3啟動(dòng)子，報(bào)告基因1，終止子；或所述的表達(dá)盒2依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一3’ ) :3XP3啟動(dòng)子，報(bào)告基因2，終止子。
11.如權(quán)利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述的家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子選自絲心蛋白輕鏈啟動(dòng)子，絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子，P25啟動(dòng)子。
12.如權(quán)利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，構(gòu)建物1中，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件下游還包括一終止子；或構(gòu)建物2中，促細(xì)胞生長(zhǎng)基因下游還包括一終止子。
13.如權(quán)利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述的構(gòu)建物是以轉(zhuǎn)座子作為骨架的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家蠶后絲腺重增加；后絲腺中GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl表達(dá)水平增加；后絲腺中bHLH表達(dá)水平增加；后絲腺中Ras-GTP表達(dá)水平增加；或后絲腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量增加。
15.一種用于制備蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶的試劑盒，所述試劑盒中含有(1)一種構(gòu)建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5’ 一 3’ )家蠶后絲腺特異性表達(dá)啟動(dòng)子，半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件；(2)—種構(gòu)建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5’一 3’)下游激活序列，促細(xì)胞生長(zhǎng)基因。
16.一種促細(xì)胞生長(zhǎng)基因或其編碼的蛋白的用途，用于制備蠶絲產(chǎn)量高、蠶絲性能改善的家蠶。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于，所述的促細(xì)胞生長(zhǎng)基因選自GTP結(jié)合蛋白R(shí)asl基因，PI3K基因，Akt基因，hR基因，Yorkie基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高蠶絲產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因方法，可通過(guò)在家蠶后絲腺中特異性表達(dá)促細(xì)胞生長(zhǎng)基因，獲得后絲腺增大的家蠶，所述的家蠶高產(chǎn)蠶絲。本發(fā)明提供了促后絲腺生長(zhǎng)的基因，還提供了適合的在家蠶后絲腺中特異性高表達(dá)促后絲腺生長(zhǎng)的基因的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明為家蠶品種的產(chǎn)絲性狀改良提供新的手段和方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102187845SQ20101011807
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者夏慶友, 徐漢福, 李勝, 馬俐 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 西南大學(xué)