專利名稱：一種能降解雌激素的香茅醇假單胞菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種香茅醇假單胞菌(Pseudomonas citronellolis)菌株及其在降解 雌激素中的應用，特別是利用該香茅醇假單胞菌有效降解天然雌激素雌酮、17 β-雌二醇以 及合成雌激素17 α -乙炔基雌二醇。
背景技術：
雌酮(Estrone，El)、17β-雌二醇(17 β-Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3) 屬于天然雌激素，由人和動物的卵巢分泌出來，會隨著糞尿排放進入污水處理廠、土壤、農(nóng) 田等環(huán)境。人工合成雌激素17 α-乙炔雌二醇(17 α-Ethynylestradiol, ΕΕ2)，是低劑量 口服避孕藥、月經(jīng)不調(diào)治療藥和更年期治療藥的主要成分，亦會隨糞尿排泄到污水處理廠 中。圖1為上述雌激素的化學結構式。牲畜養(yǎng)殖業(yè)排放的雌激素亦會通過堆肥發(fā)酵等處理 處置后通過施肥進入農(nóng)田土壤中。常規(guī)活性污水處理系統(tǒng)不能有效去除原水中的雌激素， 雌酮與17 β -雌二醇雖能得到部分降解，17 α -乙炔雌二醇卻基本不被降解，導致受納水體 及土壤中 ng/L水平的雌激素被檢出(Ternes et al. , Sci. Total. Environ. Vol. 225,91-99, 1999)。統(tǒng)計來自瑞典、德國、加拿大、德國、意大利、英國、荷蘭等污水處理廠出水中雌激素 的檢測結果，雌酮、17 β -雌二醇與17 α -乙炔雌二醇的平均濃度范圍在Ι-llng/L。其中加 拿大污水廠出水中17 β -雌二醇和17 α -乙炔雌二醇的最大濃度分別為64ng/L和42ng/ L(Ternes etal.，Sci. Total Environ. 225，81-90，1999b)。雌激素隨著污水處理廠出水排 放進入河流中，文獻表明在河流中數(shù)ng/L的雌酮、17 β -雌二醇與17 α -乙炔雌二醇亦被 檢出(Jurgens M et al.，Environ. Toxicol. Chem，21 (3)，480-488，2002)。日本建設省從 1998年開始對全國109個水系的雌激素濃度進行了調(diào)查，雌酮、17 β -雌二醇與17 α -乙炔 雌二醇最高檢出濃度分別為1.3、5.4和0. 9ng/L(松井等，內(nèi)分泌干擾物的最前線，日本季 刊化學綜說，No. 50,2001)。近年來，雌激素作為環(huán)境中典型內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，其所導致的魚類等生物生殖機 能異?，F(xiàn)象等內(nèi)分泌干擾問題引起了學術界與社會的廣泛關注。80年代在英國泰晤士河接 納污水處理廠出水的下游河段中，發(fā)現(xiàn)雌雄同體的鯉魚；證明了 ng/L水平的雌酮、17 β-雌 二醇與17α-乙炔雌二醇可以導致雄性虹鱒魚的雌性化；是引起魚類雌性化的主要原 因物質(zhì)，是危及人類健康的水質(zhì)安全隱患(Desbrow et al.，Environ. Sci. Technol. 32， 1549-1558，1998)。魚類的vitro毒理實驗研究結果表明，雌激素效應大小順序為17 α -乙 炔雌二醇 >17 β-雌二醇 > 雌酮(Spengleret al, Environ. Toxicol. Chem. 20(10) 2133-2141,2001)。2002-2003年間，日本東京都環(huán)境科學研究所的研究亦表明，在東京灣 靠近污水處理廠的水域內(nèi)，發(fā)現(xiàn)多條鯔魚、青麟雄魚體中存在雌性魚才會發(fā)育的卵細胞，魚 類雌性化現(xiàn)象的主要原因物質(zhì)是長期排入東京灣中的污水處理廠出水中所含有的天然雌 激素。雌激素對水源水質(zhì)，進而對城鎮(zhèn)供水、公共衛(wèi)生以及生態(tài)系統(tǒng)質(zhì)量形成的潛在威脅不 容忽視。污水處理廠對阻止雌激素進入水體環(huán)境應該擔負重要作用，因此必須探索污水
3處理廠對雌激素的處理方法，在此之中，利用具有降解能力的微生物進行生物降解成為學 術界關注的重要方法之一。尋找能夠有效降解雌激素的微生物菌株成為研究熱點。近年 來，陸續(xù)報道表明發(fā)現(xiàn)了一些可以降解雌激素的微生物菌株。史江紅(本申請人之一) 等(Shi et al. , Water Sci. Technol. 45 (12) :175_179，2002)報道以雌激素作為唯一碳 源，從日本的牛糞堆肥中馴化篩選出17 α -乙炔雌二醇、以及17 β -雌二醇與雌酮的降解
菌株 HNS-1 株---真菌類鐮刀菌 Fusariumproliferatum。Yoshimoto 等(Yoshimoto et
al.，Water Sci. Technol. 47(9) =77-84,2004)報道從普通活性污泥中分離出馬紅球菌 Rhodococcus zopfii和Rhodococcus equi (革蘭氏陽性桿菌)可以降解雌酮、17 β -雌二 醇、雌三醇和17 α-乙炔雌二醇。史江紅(本申請人之一)等(Shi etal.，Water Science and Technology. Vol. 50，No. 8，153-159，2004)發(fā)現(xiàn)硝化污泥中的硝化細菌歐洲亞硝 化單胞菌Nitrosomonas europaea能降解上述4種雌激素雌酮、17 β -雌二醇、雌三醇和 17 α-乙炔雌二醇。任海燕等(Ren Haiyan et al.，Chemosphere 66340-346，2007)報道， 從北京某避孕藥廠污水處理站的活性污泥中分離出鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium sp, 可以降解17 α-乙炔雌二醇。目前我國為了控制水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象，北京上海等城市廣泛采用脫氮除磷污水處 理工藝。然而，在脫氮除磷工藝系統(tǒng)活性污泥中是否存在著雌激素的降解菌？關注脫氮除 磷的同時如何強化對雌激素，特別是素有難降解之稱的合成雌激素17 α -乙炔雌二醇的降 解效率成為了亟待解決的科技前沿問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對污水處理工藝中如何強化對雌激素的降解效率之問題，提供一種高效 去除雌激素(雌酮、17 β-雌二醇和/或17 α-乙炔雌二醇)的微生物菌種，該菌能高效降 解天然及合成雌激素，可以用于去除環(huán)境中雌激素的微生物降解技術。本發(fā)明所提供的高效降解菌SS-2來源于污水處理廠活性污泥中，經(jīng)過人工富集、 篩分及純化所得。采集脫氮除磷工藝系統(tǒng)活性污泥作為微生物源，分別以上述四種雌激素 作為唯一碳源進行富集培養(yǎng)，分離出可以有效降解雌酮、17β_雌二醇與17α-乙炔雌二 醇，但不降解雌三醇的一株微生物單菌，被命名為SS-2菌株。SS-2菌落呈圓形，為白色隆 起，邊緣規(guī)則，表面光滑。本發(fā)明將分離出的SS-2菌株送到中國微生物研究所中國普通微 生物菌種保藏中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)委托鑒定，基于對菌株16S rDNA序列分析，表明該菌株為香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis，桿菌，革蘭氏 陰性菌。SS-2菌株于2010年2月10日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏，登記入冊編號為CGMCC No. 3634。本發(fā)明提供的香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis SS-2菌株可以有效 去除天然雌激素。SS-2菌株能以雌激素作為唯一碳源生長，其培養(yǎng)基的無機成分為K2HPO4, 0. lg/L ； (NH4) 2ΗΡ04，0· lg/L ；MgSO4 · 7Η20，0· 02g/L ；FeCl3,0. Olg/L ；CaCl2 · 2Η20，0· lg/L ； NaCl，0. lg/L，蒸餾水，lOOOmL。培養(yǎng)液pH值為7. 0-7. 2，高壓滅菌鍋121°C滅菌20min。在 上述培養(yǎng)條件下，SS-2菌株在36小時內(nèi)能分別將初始濃度為2mg/L的雌酮和17 β -雌二 醇降解掉99%，在168小時內(nèi)能將初始濃度為4mg/L的17 α -乙炔雌二醇降解掉93. 6%. 降解反應符合一級動力學反應定律，雌酮、17 β -雌二醇和17 α -乙炔雌二醇降解數(shù)度常數(shù)分別為 0. 236^\0. 2211Γ1 與 0. 0131Γ1。依據(jù)本發(fā)明，由于香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis SS-2菌株具有有 效降解環(huán)境中的天然雌激素雌酮、17 β -雌二醇與合成雌激素17 α -乙炔雌二醇的特性，因 此SS-2菌株可以應用于含雌激素廢污水治理技術或土壤的修復技術中。本發(fā)明與現(xiàn)有已發(fā)現(xiàn)的雌激素降解菌相比，其降解雌酮、17 β -雌二醇與17α_乙 炔雌二醇的速率有了較大的提高。


圖1為雌酮、17 β-雌二醇、雌三醇和17 α-乙炔雌二醇的化學結構式；圖2為本發(fā)明的香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis SS-2菌株的平板 劃線圖；圖3為本發(fā)明的香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis SS-2菌株降解雌 酮(El)、17 β -雌二醇(Ε2)和17 α -乙炔雌二醇(ΕΕ2)過程中培養(yǎng)液在600nm下的吸光度 值隨時間變化圖；圖4為本發(fā)明的香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis SS-2菌株分別降 解雌酮(El)、17 β-雌二醇(Ε2)和雌三醇(Ε3)的濃度隨時間變化圖；圖5為本發(fā)明的香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis 17 α-乙炔雌二醇(ΕΕ2)的濃度隨時間變化圖；圖6為本發(fā)明的香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis 17 α-乙炔雌二醇(ΕΕ2)過程中樣品的的HPLC-UV色譜圖；圖7為本發(fā)明的香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis 17 β-雌二醇(Ε2)的過程中所生成的雌酮(El)濃度隨時間變化圖。
具體實施例方式一、本發(fā)明提供的Pseudomonas citronellolis SS-2菌株的分離篩選與保藏采集污水處理廠脫氮除磷工藝系統(tǒng)中的活性污泥作為微生物源，冷藏運回實驗 室。制備含有50mg/L雌激素為唯一碳源的無機培養(yǎng)基，按照2. 5%的活性污泥接種量接種 于IOOmL上述無機培養(yǎng)基的500mL三角瓶中。培養(yǎng)基中所含無機成分為K2HPO4,0. lg/L ； (NH4) 2ΗΡ04，0· lg/L ；MgSO4 ·7Η20，0· 02g/L ；FeCl3,0. Olg/L ；CaCl2 ·2Η20，0· lg/L ；NaCl，0. lg/ L0培養(yǎng)基使用2%。乙酸調(diào)節(jié)pH值為7. 0-7. 2，高壓滅菌鍋121°C滅菌20min，待溫度降低到 30°C左右后，在超凈臺下接種。污泥接種后在30°C，120rpm的恒溫搖床培養(yǎng)箱中進行富集 培養(yǎng)。如此反復培養(yǎng)7次后，在瓊脂(2g/100mL)固體培養(yǎng)基平板上反復劃線培養(yǎng)，直至分 離出單純菌株，再將菌株接種入上述液體培養(yǎng)基內(nèi)馴化，上述操作重復多次，得到純化的可 以降解雌酮、17 β -雌二醇和17 α -乙炔雌二醇的SS-2菌株，如圖2所示。該菌落呈圓形， 為白色隆起，邊緣規(guī)則，表面光滑。實驗過程中，純化后菌株在液體和固體培養(yǎng)基中繼續(xù)連續(xù)培養(yǎng)保存。菌種加甘油 于-80°C冷凍保藏。SS-2菌株于2010年2月10日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心保藏，登記入冊編號為CGMCC No. 3634。二、本發(fā)明提供的 Pseudomonas citronellolis SS-2 菌株的鑒定
SS-2菌株降解 SS-2菌株降解 SS-2菌株降解
5
本發(fā)明將分離出的SS-2菌株送到中國微生物研究所中國普通微生物菌種 保藏中心委托鑒定，SS-2菌株的16S rDNA序列表明該菌為燕麥食酸菌Pseudomonas citronellolis. SS-2菌株為無芽孢桿菌，革蘭氏陰性菌，嚴格好氧，化能異養(yǎng)。三、本發(fā)明提供的Pseudomonas citronellolis SS-2菌株對雌酮、17 β -雌二醇、 17 α-乙炔雌二醇的降解能力將含有50mg/L 的 17 α -乙炔雌二醇的 Pseudomonas citronellolis SS-2 菌株培 養(yǎng)基混合液，按照1 %的接種量，接種于分別以2mg/L雌酮、17 β -雌二醇、雌三醇或4mg/L 的17 α-乙炔雌二醇為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，于30°C，120rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5-7天，進行降解實驗，同時制備相應的無SS-2菌株的空白樣品進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期內(nèi)不 同時間采集2個平行樣品。采用紫外分光光度儀(UVHOOspectrophotometenUnic)測定 600nm下吸光度值以示微生物生長情況，如圖3所示。在采集樣品內(nèi)加入等體積乙腈混合均勻，采用0. 22 μ m有機系尼龍濾膜(13mm，天 津賀世科技發(fā)展有限公司)過濾后，采用高效液相色譜(HPLC，Waters 1525)測定雌激素濃 度。檢測器為 UV(Dual λ Absorbance Detector, Water 2487)，色譜柱為 Nova-Pak C18 柱 (4yn4^5、3.9_X150mmI.D.，Waters)，流動相體積比為乙腈水=1 1，檢測波長為 280nm，流速為lmL/min。表1列出降解過程中雌激素濃度隨時間變化的數(shù)據(jù)，雌激素的測 定結果如圖4、圖5所示。圖6為Pseudomonas citronellolis菌株降解17 α -乙炔雌二醇 過程中樣品的HPLC-UV色譜圖。在雌激素為唯一碳源的培養(yǎng)條件下，SS-2菌株在36小時 內(nèi)能分別將初始濃度為2mg/L的雌酮和17 β -雌二醇降解掉99%，在168小時內(nèi)能將初始 濃度為4mg/L的17 α -乙炔雌二醇降解掉93. 6%，雌三醇沒有明顯的降解現(xiàn)象。降解反應 符合一級動力學反應定律，一級動力學反應方程如下dc/dt = -kc利用該方程計算分解速率常數(shù)，得到雌酮、17 β -雌二醇和17 α -乙炔雌二醇降解 數(shù)度常數(shù)分別為0. 236^\0. 22Ih"1與0. Onh—1。表1SS-2菌株降解雌激素過程中雌激素濃度變化(mg/L)
釆樣時間Oh2h6h12h24h36h雌酮2.151.871.070.130.11n.d.采樣時間Oh4h8h12h24h36h48 h17β-雌二醇2.431.650.530.210.110.070.06采樣時間Oh6h24h48h72h120h168 h17α-乙炔雌二醇4.164.053.552.671.610.850.26η. d. :not detected (未檢出)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SS-2菌株可以高效降解雌酮、17 β -雌二醇與1 α -乙炔雌二醇，不降 解雌三醇。并且發(fā)現(xiàn)SS-2菌株降解17 β-雌二醇的速度最快。圖7表明，在17β-雌二醇 的降解過程中證實有雌酮的生成，該生成的雌酮亦被逐漸降解。本發(fā)明與現(xiàn)有公開文獻報道中雌激素降解菌株的降解速度進行比較，如表2所選出的SS-2菌株對雌酮、17 β-雌二醇的降解效果較佳。對 17 α -乙炔雌二醇的降解雖然略于Ren et al.文獻報道中的Sphingobacterium sp.菌屬， 但Sphingobacterium sp.尚未確定是哪一株菌株。表2文獻報道中雌激素菌株降解速度常數(shù)比較
文獻
種 菌
培養(yǎng) 起始 溫度 濃度
降解速度常數(shù)K (h"1)
17β-雌17α-乙炔
雌酮雌三醇
二醇雌二醇
Shi et al. (2004)
Fujii et al. (2002)
Shi et al. (2002) Ren et al. (2007)
Nitrosomas europea
30°C 0.4mg/L 0.0022 0.0020 0.0016 0.0019
革蘭氏陰性菌 25°C
Fusarium proliferatum
lg/L 0.3 g/L 0.17 g/L
30°C 25mg/L
Sphingobacterium 30°C 30 mg/L
0.0016 0.0024 0.0033
0.025
約 0.67
本發(fā)明
Pseudomonas citronellolis SS-2
30 °C lmg/L 0.236 0.221
0.0131. Fujii K et al. , Appl. Environ. Microbiol. 68 (4), 2057-2060, 2002.2. Shi J H et al. , Water Sci. Technol. 45 (12)，175-179，2002.3. Shi J H et al. , Water Res. 38 (9), 2322-2329, 2004.4. Ren Haiyan et al. , Chemosphere,66,340-346, 2007.SEQUENCE LISTING<110>北京師范大學<120> 一種能降解雌激素的香茅醇假單胞菌菌株及其應用<130><140>201010119348.4<141>2010-03-08<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>1429<212>DNA<213>Pseudimonas citronellolis<400>1
7
gcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaagggagcttgctcctggattcagcg60
gcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgttccgaaagg120
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權利要求
一種能降解雌激素的香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis SS 2菌株，其特征在于其保藏編號為CGMCC No.3634。
2.根據(jù)權利要求1所述的香茅醇假單胞菌Pseudomonascitronellolis SS-2菌株在 降解雌激素中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其中所述雌激素為雌酮、17β -雌二醇和/或17 α -乙 炔基雌二醇。
4.根據(jù)權利要求1所述的香茅醇假單胞菌Pseudomonascitronellolis SS-2菌株在 含雌激素廢污水治理技術或土壤的修復技術中的應用。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其中所述雌激素為雌酮、17β -雌二醇和/或17 α -乙炔基雌二醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香茅醇假單胞菌(Pseudomonas citronellolis)菌株及其在降解雌激素中的應用，其保藏編號為CGMCC No.3634，能以天然或合成雌激素作為唯一碳源生長，能夠高效降解雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)以及17α-乙炔基雌二醇(EE2)，可以用于去除雌激素的微生物降解技術。在雌激素為唯一碳源的培養(yǎng)條件下，SS-2菌株在36小時內(nèi)能分別將初始濃度為2mg/L的雌酮和17β-雌二醇降解掉99％，在168小時內(nèi)能將初始濃度為4mg/L的17α-乙炔雌二醇降解掉93.6％，雌三醇沒有明顯的降解現(xiàn)象。降解17β-雌二醇的過程中有雌酮的生成，其雌酮亦被逐漸降解。由于香茅醇假單胞菌Pseudomonas citronellolis SS-2菌株具有有效降解環(huán)境中的天然及合成雌激素的特性，因此SS-2菌株可以應用于含雌激素廢污水治理技術或土壤的修復技術中。
文檔編號C12R1/38GK101921717SQ201010119348
公開日2010年12月22日 申請日期2010年3月8日 優(yōu)先權日2010年3月8日
發(fā)明者史江紅, 宿凌燕, 曹金玲, 韓蕊 申請人:北京師范大學