專利名稱：人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法
人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法本發(fā)明涉及干細(xì)胞獲取方法及其干細(xì)胞庫構(gòu)建的方法，尤其涉及一種人脂肪成體 干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法。干細(xì)胞研究是近年來醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中最引人注目的熱點之一。干細(xì)胞是一類 具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。它包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。近幾年研究表明，成 體干細(xì)胞的分化能力遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)觀點所局限的范圍。因此目前干細(xì)胞的應(yīng)用已經(jīng)不再局限 于利用胚胎干細(xì)胞的全能性去研究組織細(xì)胞再生，也不再局限只用組織本身的起始干細(xì)胞 做細(xì)胞治療研究，而是趨于尋找更多的干細(xì)胞來源，通過研究他們的分化潛能，擴增能力， 分化后的細(xì)胞功能以及取材是否安全方便等問題，選擇最合適的干細(xì)胞源來進行組織細(xì)胞 再生修復(fù)。最近研究證明，在來源于成體脂肪組織中的有核細(xì)胞中，像骨髓一樣也含有一種 多能干細(xì)胞，國際上把這種細(xì)胞命名為脂肪來源干細(xì)胞(英文全稱Adipose Derived Stem Cells，簡稱ADSCs)。這種細(xì)胞群易分離，并像骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞那樣在特定條件下可 分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。許多研究表明，已有從人或 其他物種上分離出來ADSCs，并且ADSCs的表面抗原與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本類似。直接 比較人的ADSCs和間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原，約多于90%都是一致的。實驗表明，ADSCs像 骨髓源性的間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，經(jīng)體外擴增后，其具有較低的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能。這 就表明ADSCs不會在體內(nèi)引起T細(xì)胞(即胸腺依賴淋巴細(xì)胞)的細(xì)胞毒性反應(yīng)。移植同種 異基因ADSCs將不會引起強烈的免疫反應(yīng)和后期的排斥反應(yīng)，為ADSCs的同源異體移植提 供了有利條件。此外，ADSCs來源廣泛，可以通過脂肪抽吸術(shù)或脂肪切除術(shù)從任何人體內(nèi)獲 得，安全無痛苦，且在體外培養(yǎng)穩(wěn)定，擴增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成為目前研究的 新熱點，不論在再生醫(yī)學(xué)還是基因治療方面都具有重大的應(yīng)用潛力。為了便于人們有效儲存和使用干細(xì)胞資源，目前在世界范圍內(nèi)，已經(jīng)建立了多個 干細(xì)胞庫。所謂干細(xì)胞庫是在約為_196°C液氮中(深低溫)儲存干細(xì)胞及搜集存儲干細(xì) 胞資源相關(guān)資料的場所。按所儲存的干細(xì)胞來源和采集方式，干細(xì)胞庫主要可分為胚胎干 細(xì)胞庫、成體干細(xì)胞庫以及病理細(xì)胞庫，成體庫中包括臍血干細(xì)胞庫、骨髓和外周血干細(xì)胞 庫、以及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫。一個完善的干細(xì)胞庫應(yīng)具備隨時隨地將儲存的健康干細(xì)胞 提供臨床使用的能力。目前尚無脂肪成體干細(xì)胞庫，因此，構(gòu)建脂肪成體干細(xì)胞庫，將人健 康時的脂肪干細(xì)胞通過本發(fā)明建立的系統(tǒng)工程技術(shù)儲存建庫，是將現(xiàn)有資源充分利用的有 效方法，為存儲本人、家屬和他人在需要采用脂肪成體干細(xì)胞移植及相關(guān)技術(shù)治療的各種 疾病時，提供臨床適用型脂肪成體干細(xì)胞，其應(yīng)用前景十分廣闊。本發(fā)明的目的在于克服以上技術(shù)的不足，而提供一種人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法，其具有成本低、應(yīng)用前景廣闊，可為臨床和研究提供大量干細(xì)胞資源的特點。本發(fā)明的另一目的在于克服以上技術(shù)的不足，而提供一種人脂肪成體干細(xì)胞庫的 構(gòu)建方法，其具有成本低、應(yīng)用前景廣闊，可為臨床和研究提供大量干細(xì)胞資源的特點。本發(fā)明提供的一種人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法，包括(1)采集脂肪對供者進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，體 檢HIV、HBV、HCV，然后在無菌場所采集供者的脂肪；(2)獲取和分離人脂肪成體干細(xì)胞取20mL脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血 管和纖維部分，用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，將脂 肪組織絞碎為l_2mm3小塊，加入與所取脂肪組織等體積的0. 2%膠原酶磷酸緩沖液消化，在 37°C溫度條件下均勻震蕩消化50-70分鐘，再置于離心機中以1600-2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心4-10分鐘，去除表層脂肪；將底層細(xì)胞用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù) 吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，將濾液以900轉(zhuǎn)/分 鐘離心5分鐘，棄去上清液，獲得干細(xì)胞；(3)培養(yǎng)人脂肪成體干細(xì)胞將獲得的干細(xì)胞按1-2 X IOVcm2接種于培養(yǎng)瓶，加入 IOmL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 4-5天后更換新的含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3_4天 更換含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加 0. 25%胰酶-EDTA進行消化；將培養(yǎng)瓶放入37°C孵箱中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞， 用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來，每個培養(yǎng)瓶中加入含15%胎牛血 清的高糖DMEM的培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞清洗干凈，將清洗下來的細(xì)胞 懸液移入50mL離心管中，在900轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速條件下離心5分鐘，離心結(jié)束后，吸棄上清， 向離心管中加入30mL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液吹打干凈混勻細(xì)胞，獲得培養(yǎng) 后的人脂肪成體干細(xì)胞，分于三個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，即按1 3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞；(4)檢測、凍存人脂肪成體干細(xì)胞人脂肪成體干細(xì)胞的檢測步驟為用IOmL的 D-Hank' s平衡鹽液洗滌傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞兩次，吸棄洗液，每瓶中加入ImL 胰酶-EDTAj^A 37°C孵箱中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶 確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來；再在每個培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打；用 微量加樣槍吸出少許置于離心管中用做細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，吸取含有大約6X IO6個 細(xì)胞的細(xì)胞懸液分于另一離心管中用于檢測，其余用于凍存，將兩管細(xì)胞以900轉(zhuǎn)/分鐘 離心5分鐘，吸棄上清，用于檢測的細(xì)胞用培養(yǎng)液反復(fù)吹打細(xì)胞、混勻，送入藥品非臨床研 究質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)實驗室進行質(zhì)量檢測，包括無菌檢測、支原體檢測、病毒檢測、免疫表 型檢測、細(xì)胞計數(shù)及活力測定、生物學(xué)效力檢測、細(xì)胞分化能力檢測，以確定其是否達(dá)到合 格標(biāo)準(zhǔn)；凍存步驟為向獲得的人脂肪成體干細(xì)胞中加入胎牛血清，使符合1-2X106細(xì)胞 /0. 9mL胎牛血清，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上粘貼好條碼，同時在冷凍管上寫上 同一條碼號；將上述人脂肪成體干細(xì)胞懸液與凍存液按照1 1比例加入到凍存管內(nèi)混合， 先將細(xì)胞懸液分別加入到冷凍管內(nèi)后，再統(tǒng)一加入凍存液，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入 到-80°C冰箱內(nèi)；24小時后，按照編號放到相應(yīng)冷凍架上移入液氮中長期保存，細(xì)胞凍存時 有詳細(xì)的凍存記錄，符合冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)，儲存環(huán)境定期監(jiān)測，人脂肪成體干細(xì)胞的檢測和凍存是并行進行的，不等檢測結(jié)果出來，細(xì)胞就要被凍存了，待檢測結(jié)果出來之后，將檢測不 合格的細(xì)胞按照其編號將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄，做好記錄，放入垃圾袋，集 中放置于指定位置，由專門人員運走處理。優(yōu)選的，所述步驟(2)中用鑷子剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分。所述步 驟(2)中用無菌粉碎裝置將脂肪組織絞碎。所述步驟(2)中膠原酶磷酸緩沖液消化，在37°C 溫度條件下消化時間為60分鐘。所述步驟(2)中離心的最佳轉(zhuǎn)速為1800轉(zhuǎn)/分鐘，離心 5分鐘。所述液氮冷凍溫度為_196°C。本發(fā)明提供的一種人脂肪成體干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，包括(1)采集脂肪對供者進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，體 檢HIV、HBV、HCV，然后在無菌場所采集供者的脂肪；(2)獲取和分離人脂肪成體干細(xì)胞取20mL脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血 管和纖維部分，用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，將脂 肪組織絞碎為l_2mm3小塊，加入與所取脂肪組織等體積的0. 2%膠原酶磷酸緩沖液消化，在 37°C溫度條件下均勻震蕩消化50-70分鐘，再置于離心機中以1600-2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心4-10分鐘，去除表層脂肪；將底層細(xì)胞用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù) 吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，將濾液以900轉(zhuǎn)/分 鐘離心5分鐘，棄去上清液，獲得干細(xì)胞；(3)培養(yǎng)人脂肪成體干細(xì)胞將獲得的干細(xì)胞按1-2 X IOVcm2接種于培養(yǎng)瓶，加入 IOmL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 4-5天后更換新的含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3_4天 更換含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加 0. 25%胰酶-EDTA進行消化；將培養(yǎng)瓶放入37°C孵箱中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞， 用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來，每個培養(yǎng)瓶中加入含15%胎牛血 清的高糖DMEM的培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞清洗干凈，將清洗下來的細(xì)胞 懸液移入50mL離心管中，在900轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速條件下離心5分鐘，離心結(jié)束后，吸棄上清， 向離心管中加入30mL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液吹打干凈混勻細(xì)胞，獲得培養(yǎng) 后的人脂肪成體干細(xì)胞，分于三個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，即按1 3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞；(4)檢測、凍存人脂肪成體干細(xì)胞人脂肪成體干細(xì)胞的檢測步驟為用IOmL的 D-Hank' s平衡鹽液洗滌傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞兩次，吸棄洗液，每瓶中加入ImL 胰酶-EDTA，放入37°C孵箱中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶 確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來；再在每個培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打；用 微量加樣槍吸出少許置于離心管中用做細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，吸取含有大約6X IO6個 細(xì)胞的細(xì)胞懸液分于另一離心管中用于檢測，其余用于凍存。將兩管細(xì)胞以900轉(zhuǎn)/分鐘 離心5分鐘，吸棄上清，用于檢測的細(xì)胞用培養(yǎng)液反復(fù)吹打細(xì)胞、混勻，送入藥品非臨床研 究質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)實驗室進行質(zhì)量檢測，包括無菌檢測、支原體檢測、病毒檢測、免疫表 型檢測、細(xì)胞計數(shù)及活力測定、生物學(xué)效力檢測、細(xì)胞分化能力檢測，以確定其是否達(dá)到合 格標(biāo)準(zhǔn)；凍存步驟為向獲得的人脂肪成體干細(xì)胞中加入胎牛血清，使符合1-2X106細(xì)胞 /0. 9mL胎牛血清，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上粘貼好條碼，同時在冷凍管上寫上同一條碼號；將上述人脂肪成體干細(xì)胞懸液與凍存液按照1 1比例加入到凍存管內(nèi)混合， 先將細(xì)胞懸液分別加入到冷凍管內(nèi)后，再統(tǒng)一加入凍存液，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入 到-80°C冰箱內(nèi)；24小時后，按照編號放到相應(yīng)冷凍架上移入液氮中長期保存，細(xì)胞凍存時 有詳細(xì)的凍存記錄，符合冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)，儲存環(huán)境定期監(jiān)測，人脂肪成體干細(xì)胞的檢測和凍 存是并行進行的，不等檢測結(jié)果出來，細(xì)胞就要被凍存了，待檢測結(jié)果出來之后，將檢測不 合格的細(xì)胞按照其編號將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄，做好記錄，放入垃圾袋，集 中放置于指定位置，由專門人員運走處理；(5)建庫將獲得的每一份人脂肪成體干細(xì)胞細(xì)胞按供者姓名、身份證號碼及存 儲日期分別保存，建立每一份干細(xì)胞的詳細(xì)檔案的電腦數(shù)據(jù)庫，建立人脂肪成體干細(xì)胞庫。優(yōu)選的，所述步驟(2)中用鑷子剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分。所述步 驟(2)中用無菌粉碎裝置將脂肪組織絞碎。所述步驟(2)中膠原酶磷酸緩沖液消化，在37°C 溫度條件下消化時間為60分鐘；所述離心的最佳轉(zhuǎn)速為1800轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；所述 液氮冷凍溫度為_196°C。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點利用本發(fā)明獲取脂肪成體干細(xì)胞的方法，可以更加有效的分離、純化、擴增脂肪成 體干細(xì)胞，解決此類資源得不到充分利用的現(xiàn)狀，并且建立長期存儲脂肪干細(xì)胞的干細(xì)胞 庫，該庫可向臨床及科研應(yīng)用提供大量干細(xì)胞資源。根據(jù)獲取的脂肪成體干細(xì)胞構(gòu)建干細(xì)胞庫，其來源豐富，細(xì)胞獲取簡便，可得到大 量富有活性的脂肪成體干細(xì)胞，并能夠長時間保存而不失其活性，富有應(yīng)用前景。該庫為健 康成人儲存脂肪干細(xì)胞，為存儲者在罹患需要采用干細(xì)胞移植及相關(guān)技術(shù)治療的各種疾病 時，提供臨床適用型脂肪干細(xì)胞，并且可以在取得許可后，將所儲存的干細(xì)胞用于其他各種 干細(xì)胞制劑的生產(chǎn)。
圖1為本發(fā)明實施例的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法 的流程圖，在該圖中，人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法集合在一 起；圖2為本發(fā)明實施例的人脂肪成體干細(xì)胞的生長曲線示意圖；圖3為本發(fā)明實施例的人脂肪成體干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化實驗結(jié)果示意圖；圖4為本發(fā)明實施例的人脂肪成體干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化實驗結(jié)果示意圖；圖5為本發(fā)明實施例的人脂肪成體干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制實驗結(jié)果示意圖；圖6為本發(fā)明實施例的人脂肪成體干細(xì)胞的形態(tài)示意圖。為更進一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖 及較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方 法，其具體實施方式
、特征及其功效，說明如后。本發(fā)明實施例提供的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，如 圖1所示，在圖1中，人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法集合在一個圖
8中，以下進行統(tǒng)一說明；包括(1)采集脂肪對供者進行ABO/Rh血型檢測、HLA(英文全稱=HumanLeukocyte Antigen，中文全稱人類白細(xì)胞抗原)分型的檢測、微生物免疫檢測，體檢HIV(英文全 稱Human Immunodeficiency Virus，中文全稱人類免疫缺陷病毒)、HBV(英文全稱 Hepatitis B virus的簡稱，中文全稱乙型肝炎病毒)、HCV(英文全稱!fepatitis C virus，中文全稱丙型肝炎病毒)；然后在無菌場所采集供者的脂肪。在脂肪采集之前，供者填寫知情同意書、個人基本資料，然后對供者進行鑒定，確 認(rèn)供者身體健康后再進行采集其脂肪，采集過程應(yīng)嚴(yán)格防止病原微生物的污染，要求在無 菌的場所進行，然后將采集到的脂肪運輸?shù)街付ǖ攸c，運輸環(huán)境溫度應(yīng)在4-8°C范圍內(nèi)；脂 肪接收時應(yīng)填寫接收單，標(biāo)記脂肪瓶；脂肪接收后，對所用脂肪進行無菌檢測，確保脂肪的 安全性。(2)獲取和分離人脂肪成體干細(xì)胞取20mL脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血 管和纖維部分，本實施例是用鑷子進行操作，用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反 復(fù)沖洗，去除殘留的血液，將脂肪組織絞碎為l_2mm3小塊，本實施例是用無菌的粉碎裝置進 行絞碎，加入與所取脂肪組脂等體積即20mL的0. 2%膠原酶磷酸緩沖液消化，在37°C溫度 條件下均勻震蕩消化50-70分鐘，本實施例中，消化60分鐘，再置于離心機中以1600-2000 轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4-10分鐘，本實施例中，為置于轉(zhuǎn)速為1800轉(zhuǎn)/分鐘的離心機中，離 心5分鐘，去除表層脂肪；將底層細(xì)胞用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù)吹打， 清洗干凈；D-Hank，s平衡鹽液的配制方法為將含NaCl 8. 00g, KCl 0. 40g、Na2HPO4 · H2O 0. 06g、KH2PO4 0. 06g、NaHCO3 0. 35g和酚紅0. 02g，加水溶解定量至IOOOmL ；清洗下來的液 體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，將濾液以900轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上 清液，獲得干細(xì)胞。(3)培養(yǎng)人脂肪成體干細(xì)胞將獲得的干細(xì)胞按1-2 X IOVcm2接種于塑料培養(yǎng)瓶， 加入IOmL含15%胎牛血清的高糖DMEM(英文全稱=Dulbecco'sModified Eagle Media，中 文全稱DulbeCC0修改過的Eagle培養(yǎng)基，是由美國的INVITR0GEN公司生產(chǎn))的培養(yǎng)液， 置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-5天后更換新的含15% (體積比)胎牛血清 的高糖DMEM的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3-4天更換含15% (體積比)胎牛血清的 高糖DMEM的培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0. 25%胰酶-EDTA進行 消化；0. 25%胰酶-EDTA的制備過程為胰蛋白酶0. 5g溶于IOOmL的D-Hank’ s中使之充 分溶解后加入含0. 02% EDTA的D-Hank’ s溶液IOOmL混勻，用孔徑為0. 22 μ m的一次性濾 器過濾除菌，在-20°C儲存；將培養(yǎng)瓶放入37°C孵箱中5分鐘；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞， 用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來，每個培養(yǎng)瓶中加入含15% (體積 比)胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞清洗干凈，將清洗下 來的細(xì)胞懸液移入50mL離心管中，在900轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速條件下離心5分鐘，離心結(jié)束后， 吸棄上清，向離心管中加入30mL含15% (體積比)胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液吹打干 凈混勻細(xì)胞，獲得培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞，分于三個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于37°C、C02含量 為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即按1 3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞。細(xì)胞生長曲線的測定是將貼壁細(xì)胞用0. 25%胰酶-EDTA消化后，按1 X IO4細(xì)胞/ 孔接種在24孔板內(nèi)，每隔24小時消化3個孔，收集細(xì)胞，并用0. 4%的胎盼蘭計數(shù)活細(xì)胞，繪制生長曲線，如圖2所示，圖中橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞個數(shù)，從圖2中可見，本 發(fā)明獲得的人脂肪成體干細(xì)胞增殖較快，在對數(shù)生長期，細(xì)胞倍增時間均約為20h左右。(4)檢測、凍存人脂肪成體干細(xì)胞用IOmL的D-Hank’ s平衡鹽液洗滌傳代培養(yǎng) 后的人脂肪成體干細(xì)胞兩次，吸棄洗液，每個培養(yǎng)瓶中加入ImL胰酶-EDTA，放入37°C孵箱 中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶確保細(xì)胞及組織塊完全消 化下來；再在每個培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打；用微量加樣槍吸出少許置于 離心管中用做細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，吸取含有大約6 X IO6個細(xì)胞的細(xì)胞懸液分于另一 離心管中用于檢測，其余用于凍存。將兩管細(xì)胞以900轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸棄上清，用 于檢測的細(xì)胞用培養(yǎng)液反復(fù)吹打細(xì)胞、混勻，送入藥品非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)實驗 室進行質(zhì)量檢測，包括無菌檢測、支原體檢測、病毒檢測、免疫表型檢測、細(xì)胞計數(shù)及活力測 定、生物學(xué)效力檢測、細(xì)胞分化能力檢測，以確定其是否達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)；其中，病毒檢測是通 過實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒，判定標(biāo) 準(zhǔn)為為各項指標(biāo)均為陰性，視為合格細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)及活力測定是指用臺盼蘭染色進行細(xì)胞計數(shù)，判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞活率大于 等于90%，視為合格細(xì)胞。免疫表型檢測是用直接免疫熒光法檢測，所用抗體為小鼠抗人的 單克隆抗體 CD29、CD44、CD73、CD90、CD14、CD31、CD45、CD49d、HLA-DR。細(xì)胞用 PBS (Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩沖液)洗后加入抗體，在4°C溫度下孵育30分鐘，再用PBS洗 細(xì)胞兩次，用500 μ L的PBS吹打、混勻細(xì)胞，之后用流式細(xì)胞儀檢測。本發(fā)明人脂肪成體干 細(xì)胞免疫表型流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如表1所示，其中“++”表示大于95% ；“_”表示小于 2 %，檢測結(jié)果表明，脂肪成體干細(xì)胞中的⑶14、⑶31、⑶45、HLA-DR呈陰性，小于2 % ；⑶44、 ⑶73、⑶90、⑶105和⑶49d呈陽性，大于95%，該脂肪成體干細(xì)胞視為合格細(xì)胞。表 1
標(biāo)記表達(dá)量
CD14-
CD31-
CD49d++
CD73++
CD90++
CD45-
CD105++
CD44++
HLA-DR-細(xì)胞分化能力檢測是指在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，脂肪干細(xì)胞向脂肪、成骨分化能力的 檢測，判定標(biāo)準(zhǔn)為向脂肪和成骨細(xì)胞分化成功的視為合格細(xì)胞。細(xì)胞分化能力檢測的具體 過程為將重懸于D-MEM/F-12 (Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基與營養(yǎng)混合物F-12以1 1 配比的培養(yǎng)基，是由美國的INVITR0GEN公司生產(chǎn))完全培養(yǎng)液的人脂肪成體干細(xì)胞以 1 X IO5/孔接種于6孔板，每孔體系為2mL ；置于CO2含量為5%、飽和濕度、37°C的培養(yǎng)箱培 養(yǎng)2天；當(dāng)細(xì)胞80%融合，小心吸棄培養(yǎng)基，然后每孔添加ImL預(yù)熱的脂肪完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基(如美國的 INVITR0GEN 公司生產(chǎn)的 STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit 脂肪分 化試劑盒)。將此培養(yǎng)基應(yīng)用日記錄為脂肪分化第一天；按表2所示的分化時刻表更換新 鮮脂肪誘導(dǎo)或維持培養(yǎng)基，并隨時鏡檢細(xì)胞狀態(tài)。表 權(quán)利要求
1. 一種人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，包括(1)采集脂肪對供者進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，體檢 HIV、HBV、HCV，然后在無菌場所采集供者的脂肪；(2)獲取和分離人脂肪成體干細(xì)胞取20mL脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和 纖維部分，用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，將脂肪 組織絞碎為l_2mm3小塊，加入與所取脂肪組織等體積的0. 2%膠原酶磷酸緩沖液消化，在 37°C溫度條件下均勻震蕩消化50-70分鐘，再置于離心機中以1600-2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心4-10分鐘，去除表層脂肪；將底層細(xì)胞用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù) 吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，將濾液以900轉(zhuǎn)/分 鐘離心5分鐘，棄去上清液，獲得干細(xì)胞；(3)培養(yǎng)人脂肪成體干細(xì)胞將獲得的干細(xì)胞按1-2X IOVcm2接種于培養(yǎng)瓶，加入IOmL 含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4_5天 后更換新的含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3-4天更換含 15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0. 25% 胰酶-EDTA進行消化；將培養(yǎng)瓶放入37°C孵箱中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，用手掌 輕輕拍打培養(yǎng)瓶確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來，每個培養(yǎng)瓶中加入含15%胎牛血清的高 糖DMEM的培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞清洗干凈，將清洗下來的細(xì)胞懸液移 入50mL離心管中，在900轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速條件下離心5分鐘，離心結(jié)束后，吸棄上清，向離 心管中加入30mL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液吹打干凈混勻細(xì)胞，獲得培養(yǎng)后的 人脂肪成體干細(xì)胞，分于三個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即 按1 3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞；(4)檢測、凍存人脂肪成體干細(xì)胞人脂肪成體干細(xì)胞的檢測步驟為用IOmL的 D-Hank’ s平衡鹽液洗滌傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞兩次，吸棄洗液，每瓶中加入ImL 胰酶-EDTA，放入37°C孵箱中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶 確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來；再在每個培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打；用 微量加樣槍吸出少許置于離心管中用做細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，吸取含有大約6X IO6個 細(xì)胞的細(xì)胞懸液分于另一離心管中用于檢測，其余用于凍存，將兩管細(xì)胞以900轉(zhuǎn)/分鐘 離心5分鐘，吸棄上清，用于檢測的細(xì)胞用培養(yǎng)液反復(fù)吹打細(xì)胞、混勻，送入藥品非臨床研 究質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)實驗室進行質(zhì)量檢測，包括無菌檢測、支原體檢測、病毒檢測、免疫表 型檢測、細(xì)胞計數(shù)及活力測定、生物學(xué)效力檢測、細(xì)胞分化能力檢測，以確定其是否達(dá)到合 格標(biāo)準(zhǔn)；凍存步驟為向獲得的人脂肪成體干細(xì)胞中加入胎牛血清，使符合1-2X IO6細(xì)胞 /0. 9mL胎牛血清，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上粘貼好條碼，同時在冷凍管上寫上 同一條碼號；將上述人脂肪成體干細(xì)胞懸液與凍存液按照1 1比例加入到凍存管內(nèi)混合， 先將細(xì)胞懸液分別加入到冷凍管內(nèi)后，再統(tǒng)一加入凍存液，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入 到-80°C冰箱內(nèi)；24小時后，按照編號放到相應(yīng)冷凍架上移入液氮中長期保存，細(xì)胞凍存時 有詳細(xì)的凍存記錄，符合冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)，儲存環(huán)境定期監(jiān)測，人脂肪成體干細(xì)胞的檢測和凍存是并行進行的，不等檢測結(jié)果出來，細(xì)胞就要被凍存了，待檢測結(jié)果出來之后，將檢測不 合格的細(xì)胞按照其編號將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄，做好記錄，放入垃圾袋，集 中放置于指定位置，由專門人員運走處理。
2.如權(quán)利要求1所述的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述步驟(2)中用 鑷子剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分。
3.如權(quán)利要求1所述的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述步驟(2)中用 無菌粉碎裝置將脂肪組織絞碎。
4.如權(quán)利要求1所述的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述步驟(2)中膠 原酶磷酸緩沖液消化，在37°C溫度條件下消化時間為60分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述步驟(2)中離 心的最佳轉(zhuǎn)速為1800轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述液氮冷凍溫 度為-196°C。
7.一種人脂肪成體干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于，包括(1)采集脂肪對供者進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，體檢 HIV、HBV、HCV，然后在無菌場所采集供者的脂肪；(2)獲取和分離人脂肪成體干細(xì)胞取20mL脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和 纖維部分，用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，將脂肪 組織絞碎為l_2mm3小塊，加入與所取脂肪組織等體積的0. 2%膠原酶磷酸緩沖液消化，在 37°C溫度條件下均勻震蕩消化50-70分鐘，再置于離心機中以1600-2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速 離心4-10分鐘，去除表層脂肪；將底層細(xì)胞用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復(fù) 吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，去除未消化組織，將濾液以900轉(zhuǎn)/分 鐘離心5分鐘，棄去上清液，獲得干細(xì)胞；(3)培養(yǎng)人脂肪成體干細(xì)胞將獲得的干細(xì)胞按1-2X IOVcm2接種于培養(yǎng)瓶，加入IOmL 含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4_5天 后更換新的含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3-4天更換含 15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合，在培養(yǎng)瓶中加0. 25% 胰酶-EDTA進行消化；將培養(yǎng)瓶放入37°C孵箱中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，用手掌 輕輕拍打培養(yǎng)瓶確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來，每個培養(yǎng)瓶中加入含15%胎牛血清的高 糖DMEM的培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞清洗干凈，將清洗下來的細(xì)胞懸液移 入50mL離心管中，在900轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速條件下離心5分鐘，離心結(jié)束后，吸棄上清，向離 心管中加入30mL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液吹打干凈混勻細(xì)胞，獲得培養(yǎng)后的 人脂肪成體干細(xì)胞，分于三個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于37°C、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即 按1 3傳代，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞；(4)檢測、凍存人脂肪成體干細(xì)胞人脂肪成體干細(xì)胞的檢測步驟為用IOmL的 D-Hank’ s平衡鹽液洗滌傳代培養(yǎng)后的人脂肪成體干細(xì)胞兩次，吸棄洗液，每瓶中加入ImL 胰酶-EDTA，放入37°C孵箱中5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶 確保細(xì)胞及組織塊完全消化下來；再在每個培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)液10mL，反復(fù)吹打；用 微量加樣槍吸出少許置于離心管中用做細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，吸取含有大約6X IO6個 細(xì)胞的細(xì)胞懸液分于另一離心管中用于檢測，其余用于凍存。將兩管細(xì)胞以900轉(zhuǎn)/分鐘 離心5分鐘，吸棄上清，用于檢測的細(xì)胞用培養(yǎng)液反復(fù)吹打細(xì)胞、混勻，送入藥品非臨床研 究質(zhì)量管理規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)實驗室進行質(zhì)量檢測，包括無菌檢測、支原體檢測、病毒檢測、免疫表型檢測、細(xì)胞計數(shù)及活力測定、生物學(xué)效力檢測、細(xì)胞分化能力檢測，以確定其是否達(dá)到合 格標(biāo)準(zhǔn)；凍存步驟為向獲得的人脂肪成體干細(xì)胞中加入胎牛血清，使符合1-2X IO6細(xì)胞 /0. 9mL胎牛血清，充分混勻，待用；在冷凍管和冷凍盒上粘貼好條碼，同時在冷凍管上寫上 同一條碼號；將上述人脂肪成體干細(xì)胞懸液與凍存液按照1 1比例加入到凍存管內(nèi)混合， 先將細(xì)胞懸液分別加入到冷凍管內(nèi)后，再統(tǒng)一加入凍存液，封蓋，震蕩，充分混勻，迅速移入 到-80°C冰箱內(nèi)；24小時后，按照編號放到相應(yīng)冷凍架上移入液氮中長期保存，細(xì)胞凍存時 有詳細(xì)的凍存記錄，符合冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)，儲存環(huán)境定期監(jiān)測，人脂肪成體干細(xì)胞的檢測和凍 存是并行進行的，不等檢測結(jié)果出來，細(xì)胞就要被凍存了，待檢測結(jié)果出來之后，將檢測不 合格的細(xì)胞按照其編號將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄，做好記錄，放入垃圾袋，集 中放置于指定位置，由專門人員運走處理；(5)建庫將獲得的每一份人脂肪成體干細(xì)胞細(xì)胞按供者姓名、身份證號碼及存儲日 期分別保存，建立每一份干細(xì)胞的詳細(xì)檔案的電腦數(shù)據(jù)庫，建立人脂肪成體干細(xì)胞庫。
8.如權(quán)利要求7所述的人脂肪成體干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中 用鑷子剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分。
9.如權(quán)利要求7所述的人脂肪成體干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中 用無菌粉碎裝置將脂肪組織絞碎。
10.如權(quán)利要求7所述的人脂肪成體干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2) 中膠原酶磷酸緩沖液消化，在37°C溫度條件下消化時間為60分鐘；所述離心的最佳轉(zhuǎn)速為 1800轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；所述液氮冷凍溫度為_196°C。
全文摘要
本發(fā)明公開的人脂肪成體干細(xì)胞的獲取方法及該干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，包括采集脂肪；獲取和分離人脂肪成體干細(xì)胞；培養(yǎng)人脂肪成體干細(xì)胞；檢測、凍存人脂肪成體干細(xì)胞；建庫。利用本發(fā)明的獲取人脂肪成體干細(xì)胞的方法，可有效的分離、純化、擴增脂肪成體干細(xì)胞，解決此類資源得不到充分利用的現(xiàn)狀，并建立長期存儲人脂肪干細(xì)胞的干細(xì)胞庫以便向臨床及科研應(yīng)用提供大量干細(xì)胞資源。根據(jù)獲取的人脂肪成體干細(xì)胞構(gòu)建干細(xì)胞庫，其來源豐富，細(xì)胞獲取簡便，該庫為健康成人儲存脂肪干細(xì)胞，為其本人在罹患需要采用干細(xì)胞移植時，提供臨床適用型脂肪干細(xì)胞，并且可以在取得許可后，將所儲存的干細(xì)胞用于干細(xì)胞制劑的生產(chǎn)。
文檔編號C12N5/071GK102002475SQ20101012094
公開日2011年4月6日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者劉廣洋, 劉擁軍, 徐萌 申請人:和澤生物科技有限公司