專利名稱：一種檢測(cè)膜聯(lián)蛋白a3表達(dá)水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及化療藥物耐藥性領(lǐng)域，具體地，涉及如下方面一種檢測(cè)鉬類化 療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清中膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3)表達(dá)水平的方法、一種調(diào)節(jié) 腫瘤細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的方法、一種評(píng)估腫瘤患者對(duì)鉬類化療藥物耐藥性的方法、一 種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉬的方法、一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中 DNA與鉬結(jié)合的方法、以及一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù)量的方法。
背景技術(shù)：
卵巢癌是婦科腫瘤首位致死性疾病，晚期患者的5年生存率始終徘徊在 15%-20%，腫瘤細(xì)胞對(duì)于鉬類化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成這一狀況的主要原因之一。鉬類 化療藥物包括順鉬、卡鉬、草酸鉬、奈達(dá)鉬、樂鉬等，是目前最常用的治療卵巢癌的一線化療 藥物，也是治療其它實(shí)體腫瘤包括乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管 癌等的常用藥物。鉬類化療藥物與DNA結(jié)合形成交叉鍵，從而破壞DNA的功能不能再?gòu)?fù)制，高濃度時(shí) 也能抑制RNA及蛋白質(zhì)的合成。但是，鉬類化療藥物在治療上述實(shí)體腫瘤時(shí)，均出現(xiàn)了耐藥 現(xiàn)象，即治療初期對(duì)于腫瘤控制良好而治療后期便出現(xiàn)復(fù)發(fā)或治療初期就無反應(yīng)。對(duì)于卵巢癌對(duì)鉬類化療藥物的耐藥，臨床上已有明確的認(rèn)識(shí)和定義。同時(shí)，對(duì)于順 鉬耐藥機(jī)制的研究也取得了一定的成果，如MDR-1，LRP-I, MRP-I, GST-pi等已成為眾所周 知的耐藥相關(guān)基因。但眾多的研究結(jié)果表明，多種耐藥相關(guān)基因在卵巢癌中的表達(dá)并不能良好地預(yù) 測(cè)腫瘤地耐藥和預(yù)后，mRNA的豐度與其相應(yīng)的蛋白水平具有不一致性可能是主要原因之 一。DNA是遺傳信息的承載者，蛋白質(zhì)才是功能的執(zhí)行者。本發(fā)明人通過比較蛋白質(zhì)組學(xué) 技術(shù)，對(duì)鉬類化療敏感細(xì)胞和其對(duì)應(yīng)的鉬類化療耐藥細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了比較，并 發(fā)現(xiàn)了 5種鉬類化療耐藥相關(guān)蛋白，它們分別是膜聯(lián)蛋白A3 (Armexin A3)、IDHc, cofilin 1、GST01-1、destrin，并通過RT-PCR和Western blot技術(shù)對(duì)鉬類化療耐藥和敏感細(xì)胞在 RNA 和蛋白質(zhì)水平分別進(jìn)行了驗(yàn)證(Yan XD, Pan LY, et al. J Proteome Res. 2007,6(2) 772-780)。根據(jù)5種蛋白的差異程度，選擇差異最為明顯的膜聯(lián)蛋白A3進(jìn)行相關(guān)的鉬類耐 藥機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞。膜聯(lián)蛋白A3是armexin超家族中的一員，具有抑制磷脂酶A2和抗凝的功能，它 還可以切斷 inositol 1,2-cyclic phosphate 形成 inositol 1-phosphate，在控制細(xì)胞增 殖方面發(fā)揮作用(Ross TS, etal. J Biol Chem. 1991，266 (14) :9086_9092.)。膜聯(lián)蛋白 A3 在一定Ca2+濃度下能夠結(jié)合到囊泡的磷脂酰絲氨酸上，介導(dǎo)吞噬體與溶酶體的融合和顆粒 消失等膜與膜之間的作用。做為鈣連接蛋白，膜聯(lián)蛋白A3具有一系列的胞內(nèi)外功能，包括 膜轉(zhuǎn)運(yùn)、淋巴細(xì)胞遷移、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、鈣流出和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。高豐量的膜聯(lián)蛋白A3產(chǎn)生鈣依賴的 膨脹小泡結(jié)合陰性帶電膜磷脂是膜聯(lián)蛋白A3的重要功能之一(Gerke V,MossSE. Physiol. Rev. 2002,82 331-371)。
—系列的實(shí)驗(yàn)表明，膜聯(lián)蛋白A3是卵巢癌鉬類化療藥物化療耐藥的機(jī)制之一。本 發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)手段降低卵巢癌細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)，卵巢癌對(duì)鉬類化療藥物敏感 性增加；反之，如果提高卵巢癌細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)，卵巢癌對(duì)鉬類化療藥物敏感性 降低。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在人卵巢癌組織和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)都得到了有效的驗(yàn)證(YanXD，Pan LY, et al.J Proteome Res.2007,6(2) :772_780 ；XuedongYan,Jie Yin,Huiyu Yao，Ning Mao, Yili Yang, Lingya Pan. CancerRes，2010，70(4) :0F1_9.)。此外，在大約三分之二的結(jié)腸癌患者的癌組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)高水平的膜聯(lián)蛋白A3集中 在膜結(jié)合區(qū)域(Madoz-Gurpide J, Lopez-Serra P, etal. Mol Cell Proteomics. 2006,5 1471-1483)。最近，在不同期別的前列腺癌患者的尿液中，用Western blot方法可以檢測(cè) 出變化含量的膜聯(lián)蛋白A3，并與現(xiàn)在臨床所用的特異性標(biāo)記物前列腺特異性抗原做比較， 發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3在早期提示前列腺癌更具優(yōu)勢(shì)。綜上所述，膜聯(lián)蛋白A3具有成為人類腫瘤標(biāo)志物的希望?；谀ぢ?lián)蛋白A3與鉬 類化療藥物耐藥的相關(guān)性，本發(fā)明意在通過人體液中膜聯(lián)蛋白A3的水平來臨床評(píng)估腫瘤 鉬類化療藥物敏感性，這在腫瘤化療耐藥領(lǐng)域尚屬首次。鑒于目前臨床上缺乏能夠提早預(yù)示腫瘤鉬類化療藥物的蛋白標(biāo)志物，為充分發(fā)揮 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明人在發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3這一鉬類化療藥物耐藥相關(guān)蛋白基礎(chǔ)之上，進(jìn) 一步通過實(shí)驗(yàn)肯定了其鉬類化療藥物耐藥特異性標(biāo)志物的地位，并探討了其導(dǎo)致鉬類化療 藥物耐藥的分子機(jī)制。同時(shí)在發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞(例如卵巢癌細(xì)胞)分泌膜聯(lián)蛋白A3的現(xiàn)象 基礎(chǔ)之上進(jìn)一步探尋其外泌途徑，并通過構(gòu)建特異性檢測(cè)人類膜聯(lián)蛋白A3蛋白的酶聯(lián)免 疫吸附實(shí)驗(yàn)方案，成功地在卵巢癌患者血清中檢測(cè)出膜聯(lián)蛋白A3的存在，并在此基礎(chǔ)上， 評(píng)估了卵巢癌鉬類化療藥物耐藥患者血清中膜聯(lián)蛋白A3水平和卵巢癌鉬類化療藥物敏感 患者血清中膜聯(lián)蛋白A3的水平差異。通過大量的臨床樣本證明，血清中高水平的膜聯(lián)蛋白 A3能夠準(zhǔn)確地預(yù)示鉬類化療藥物耐藥的發(fā)生。及早地發(fā)現(xiàn)鉬類化療藥物耐藥，能夠及時(shí)地 改變腫瘤治療方案，提高5年生存率，改善預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種檢測(cè)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平的方法，所述方法使用 鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清作為被檢測(cè)的樣品。其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物為順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，并且更優(yōu)選為DMEM ；優(yōu)選地，所述檢測(cè)優(yōu)選為免疫學(xué) 檢測(cè)，并且更優(yōu)選為Westernblot或ELISA檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)使用Western blot進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所述方法包括如 下步驟1)收集鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清和鉬類化療藥物敏感的同類型腫 瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清并分別進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)均為75 100倍，得到兩個(gè)濃縮液體；2)檢測(cè)所述兩個(gè)濃縮液體中armenxin A3表達(dá)水平；3)將所述兩個(gè)濃縮液體中armenxin A3表達(dá)水平相比較，對(duì)鉬類化療藥物耐藥腫 瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平進(jìn)行半定量。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中armenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物 是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過提高腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)而提高腫 瘤細(xì)胞對(duì)鉬類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3基因而提高 細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)正義膜聯(lián)蛋白A3基因的質(zhì)粒來提高所 述細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過減少和/或抑制腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá) 而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)鉬類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3的 反義核酸和/或特異于膜聯(lián)蛋白A3的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)， 更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)反義膜聯(lián)蛋白A3的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體來降低細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋 白A3的含量。本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供一種評(píng)估腫瘤患者對(duì)鉬類化療藥物耐藥性的方法，包 括如下步驟1)檢測(cè)患者體液樣品中膜聯(lián)蛋白A3水平；2)若步驟1)中的膜聯(lián)蛋白A3水平高于1. 34ng/ml，判斷腫瘤患者對(duì)鉬類化療藥 物耐藥；其中，優(yōu)選地，所述體液為血清；優(yōu)選地，步驟1)中的檢測(cè)為ELISA檢測(cè)。所述癌 癥是能夠用鉬類化療藥物治療的癌癥，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、 黑色素瘤、食管癌等，優(yōu)選卵巢癌。在本發(fā)明的研究中，本發(fā)明人首次運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并定量人血清中膜 聯(lián)蛋白A3的含量，同時(shí)通過比較鉬類化療藥物耐藥患者和鉬類化療藥物敏感患者血清中 膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平，獲得膜聯(lián)蛋白A3預(yù)示鉬類化療藥物耐藥最佳敏感性和特異性的表 達(dá)水平。建立臨床通過檢測(cè)血清膜聯(lián)蛋白A3水平提示鉬類化療耐藥的平臺(tái)。首先，通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明膜聯(lián)蛋白A3是鉬類化療藥物耐藥特異性標(biāo)志蛋白， 并通過細(xì)胞內(nèi)鉬含量的檢測(cè)說明膜聯(lián)蛋白A3引起鉬類化療藥物耐藥的機(jī)制可能是通過細(xì) 胞內(nèi)鉬的釋放來實(shí)現(xiàn)的。在通過轉(zhuǎn)染正義膜聯(lián)蛋白A3上調(diào)細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平后 的鉬類化療藥物敏感腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉬的耐藥性增強(qiáng)，但是對(duì)紫杉醇和表阿霉素的耐藥性并 改變，這說明膜聯(lián)蛋白A3是鉬類化療藥物耐藥的特異性相關(guān)蛋白，膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)水平 決定了腫瘤細(xì)胞對(duì)鉬類化療藥物的敏感性。一個(gè)理想的標(biāo)志物是能夠分泌到外周血或者人 體的其它體液中，便于檢測(cè)。本發(fā)明人收集鉬類化療藥物敏感和耐藥腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基上 清，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞是否能夠外分泌膜聯(lián)蛋白A3以及蛋白分泌量的調(diào)節(jié)方式。為避免高豐度 蛋白影響，培養(yǎng)基優(yōu)選無血清培養(yǎng)基。采用離心超濾技術(shù)，將培養(yǎng)基中的液體進(jìn)行濃縮，采 用免疫印記技術(shù)檢測(cè)濃縮液中膜聯(lián)蛋白A3含量并進(jìn)行半定量。發(fā)現(xiàn)鉬類化療藥物耐藥的 腫瘤細(xì)胞(卵巢癌細(xì)胞)外泌膜聯(lián)蛋白A3的能力明顯強(qiáng)于藥物敏感細(xì)胞。改變膜聯(lián)蛋白 A3外泌量，可以通過改變細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3含量實(shí)現(xiàn)。這說明外液中膜聯(lián)蛋白A3水平能 準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)水平，并且能夠判定細(xì)胞對(duì)鉬類化療藥物敏感性。其次，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了卵巢癌細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3的外泌現(xiàn)象和膜聯(lián)蛋白A3 外泌途徑，而一種好的預(yù)示鉬類化療藥物耐藥的標(biāo)志物是能夠在人體外分泌的體液或者血 液中以便檢測(cè)到這種物質(zhì)，并且這種物質(zhì)在人體液體中的表達(dá)水平與鉬類化療藥物敏感性具有一定的相關(guān)性。使用人類膜聯(lián)蛋白A3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒(ANXA3 ELISAkit)成 功檢測(cè)并定量了人血清中膜聯(lián)蛋白A3的含量，正常婦女血清膜聯(lián)蛋白A3平均表達(dá)水平為 0. 859士0. 0744，卵巢癌患者血清膜聯(lián)蛋白A3平均表達(dá)水平為1. 6898士2. 6563，兩組進(jìn)行 Mann-Whitney檢驗(yàn)，P < 0. 0001。將所有卵巢癌患者分為鉬類化療藥物耐藥組和鉬類化療 藥物敏感組，耐藥組膜聯(lián)蛋白A3平均水平為2. 1145 士 3. 3833，敏感組膜聯(lián)蛋白A3平均水 平為1.0528士0. 1178，兩組比較P = 0.0003 < 0.05。當(dāng)膜聯(lián)蛋白A3水平大于1. 13ng/ml 時(shí)，該蛋白預(yù)測(cè)卵巢癌鉬類化療藥物耐藥的敏感性達(dá)到63%，特異性80%。卵巢癌患者血 清全部收集于化療前，未受化療影響，全部卵巢癌患者在術(shù)后都接受了鉬類化療藥物為主 的聯(lián)合化療。綜上，腫瘤患者血清中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平能夠很好地預(yù)測(cè)卵巢癌患者對(duì)鉬 類化療藥物的敏感性。本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉬的方法， 所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中armenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療 藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中DNA與鉬結(jié) 合的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中armenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述 鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供以及一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù) 量的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中armenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述 鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。為了更好地說明腫瘤細(xì)胞(卵巢癌細(xì)胞)能夠持久地外泌膜聯(lián)蛋白A3蛋白，本 發(fā)明申請(qǐng)人運(yùn)用電鏡技術(shù)觀察了膜聯(lián)蛋白A3的外泌途徑。以兩種順鉬耐藥卵巢癌細(xì)胞 SK0V3/Cis和A2780/Cis，兩種順鉬敏感卵巢癌細(xì)胞SK0V3和A2780，兩種轉(zhuǎn)染了膜聯(lián)蛋白 A3正義質(zhì)粒上調(diào)順鉬敏感細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)的細(xì)胞SK0V3/Arm和A2780/Arm，兩種轉(zhuǎn) 染了膜聯(lián)蛋白A3反義質(zhì)粒下調(diào)順鉬耐藥細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)的細(xì)胞SK0V3/Cis/R和 A2780/Cis/R為研究對(duì)象，運(yùn)用免疫熒光法和免疫電鏡法觀察膜聯(lián)蛋白A3蛋白在細(xì)胞亞微 結(jié)構(gòu)地分布，探討膜聯(lián)蛋白A3外泌途徑。透射電鏡下，觀察上述順鉬敏感和耐藥卵巢癌細(xì) 胞亞微結(jié)構(gòu)，與順鉬敏感細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)更多的囊泡樣結(jié)構(gòu)，該結(jié) 構(gòu)散在分布于胞漿內(nèi)，表面光滑，不同于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，囊泡內(nèi)也沒有類似線粒體 樣的脊，某些囊泡內(nèi)還存在某些不明的顆粒物質(zhì)，不同于溶酶體內(nèi)的均質(zhì)。延細(xì)胞膜觀察囊 泡，則能觀察到某些囊泡離胞膜很近，有些跟胞膜融合破口，有些則已經(jīng)突破胞膜外。運(yùn)用 透射電鏡觀察轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3正義質(zhì)粒上調(diào)順鉬敏感細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平后，發(fā)現(xiàn)在 敏感細(xì)胞與轉(zhuǎn)染前相比胞漿內(nèi)也出現(xiàn)了很多類似順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)的囊泡結(jié)構(gòu)；相反， 轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3反義質(zhì)粒下調(diào)順鉬耐藥細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平后，順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi) 囊泡則大量減少了，以上說明細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的膜聯(lián)蛋白A3可以導(dǎo)致胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。運(yùn) 用免疫熒光技術(shù)，特異性的染色上述8種細(xì)胞胞核胞漿內(nèi)的膜聯(lián)蛋白A3蛋白，發(fā)現(xiàn)卵巢癌 細(xì)胞種膜聯(lián)蛋白A3主要分布于胞漿，少數(shù)分布于胞核，主要還是一種胞漿蛋白。運(yùn)用免疫 電鏡技術(shù)，對(duì)膜聯(lián)蛋白A3細(xì)胞分布進(jìn)行亞細(xì)胞器定位，對(duì)上述8種細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3進(jìn)行 免疫染色，采用膠體金顆粒標(biāo)記膜聯(lián)蛋白A3蛋白，發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3大量分布于胞漿內(nèi)膜結(jié) 構(gòu)上，包括透射電鏡下發(fā)現(xiàn)的囊泡的膜表面，同時(shí)在個(gè)別囊泡，特別是靠近胞膜的囊泡內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3的存在，說明膜聯(lián)蛋白A3通過囊泡的形式外泌。上述的調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉬的方法、調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫 瘤細(xì)胞中DNA與鉬結(jié)合的方法、以及調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù)量的方法， 都包括改變腫瘤細(xì)胞中annenxinA3表達(dá)水平的步驟，該步驟可以通過下面的方法實(shí)現(xiàn)，例 如通過提高腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜 聯(lián)蛋白A3基因而提高細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)正義膜聯(lián)蛋白A3 基因的質(zhì)粒來提高所述細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量；或者通過減少和/或抑制腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì) 胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3的反義核酸和/或特異于膜聯(lián)蛋白A3的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞 中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)反義膜聯(lián)蛋白A3的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體 來降低細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量。在本發(fā)明的所有方面，如果適用的話，優(yōu)選的是，所述腫瘤細(xì)胞包括但不限于如下 癌癥的細(xì)胞，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等的細(xì) 胞，優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞。在本發(fā)明的所有方面，如果適用的話，優(yōu)選的是，所述鉬類化療藥物包括但不限于 順鉬、卡鉬、草酸鉬、奈達(dá)鉬、樂鉬等，優(yōu)選的是順鉬。在本發(fā)明中，術(shù)語“耐藥細(xì)胞”是指相對(duì)于同類親本細(xì)胞，不易接受一些刺激而發(fā) 生相應(yīng)改變的細(xì)胞。本發(fā)明中對(duì)應(yīng)為不易接受鉬類化療藥物刺激發(fā)生相應(yīng)改變的細(xì)胞。在本發(fā)明中，術(shù)語“敏感細(xì)胞”是指容易接受一些刺激而發(fā)生相應(yīng)改變的細(xì)胞。本 發(fā)明中對(duì)應(yīng)為易對(duì)鉬類化療藥物刺激發(fā)生相應(yīng)改變的細(xì)胞。在本發(fā)明中，術(shù)語“耐藥性”是指隨時(shí)間延長(zhǎng)藥物效果降低，或者需加大劑量才能 保證藥效不減。本發(fā)明指細(xì)胞對(duì)鉬類化療藥物的耐藥性，通常用藥物半數(shù)致死量(IC50)和 耐藥指數(shù)(RI)來表示。在本發(fā)明中，對(duì)于術(shù)語“敏感性”，當(dāng)與特異性相提時(shí)或者作為統(tǒng)計(jì)學(xué)上的概念時(shí)， 是指化驗(yàn)檢查結(jié)果為“真陽性”的百分率；其它情況則指與“耐藥性”相對(duì)的概念。在本發(fā)明中，術(shù)語“特異性”是指化驗(yàn)檢查結(jié)果為“真陰性”的百分率。在本發(fā)明中，如果沒有特殊說明，SK0V3和A2780為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SK0V3和A2780， SK0V3/Cis是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SK0V3順鉬耐藥細(xì)胞亞系，A2780/Cis是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的A2780順 鉬耐藥細(xì)胞亞系，上述空質(zhì)粒為pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒。發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次通過鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清實(shí)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白A3表達(dá) 水平的檢測(cè)，并且首次給出了評(píng)估腫瘤患者對(duì)鉬類化療藥物敏感性的方法，使得能夠及早 地發(fā)現(xiàn)鉬類化療藥物耐藥，及時(shí)地改變腫瘤治療方案，提高5年生存率，并改善預(yù)后。


在下面的附圖中，SK0V3和A2780為轉(zhuǎn)染空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的SK0V3和A2780 細(xì)胞；SK0V3/Cis是轉(zhuǎn)染空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的SK0V3順鉬耐藥細(xì)胞亞系，A2780/Cis是 轉(zhuǎn)染空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的A2780順鉬耐藥細(xì)胞亞系；SK0V3/Ann和A2780/Ann細(xì)胞系分別是SK0V3和A2780轉(zhuǎn)染正義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克??；SK0V3/Cis/R和 A2780/Cis/R是SK0V3/Cis和A2780/Cis轉(zhuǎn)染反義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。圖1 八種卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的鉬濃度比較，< 0. 01，**P < 0. 001。圖 2 :SK0V3、SK0V3/Ann 細(xì)胞 Pt 排出率比較。圖3 八種卵巢癌細(xì)胞Pt-DNA濃度比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01。圖4 卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)基上清中膜聯(lián)蛋白A3檢測(cè)。Parental代表親本細(xì)胞，即未 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞；Transfectant代表轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的腫瘤細(xì)胞。圖A :SK0V3和A2780均 轉(zhuǎn)染正義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒，胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平上調(diào)；圖B :SK0V3/Cis和A2780/Cis均轉(zhuǎn) 染反義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒，胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平下調(diào)；β -actin為肌動(dòng)蛋白，為本實(shí)驗(yàn) 內(nèi)參照。圖5 :A 順鉬敏感卵巢癌細(xì)胞(SK0V3和A2780)及其順鉬耐藥細(xì)胞(SK0V3/Cis和 A2780/Cis)透射電鏡下亞微結(jié)構(gòu)的改變(50，OOOx)。B 延細(xì)胞膜觀察胞漿內(nèi)增多的囊泡結(jié) 構(gòu)與細(xì)胞膜的關(guān)系(100，OOOx)。C:轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3正、反義質(zhì)粒后，卵巢癌細(xì)胞胞漿內(nèi)囊 泡的變化。箭頭所示為胞漿內(nèi)異常囊泡結(jié)構(gòu)。圖6 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)膜聯(lián)蛋白A3在卵巢癌細(xì)胞中的定位。圖7 免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)膜聯(lián)蛋白A3亞細(xì)胞器定位(50，OOOx和100，OOOx對(duì)比觀 察)。A:對(duì)照(PBS代替膜聯(lián)蛋白A3抗體)；B、C、D顯示的是膜聯(lián)蛋白A3在囊泡表面及囊 泡內(nèi)的定位。胞漿內(nèi)的黑色顆粒為膠體金顆粒，每一個(gè)顆粒都代表膜聯(lián)蛋白A3蛋白；小箭 頭所指示的是膜聯(lián)蛋白A3蛋白所在的位置。大箭頭指示囊泡。100，OOOx圖為50，OOOx圖 內(nèi)方框的放大圖。圖8 膜聯(lián)蛋白A3在耐藥細(xì)胞SK0V3/Cis培養(yǎng)上清中exosome (細(xì)胞內(nèi)囊泡釋放 到細(xì)胞外的一種存在形式)的表達(dá)。圖A 透射電鏡觀察exosome的形態(tài)，多為圓形或橢圓 形，直徑在40-100nm之間；圖B和C 免疫電鏡觀察膜聯(lián)蛋白A3在exosome中的表達(dá)；圖D DMEMl代表正常SK0V3/Cis培養(yǎng)上清濃縮液(濃縮倍數(shù)75x)，DMEM2代表去除了 exosome的 SK0V3/Cis培養(yǎng)上清濃縮液(濃縮倍數(shù)75x)，sucrose代表提取exosome過程中的exosome 上層蔗糖液，Hsp70為exosome內(nèi)參照(exosome多表達(dá)Hsp70)。圖9 圖A :30例化療耐藥卵巢癌患者、20例化療敏感卵巢癌患者和30例正常婦女 血清中膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)水平散點(diǎn)圖；圖B 將血清中膜聯(lián)蛋白A3的水平大于1. 13ng/ml 的卵巢癌患者列為A組，小于1. 13ng/ml的卵巢癌患者列為B組，繪制Kaplan Meier曲線， 兩組的無鉬間期(第一療程的含鉬類化療藥物的聯(lián)合化療結(jié)束后到卵巢癌復(fù)發(fā)的時(shí)間)長(zhǎng) 度存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P = 0. 009 < 0. 05)。IQR 四分位間距數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1 膜聯(lián)蛋白A3調(diào)節(jié)卵巢癌上皮細(xì)胞鉬類化療藥物耐藥機(jī)制體外研究1.實(shí)驗(yàn)方法1)細(xì)胞系及其培養(yǎng)條件人上皮性卵巢癌細(xì)胞SK0V3細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心， SK0V3/Cis是本發(fā)明人誘導(dǎo)的SK0V3順鉬耐藥細(xì)胞亞系(可參考閆雪冬，張明偉，潘凌 亞·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2006，26 (7) :739-744)。本實(shí)驗(yàn)還使用A2780及其順鉬耐藥細(xì)胞亞 系 A2780/Cis (可以參考 LuanYZ，Li L. et al. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2004，39 (6) 403-407.)。這些細(xì)胞均轉(zhuǎn)染有空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒。SK0V3/Ann和A2780/Ann細(xì)胞系 分別是SK0V3和A2780轉(zhuǎn)染正義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，SK0V3/Cis/R和 A2780/Cis/R是SK0V3/Cis和A2780/Cis轉(zhuǎn)染反義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克 隆(可參考 Xuedong Yan, Jie Yin, Huiyu Yao, Ning Mao, Yili Yang, Lingya Pan. Cancer Res, 2010, 70 (4) :0F1_9.)，所有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆都經(jīng)過Western blot技術(shù)驗(yàn)證過。同時(shí)采用 SK0V3 和 A2780 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞(可參考 Xuedong Yan，Jie Yin, Huiyu Yao, Ning Mao, Yili Yang, Lingya Pan. Cancer Res, 2010, 70 (4) :0F1_9.)作為對(duì)照。上述所有細(xì)胞系都在含10%胎牛血清的DMEM(HG)的培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，置于 37°C,5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至80%密度時(shí)采用0. 25%胰酶消化傳代。2)藥物敏感實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉬(Cisplatin，CDDP)、卡鉬(Carboplatin，CBP)、紫杉醇(Taxol)和 表阿霉素(印irubicin)的敏感性。取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按2000/孔/100 μ L，每種藥物 每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，對(duì)照孔12個(gè)，不加藥物，其中6個(gè)孔為陰性對(duì)照(加入細(xì)胞、不加 藥物)，6個(gè)孔為空白對(duì)照(只加培養(yǎng)基)。37°C、5% CO2培養(yǎng)24小時(shí)后加入化療藥物，稀 釋成7個(gè)梯度，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，加入5mg/mL MTT20 yL,37°C>5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，控 凈培養(yǎng)基，加100 μ L裂解液(含20% SDS, 50% N-N 二甲基甲酰胺，ρΗ 4. 7)，過夜，全自動(dòng) 酶標(biāo)儀以540nm測(cè)定吸光值(0D值)，可求算每種藥物濃度吸光值的平均值，計(jì)算細(xì)胞存活 率及抑制率，根據(jù)藥物濃度和抑制率，使用SPSS11. 5軟件計(jì)算IC50(抑制50%細(xì)胞生長(zhǎng)的 藥物濃度)及耐藥指數(shù)(RI)。抑制率(inhibitionrate) = [ (0D 對(duì)照-OD 實(shí)驗(yàn))/OD 對(duì)照]X 100%RI =耐藥細(xì)胞系的IC50/敏感細(xì)胞系的IC503)細(xì)胞內(nèi)鉬(Pt)濃度測(cè)定待各細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化、計(jì)數(shù)，以2X106細(xì)胞種至IOOmrn培養(yǎng)皿，24小時(shí) 后加入⑶DP至終濃度10 μ Μ, 37°C,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)(對(duì)照組不加藥 物)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，收集至Ep管中。使用50-100 μ L 70% 硝酸裂解細(xì)胞，置65°C水浴2小時(shí)(此時(shí)取出部分裂解產(chǎn)物利用BCA法檢測(cè)蛋白濃度)，向 裂解產(chǎn)物中加入蒸餾水，將其稀釋至5%的硝酸濃度。利用電感偶合等離子質(zhì)譜檢測(cè)細(xì)胞 內(nèi)的鉬(Pt)含量。為檢測(cè)⑶DP排出情況，將細(xì)胞加入⑶DP至終濃度10 μ M，37°C、5% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，換成無藥培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，如前步驟收集和 處理細(xì)胞，檢測(cè)Pt含量。Pt排出率=(1-無藥培養(yǎng)2小時(shí)細(xì)胞內(nèi)Pt濃度/加藥24小時(shí)細(xì) 胞內(nèi)Pt濃度)X 100%。
4) DNA結(jié)合Pt的檢測(cè)待各細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化、計(jì)數(shù)，以2X106細(xì)胞種至IOOmm培養(yǎng)皿，24小時(shí) 后加入⑶DP至終濃度10 μ Μ, 37°C,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)(對(duì)照組不加藥 物)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，收集至Ep管中。按照Qiagen DNA提 取試劑盒說明書提取DNA，將300 μ L Buffer FGl裂解細(xì)胞，吹打混勻，加入300 μ L Buffer re2/protease，顛倒混勻3次，置65°C水浴10分鐘，加入600 μ L異丙醇，顛倒混勻，直至出 現(xiàn)DNA線狀或塊狀的沉淀，IOOOOg離心3分鐘，棄上清，將Ep管倒置在濾紙上吸干水分，加 入600 μ 1 70%乙醇，渦旋5s，IOOOOg離心3分鐘，棄上清，將Ep管倒置在濾紙上吸干水分， 空氣風(fēng)干DNA沉淀直至液體揮發(fā)為止，加入50-100 μ L 70%硝酸裂解細(xì)胞，置65°C水浴2 小時(shí)(此時(shí)取出部分裂解產(chǎn)物利用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度)，向裂解產(chǎn)物中加入蒸餾水， 將其稀釋至5%的硝酸濃度。利用電感偶合等離子質(zhì)譜檢測(cè)與DNA結(jié)合的Pt含量。5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSSl 1. 5統(tǒng)計(jì)軟件處理，經(jīng)t檢驗(yàn)和方差檢驗(yàn)(Oneway Anova)進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)分析。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)細(xì)胞對(duì)順鉬、卡鉬、紫杉醇、表阿霉素的耐藥性檢測(cè)CDDP耐藥細(xì)胞SK0V3/Cis和A2780/Cis，不僅對(duì)CDDP耐藥，而且對(duì)CBP也產(chǎn)生了 相同的耐藥性(表1)。另外檢測(cè)了各轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)紫杉醇和表阿霉素的敏感性。我們可以看 到，與敏感細(xì)胞SK0V3和A2780相比，耐藥細(xì)胞SK0V3/Cis和A2780/Cis不僅對(duì)鉬類產(chǎn)生了 耐藥，而且對(duì)紫杉醇和表阿霉素出現(xiàn)了交叉耐藥，他們的RI分別顯示在表2中。而將膜聯(lián) 蛋白A3過表達(dá)或不表達(dá)的細(xì)胞與其對(duì)照(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞)相比，對(duì)紫杉醇和表阿霉素 的敏感性無明顯改變(表2)。表1鉬類耐藥細(xì)胞對(duì)順鉬和卡鉬的耐藥性比較 *P < 0. 05，**P < 0. 01，與親本細(xì)胞相比表2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞對(duì)紫杉醇、表阿霉素的耐藥性。 2) Pt濃度的測(cè)定各細(xì)胞經(jīng)10 μ M⑶DP作用24小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Pt濃度。與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的敏感 細(xì)胞(SK0V3、A2780)相比，在膜聯(lián)蛋白A3過度表達(dá)的細(xì)胞(SK0V3/Ann，A2780/Ann)中，Pt 濃度顯著降低(P < 0. 001，P = 0. 002)。與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的耐藥細(xì)胞(SK0V3/Cis、A278/Cis) 相比，在膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞(SK0V3/Cis/R、A2780/Cis/R)中，Pt濃度明顯升高(P =0. 008，P = O. 009)(圖1)。在檢測(cè)Pt排出率的實(shí)驗(yàn)中，SK0V3細(xì)胞為(31. 4士4. 0) %, SK0V3/Ann 細(xì)胞為(59. 2士2. 2) %，SK0V3/Ann 細(xì)胞中 Pt 排出明顯增加(P < 0. 001)(圖 2)。 另外，在檢測(cè)Pt-DNA結(jié)合的結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)在SK0V3/Ann、A2780/Ann中，與DNA結(jié)合的Pt濃 度降低(P = 0. 007，P = 0. 011)。在 SK0V3/Cis/R、A2780/Cis/R 中，與 DNA 結(jié)合的 Pt 濃度 明顯升高(P = 0. 003，P = O. 026)(圖 3)。3.結(jié)論細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少是造成鉬類耐藥的重要機(jī)制之一，而膜聯(lián)蛋白A3的一個(gè)重 要功能是介導(dǎo)膜與膜之間的接觸，它可以通過磷脂酰絲氨酸結(jié)合到質(zhì)膜上，使細(xì)胞膜的通 透性發(fā)生改變，并且參與細(xì)胞的吞噬、分泌等活動(dòng)。因此，我們檢測(cè)了膜聯(lián)蛋白A3過表達(dá) 和膜聯(lián)蛋白A3下調(diào)的細(xì)胞中是否存在鉬的蓄積改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在膜聯(lián)蛋白A3過表 達(dá)細(xì)胞中，鉬濃度明顯減少，Pt-DNA結(jié)合明顯減少，而在膜聯(lián)蛋白A3下調(diào)的細(xì)胞中獲得了 與此相一致的結(jié)果，說明細(xì)胞內(nèi)鉬類藥物蓄積減少是膜聯(lián)蛋白A3導(dǎo)致鉬類耐藥的重要因 素。鉬類藥物通過與DNA形成加合物來損傷DNA，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別加合物可以導(dǎo)致p53 活化，激活MAPK通路，誘導(dǎo)BAX表達(dá)，最終導(dǎo)致凋亡(Hartwell LH, et al. Science，1994， 266(5192) =1821-1828) ο本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。與轉(zhuǎn)染了空的pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒的親本 細(xì)胞相比較，在膜聯(lián)蛋白A3過表達(dá)細(xì)胞中，給予順鉬處理后，鉬濃度明顯減少，Pt-DNA結(jié)合 明顯減少，P53增加的程度小于親本細(xì)胞，因此凋亡減少，導(dǎo)致耐藥。由于臨床治療中CDDP 化療劑量的血漿峰值濃度為10 μ Μ,因此在這部分實(shí)驗(yàn)中CDDP的作用濃度均采用此劑量。實(shí)施例2 上皮性卵巢癌細(xì)胞外泌膜聯(lián)蛋白A3的鑒定1.實(shí)驗(yàn)方法1)細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)
同實(shí)施例1。2)上皮性卵巢癌細(xì)胞系培養(yǎng)基上清的收集和濃縮取2X IO5個(gè)細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)至70%的時(shí)候更換無 血清DMEM，約每IX IO6細(xì)胞給予5ml培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，然后將此 無血清DMEM收集置IOml離心管內(nèi)，IOOOg離心10分鐘，以去除DMEM中的有形成分，離心后 小心收集上清，置于Amicon Ultra-15超濾管(美國(guó)Millipore公司)內(nèi)，3000g水平離心 15分鐘，收集濃縮后的液體于Ep管內(nèi)，-70°C保存。3) Western blot半定量檢測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的含量a.檢測(cè)樣品的準(zhǔn)備經(jīng)過濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)基上清和細(xì)胞內(nèi)總蛋白為本實(shí)驗(yàn)待測(cè)樣品，培養(yǎng)基上清樣品 與Iaemmli上樣緩沖液(美國(guó)Bio-Rad公司)2 1混合制成上樣樣品，置于冰水浴中，體 積大約20微升為好。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的非耐藥和耐藥細(xì)胞，胰酶消化，1500rpm離心5分鐘， 棄去上清，加入無菌PBS (pH 7. 4)重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，1500rpm離心5分鐘，棄上清，用冷 PBS洗細(xì)胞兩次，吸凈上清。約IO6個(gè)細(xì)胞加Iaemmli裂解液(美國(guó)Bio-Rad公司)，在裂解 細(xì)胞時(shí)，其它細(xì)胞處于冰水浴。加入裂解液后，99°C煮沸10分鐘，10000g、4°C離心10分鐘， 取出后冰水浴。取出測(cè)定蛋白濃度的樣品后，將剩余的樣品每100 μ 1加入2-ME (2-巰基乙 醇)5μ l，10000g、4°C離心 10 分鐘，-20°C保存。b. BCA法測(cè)細(xì)胞內(nèi)總蛋白濃度取BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Pierce)A液、B液以50 1 (ν ν)混合，取上述樣品 加入500 μ 1 AB混合液中，混勻，空白對(duì)照為2 μ 1裂解液加入到500 μ 1 AB混合液，37°C水 浴 30 分鐘，以空白對(duì)照調(diào)零，在 Smartspec plus spectrophotometer (Bio-Rad)測(cè) 562nm 波長(zhǎng)的OD值。使用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算樣品濃度。c. SDS-PAGE 電泳制膠先制備10%分離膠5ml 去離子水1. 9ml，30 %丙烯酰胺1.7ml，1.5% Tris 1.3ml (pH 8. 8), 10% SDS 0. 05ml，10%過硫酸胺 0. 05ml，TEMED 0.002ml。待 30 分 鐘分離膠凝固后，再配制5%濃縮膠2ml 去離子水1. 4ml，30%丙烯酰胺0. 33ml, 1.0% TrisO. 25ml (pH 6. 8), 10% SDS 0. 02ml，10 % 過硫酸胺 0. 02ml，TEMED0. 002ml。加樣待 濃縮膠凝固后，取20 μ 1濃縮培養(yǎng)基上樣樣品、30 μ g細(xì)胞內(nèi)總蛋白加入樣品槽中。電 泳加入足夠量的Tris-甘氨酸電泳緩沖液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0. 1 % SDS)80-100v,電泳 2 小時(shí)。d.轉(zhuǎn)膜制備轉(zhuǎn)移緩沖液48mM Tris-HCl，39mM甘氨酸，0. 037% SDS，20%甲醇。剪好6張 與凝膠大小一致的濾紙和一張PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)，濾紙置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸 泡15分鐘，PVDF膜用甲醇激活10秒后再浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。濾紙、凝膠和PVDF膜按照 三層濾紙-PVDF膜-凝膠-三層濾紙的次序疊放，整個(gè)操作過程在轉(zhuǎn)移緩沖液中完成，注意 不能有氣泡。右下角標(biāo)記。270mA、冰水浴中電轉(zhuǎn)移1小時(shí)。e.免疫印跡取下轉(zhuǎn)上蛋白的PVDF膜，蛋白面朝上，TBST(200mM Tris-HCl, 1. 5mM NaCl,0. 05% Tween-20)搖洗3次，每次5分鐘后，在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1小時(shí)后取出，加入封閉液配制的一抗(兔抗人膜聯(lián)蛋白A3特異性多克隆抗體)，4°C輕輕搖晃過夜。以TBST 搖洗3次，每次5分鐘，之后加入封閉也配制的HRP標(biāo)記的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山 羊抗兔IgG抗體)，室溫孵育1小時(shí)，TBST搖洗三次，將化學(xué)發(fā)光底物液ECL(美國(guó)Thermo 公司)A、B液按體積1 1混合，將PVDF膜作用5分鐘，暗示X光片曝光顯影。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果腫瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基蛋白含量很低，上清經(jīng)過超濾管濃縮之后，體積可以由 15ml濃縮到500 μ 1，這樣大大提高了培養(yǎng)基中蛋白的含量，對(duì)通過Western blot方法檢測(cè) 出膜聯(lián)蛋白A3提供了基礎(chǔ)。運(yùn)用Western blot技術(shù)成功的在濃縮的培養(yǎng)基上清中檢測(cè)出 膜聯(lián)蛋白A3，并對(duì)上述8種卵巢癌細(xì)胞系的培養(yǎng)基上清中膜聯(lián)蛋白A3進(jìn)行半定量。半定 量比較主要是比較免疫印跡膜聯(lián)蛋白A3蛋白條帶的粗細(xì)。在上述2種順鉬耐藥卵巢癌細(xì) 胞系培養(yǎng)基上清和細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平均高于其對(duì)應(yīng)的順鉬敏感細(xì)胞系，尤其是 上清中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平升高更為明顯。在轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3反義質(zhì)粒下調(diào)順鉬耐藥 細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平后(SK0V3/Cis/R和A2780/Cis/R細(xì)胞系)，細(xì)胞培養(yǎng)基中膜 聯(lián)蛋白A3水平則明顯下降。相反，在轉(zhuǎn)染了正義膜聯(lián)蛋白A3質(zhì)粒的SK0V3/Arm和A2780/ Ann細(xì)胞的培養(yǎng)基中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖4)。3.結(jié)論卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)基上清中含有一定量的膜聯(lián)蛋白A3，說明卵巢癌細(xì)胞具有分泌膜 聯(lián)蛋白A3的功能，通過半定量比較，說明卵巢癌細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的多少與細(xì)胞內(nèi)膜 聯(lián)蛋白A3的含量成正相關(guān)關(guān)系，培養(yǎng)基中高水平的膜聯(lián)蛋白A3能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)卵巢癌細(xì) 胞對(duì)順鉬的耐藥性?；谝陨希ぢ?lián)蛋白A3具有成為有效的預(yù)示鉬類化療藥物耐藥的生物 學(xué)標(biāo)志物的基礎(chǔ)。實(shí)施例3 膜聯(lián)蛋白A3在卵巢癌細(xì)胞中的外泌途徑1.實(shí)驗(yàn)方法1)細(xì)胞系及培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞及其培養(yǎng)條件與“實(shí)施例二”完全一致，此不重復(fù)敘述。2)細(xì)胞免疫熒光及其激光共聚焦成像以2 X IO4細(xì)胞種至已鋪好玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5 % CO2飽和濕度培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗3次，0. 5% TritonX-IOO透膜20分鐘，PBS洗3次，2% BSA封閉30分鐘，1 50兔抗人膜聯(lián)蛋白A3多 克隆抗體(一抗)孵育，4°C過夜。PBS洗3次，山羊抗兔FITC 二抗孵育1小時(shí)，PBS洗3次 后1 1000含0. RNase的PI染色液室溫孵育20分鐘，PBS洗3次，利用含90%甘油 的PBS封片。在Radiance 2100激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。3)透射電鏡a.對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)彡IX IO6)，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2此。b.加入PBS 10ml，送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(北京海淀區(qū)太平路27號(hào))儀器檢測(cè)中心 電鏡室制備細(xì)胞透射電鏡標(biāo)本。c.標(biāo)本制作過程如下細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PBS洗兩遍，用細(xì)胞刷將細(xì)胞刮 下，IOOOg 離心 10 分鐘，3%戊二醛(1/15M PBS pH 7. 4)，4°C下固定 2 小時(shí)，4°C下 1/15M PBS+0. 19M蔗糖緩沖液漂洗15分鐘。乙醇4°C下梯度脫水(50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇+90%丙酮、90%丙酮、100%丙酮各10分鐘)，100%丙酮在室溫下脫水10分鐘。 100%丙酮包埋劑(1 1)室溫浸透30分鐘，純包埋劑浸透過夜。進(jìn)行包埋聚合時(shí)間為 35°C，12小時(shí)45°C，12小時(shí)；60°C，24小時(shí)。ULTRACUT E/S型切片機(jī)(美國(guó)RMC公司)進(jìn) 行超薄切片，醋酸鈾染液避光染色10分鐘，檸檬酸鉛染色10分鐘。d.電壓 75kV，EM400T 電鏡(荷蘭 Philips 公司)觀察，選擇 X8000、X 22000 電 鏡照相，觀察細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)。4)免疫電鏡a.對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)彡IX IO6)，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次。b.加入PBS 10ml，送中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院電鏡室制備細(xì)胞超薄切片(70-80nm厚)。過 程如下細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PBS洗兩遍，用細(xì)胞刷將細(xì)胞刮下，IOOOg離心10分鐘，4%磷 酸多聚甲醛和0. 戊二醛1 1混合的固定液，4°C下固定4-6小時(shí)，經(jīng)乙醇梯度脫水后采 用特殊的白樹脂(美國(guó)Sigma公司)包埋細(xì)胞。待包埋劑凝聚后，ULTRA⑶T E/S型切片機(jī) (美國(guó)RMC公司)進(jìn)行超薄切片。c.免疫染色去離子水沖洗超薄切片三次，置于BSA的封閉液中封閉30分鐘， 1 200兔抗人膜聯(lián)蛋白A3多克隆抗體4°C濕盒中孵育過夜，0. IM PBS清洗3次，1 40 膠體金顆粒標(biāo)記的驢抗兔二抗室溫孵育1小時(shí)，去離子水清洗3次。d.染色觀察免疫染色后，細(xì)胞超薄切片再經(jīng)過醋酸鈾染液避光染色10分鐘，檸 檬酸鉛染色10分鐘。置電鏡下觀察膠體金顆粒標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白A3蛋白，50000X電鏡下照 相。5)SK0V3/Cis細(xì)胞系培養(yǎng)上清中exosome提取、觀察以及膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)鑒定a.取約5父106個(gè)31(0￥3/(^8細(xì)胞平均接種于2個(gè)175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁 后，更換為無血清培養(yǎng)基(DMEM)，置5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。收集培養(yǎng)基上清 大約60ml。b.將收集來的培養(yǎng)基上清于lOOOXg，IOmin離心，去除細(xì)胞及碎片成分，收集 離心后取上清。再將上清置于 Centricon Plus_20filter capsule (Millipore, USA)中， 4000Xg離心30分鐘，最終將60ml上清濃縮為1. 5ml濃縮液，再將濃縮液以PBS稀釋至 15ml，置于 IOOkDa Amicon Ultra-15 (Milipore, USA)中，4000Xg 離心 30 分鐘，濃縮為 200 μ 1濃縮液。c.收集200 μ 1濃縮液，PBS稀釋至5ml，并轉(zhuǎn)移入5ml超離管中，同時(shí)以300 μ 1 30% sucrose/D20墊底，100，000X g，4°C離心40分鐘，收集350 μ 1底部葡萄糖墊，并以 PBS 稀釋至 15ml，再次用 IOOkDaAmicon Ultra-15 (Milipore, USA)濃縮至 200 μ 1 (此為含 exosome的液體)。同時(shí)收集上層350 μ 1低濃度葡萄糖液(后面用“ sucrose ”表示此樣本)， 作為無exosome的對(duì)照液體，_20°C保存，用于westernblot分析。將100 μ 1含exosome的 液體保存在_20°C冰箱中。低濃度葡萄糖液和含exosome液體在western blot分析時(shí)，先 將液體樣本按1 1比例于Iaemmli上樣緩沖液(美國(guó)Bio-Rad公司)混合，檢測(cè)sucrose 和exosome中膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)(western blot方法已在實(shí)施例2中詳細(xì)描述，此不重復(fù) 描述)Od.此200 μ 1濃縮液中含有大量exosome，將濃縮液滴至炭膜覆蓋的400目鎳網(wǎng) 上，自然晾干，此時(shí)exosome已吸附至鎳網(wǎng)上，1 %戊二醛固定exosome，再以醋酸雙氧鈾負(fù)染色，于透射電鏡下觀察exosome形態(tài)。e.免疫電鏡觀察時(shí)，先將exosome吸附至鎳網(wǎng)后，PBS反復(fù)沖洗3次，1 200兔 抗人膜聯(lián)蛋白A3多克隆抗體4°C濕盒中孵育過夜，0. IMPBS清洗3次，1 40膠體金顆粒標(biāo) 記的驢抗兔二抗室溫孵育1小時(shí)，其后再以戊二醛固定，透射電鏡下觀察。6)無exosome的細(xì)胞培養(yǎng)基上清收集a.將5X106個(gè)SK0V3/Cis細(xì)胞平均接種于2個(gè)T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后 更換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后收集培養(yǎng)基上清約30ml。b.將收集來的培養(yǎng)基上清IOOOXg離心10分鐘，收集上清30ml。c.將收集的上清平分兩份，一份運(yùn)用 IOOkDa Amicon Ultra-15 (Millipore, USA) 在4000 Xg條件下離心30分鐘，收集下層非濃縮液體，體積大約15ml，再將15ml液體運(yùn)用 IOkDa AmiconUltra-15 (Millipore, USA)在同樣條件下離心30分鐘，收集上層約200 μ 1的 濃縮液，此濃縮液便是去除了 exosome的上清，該樣本命名為DMEM2。d.平分的另外一份上清運(yùn)用 IOkDa Amicon Ultra-15 (Millipore, USA)在 4000 Xg條件下離心30分鐘，收集上層大約200 μ 1的濃縮液體，此液體為含有exosome的 濃縮上清，該樣本命名為DMEMl。e.所有樣本保存在-20°C冰箱中，將其1 1與Iaemmli上樣緩沖液(美國(guó) Bio-Rad公司)混合，運(yùn)用western blot方法檢測(cè)膜聯(lián)蛋白A3的表達(dá)水平(western blot 實(shí)驗(yàn)步驟可以參考實(shí)施例2)。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果透射電鏡下，觀察上述順鉬敏感和耐藥卵巢癌細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)，與順鉬敏感細(xì)胞相 比，發(fā)現(xiàn)順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)更多的囊泡樣的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)散在分布于胞漿內(nèi)，表面光 滑，不同于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，囊泡內(nèi)也沒有類似線粒體樣的脊，某些囊泡內(nèi)還能看見 存在某些不明的顆粒物質(zhì)，不同于溶酶體內(nèi)的均質(zhì)。延細(xì)胞膜觀察囊泡，則能觀察到某些 囊泡離胞膜很近，有些跟胞膜融合破口，有些則已經(jīng)突破胞膜外(圖5A B)。運(yùn)用透射電 鏡觀察轉(zhuǎn)染膜聯(lián)蛋白A3正義質(zhì)粒上調(diào)順鉬敏感細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平后，發(fā)現(xiàn)在敏感細(xì) 胞與轉(zhuǎn)染前相比胞漿內(nèi)也出現(xiàn)了很多類似順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)的囊泡結(jié)構(gòu)；相反，轉(zhuǎn)染膜 聯(lián)蛋白A3反義質(zhì)粒下調(diào)順鉬耐藥細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3水平后，順鉬耐藥細(xì)胞胞漿內(nèi)囊泡則 大量減少了(圖5C)，以上說明細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的膜聯(lián)蛋白A3可以導(dǎo)致胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。 運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，特異性的染色上述8種細(xì)胞胞核胞漿內(nèi)的膜聯(lián)蛋白A3蛋白，發(fā)現(xiàn)卵巢 癌細(xì)胞種膜聯(lián)蛋白A3主要分布于胞漿，少數(shù)分布于胞核，主要還是一種胞漿蛋白(圖6)。 運(yùn)用免疫電鏡技術(shù)，對(duì)膜聯(lián)蛋白A3細(xì)胞分布進(jìn)行亞細(xì)胞器定位，對(duì)上述8種細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋 白A3進(jìn)行免疫染色，采用膠體金顆粒標(biāo)記膜聯(lián)蛋白A3蛋白，發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3大量分布于 胞漿內(nèi)膜結(jié)構(gòu)上，包括透射電鏡下發(fā)現(xiàn)的囊泡的膜表面，同時(shí)在個(gè)別囊泡，特別是靠近胞膜 的囊泡內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A3的存在(圖7)，說明膜聯(lián)蛋白A3通過囊泡的形式外泌。運(yùn) 用western blot法，檢測(cè)DMEMl和DMEM2之間膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)含量差異，說明exosome攜 帶了大量膜聯(lián)蛋白A3蛋白。同時(shí)檢測(cè)exosome和sucrose之間膜聯(lián)蛋白A3水平，以說明 exosome的純化度(圖8)。3.結(jié)論膜聯(lián)蛋白A3存在于卵巢癌細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)，但主要存在于胞漿內(nèi)，是一種胞
15漿蛋白。上調(diào)的膜聯(lián)蛋白A3能夠在卵巢癌細(xì)胞胞漿內(nèi)產(chǎn)生囊泡結(jié)構(gòu)，它既不像內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也不 像高爾基體和溶酶體，免疫電鏡驗(yàn)證了該囊泡表面和囊泡內(nèi)存在膜聯(lián)蛋白A3蛋白，沿細(xì)胞 膜觀察囊泡，可以發(fā)現(xiàn)囊泡有和細(xì)胞膜融合和突出細(xì)胞的趨勢(shì)，由此可以說明膜聯(lián)蛋白A3 通過此途徑外泌出細(xì)胞。該分泌機(jī)制為膜聯(lián)蛋白A3作為一種分泌蛋白成為臨床預(yù)示卵巢 癌鉬類化療藥物耐藥生物學(xué)標(biāo)志物，提供了更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。實(shí)施例4 人外周血中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平的檢測(cè)1.實(shí)驗(yàn)方法1)臨床病例資料收集2007-2009年在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院接受體檢的健康婦 女(30例)和在婦產(chǎn)科治療卵巢癌患者(50例)術(shù)前(或術(shù)后化療前)均是本實(shí)驗(yàn)的研究 對(duì)象。健康體檢婦女需滿足一下條件(1)處于育齡期、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期婦女；(2)未患有 任何慢性疾病、感染性疾病和良惡性腫瘤疾?。?3)近一周未服用任何藥物及保健品藥物。 健康婦女血清收集之后置于Ep管中，保存于-70°C，待檢測(cè)。入選本實(shí)驗(yàn)的卵巢癌患者需滿 足(1)術(shù)后組織病理確診為原發(fā)性卵巢上皮性惡性腫瘤；(2)第一次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后， 所有患者均接受了正規(guī)的以鉬類化療藥物為主(順鉬或卡鉬)的單藥或聯(lián)合化療；(3)術(shù) 后和第一次化療結(jié)束后，所有患者均接受了正規(guī)隨訪，隨訪時(shí)間約第一次化療完成后6個(gè) 月到1年?；颊咝g(shù)后第一年每月隨訪1次，第二年每3個(gè)月隨訪一次，第三年以后每6個(gè)月 隨訪一次。每次隨訪均檢測(cè)外周血CA125，婦科檢查，以及相應(yīng)的影像學(xué)檢查，必要時(shí)活檢。 根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)納入研究，收集患者的年齡、病理學(xué)分型、分期、分級(jí)，化療情況(表3)。鉬類 化療藥物耐藥定義為經(jīng)過滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和規(guī)范化療后達(dá)到完全緩解(CR)，持續(xù)時(shí) 間< 6個(gè)月；化療期間腫瘤的最好療效為部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)或進(jìn)展(PD)者。鉬類 化療藥物敏感定義為經(jīng)過滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和規(guī)范化療后達(dá)到臨床完全緩解(CR)，持 續(xù)時(shí)間> 6個(gè)月。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，50例卵巢癌患者經(jīng)過隨訪有30名患者符合耐藥標(biāo)準(zhǔn)，剩 余20名列為敏感組(表3)。表3 50例卵巢癌患者臨床病例資料統(tǒng)計(jì)。a和b 病理分期和臨床分期均根據(jù)國(guó)
際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。 2) ELISA (酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))a.實(shí)驗(yàn)標(biāo)本符合上述入組條件的健康婦女和卵巢癌患者的血清為本實(shí)驗(yàn)的檢 測(cè)對(duì)象。采集血標(biāo)本于5毫升采集管內(nèi)，待血自然凝固后，3000g離心5分鐘，收集上清(血 清)，于Ep管內(nèi)，保存于-70°C。b.采用人膜聯(lián)蛋白A3 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Cusabio公司)定量檢測(cè)血清中膜 聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平。試劑盒內(nèi)含有酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、生物素標(biāo)記抗體稀釋液、 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液、生物素標(biāo)記抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素、底物溶 液、洗滌液和終止液。具體按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，步驟如下(1)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。濃度依次為 0ng/ml、0. 4ng/ml、0. 8ng/ml、l. 6ng/ml、3. 2ng/ml、 6. 2ng/ml、12. 5ng/ml和25ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)前15分鐘配制；(2)加樣。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入已經(jīng)包埋 有armxin A3抗體的酶標(biāo)板內(nèi)，每孔100微升，空白孔內(nèi)加入100微升標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，每孔 均設(shè)復(fù)孔。加樣完畢將酶標(biāo)板覆膜，置于濕盒中，37°C反應(yīng)120分鐘；(3)標(biāo)記。棄去液體，甩干，不用洗滌，每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100微升， 370C，60分鐘；再棄去液體，甩干，洗滌液洗板3次，每次2分鐘，每孔200微升，甩干，加入 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100微升，37°C，60分鐘；(4)顯色。溫育完畢，棄去液體，甩干，洗板5次，依次每孔加入底物溶液90微升， 避光37°C顯色30分鐘后，孔內(nèi)液體顏色部分變藍(lán)，每孔依次加入50微升終止液，此時(shí)液體 轉(zhuǎn)為黃色；(5)檢測(cè)。加入終止液后，15分鐘內(nèi)上酶標(biāo)儀檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為450nm，記錄每孔OD值。c.數(shù)據(jù)處理運(yùn)用Excel以O(shè)D值為Y軸，濃度的Ig值為X軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得 趨勢(shì)線方程式，計(jì)算出每個(gè)樣本平均OD值后帶入公式便可得出每個(gè)樣本內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3的 濃度值。3)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5. 0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)按照正常組、卵巢癌組 (分鉬類化療藥物耐藥組和敏感組兩組)制作膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)散點(diǎn)圖，組間差異比較運(yùn)用 Mann-Whitney分析，當(dāng)P > 0. 05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用人類膜聯(lián)蛋白A3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒(ANXA3 ELISAkit)成功檢測(cè)并 定量了人血清中膜聯(lián)蛋白A3的含量，膜聯(lián)蛋白A3在人外周血中的表達(dá)水平比較低。正常 婦女血清膜聯(lián)蛋白A3平均表達(dá)水平為0. 8590士0. 0744，卵巢癌患者血清膜聯(lián)蛋白A3平 均表達(dá)水平為1.6898士2. 6563，兩組進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)，P < 0.0001。將所有卵巢 癌患者分為鉬類化療藥物耐藥組和鉬類化療藥物敏感組，耐藥組膜聯(lián)蛋白A3平均水平為 2. 1145士3. 3833，敏感組膜聯(lián)蛋白A3平均水平為1.0528士0. 1178，兩組比較P = 0. 0003 < 0. 05(圖9)。當(dāng)膜聯(lián)蛋白A3水平大于1. 13ng/ml時(shí)，該蛋白預(yù)測(cè)卵巢癌鉬類化療藥物耐 藥的敏感性達(dá)到63.3%，特異性80%。當(dāng)大于1.34ng/ml時(shí)，該蛋白預(yù)測(cè)卵巢癌鉬類化療 藥物的敏感性和特異性均達(dá)到100% (表4)。 4.結(jié)論膜聯(lián)蛋白A3作為一種鉬類化療藥物耐藥相關(guān)蛋白，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)具有外分泌的功能，并且運(yùn)用ELISA法成功在人外周血檢測(cè)出膜聯(lián)蛋白A3。并且將耐 藥組和敏感組膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平進(jìn)行比較，耐藥組膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平明顯高于敏感 組，當(dāng)膜聯(lián)蛋白A3水平高于1. 13ng/ml，其預(yù)測(cè)鉬類化療藥物耐藥的敏感性和特異性均超 過50%，當(dāng)高于1. 34ng/ml時(shí)，其敏感性和特異性達(dá)到100%。本實(shí)驗(yàn)選取人血清作為研究 對(duì)象，是基于其比較容易獲得且是臨床常用的檢測(cè)對(duì)象而考慮的，理論上也能夠采用腹水、 尿液、唾液、白帶等其它人體分泌物作為檢測(cè)對(duì)象。在本實(shí)驗(yàn)中，出于質(zhì)量控制的考慮，全部 樣本檢測(cè)均有單人一次性操作完成，數(shù)據(jù)分析則采取雙盲法分析。 盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平的方法，其特征在于，使用鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清作為被檢測(cè)的樣品，其中，優(yōu)選地，所述鉑類化療藥物為順鉑；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，并且更優(yōu)選為DMEM；優(yōu)選地，所述檢測(cè)優(yōu)選為免疫學(xué)檢測(cè)，并且更優(yōu)選為Westernblot或ELISA檢測(cè)。
2. 一種調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中 annenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，通過提高腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)而提高腫瘤細(xì) 胞對(duì)鉬類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3基因而提高細(xì)胞 中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)正義膜聯(lián)蛋白A3基因的質(zhì)粒來提高所述細(xì) 胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，通過減少和/或抑制腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)而 降低腫瘤細(xì)胞對(duì)鉬類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3的反 義核酸和/或特異于膜聯(lián)蛋白A3的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更 優(yōu)選地，通過使用表達(dá)反義膜聯(lián)蛋白A3的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體來降低細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白 A3的含量。
5.一種評(píng)估腫瘤患者對(duì)鉬類化療藥物耐藥性的方法，包括如下步驟1)檢測(cè)患者體液樣品中膜聯(lián)蛋白A3水平；2)若步驟1)中的膜聯(lián)蛋白A3水平高于1.34ng/ml，判斷腫瘤患者對(duì)鉬類化療藥物耐藥；其中，優(yōu)選地，所述體液為血清；優(yōu)選地，步驟1)中的檢測(cè)為ELISA檢測(cè)。
6.一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉬的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì)胞中 annenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
7.一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中DNA與鉬結(jié)合的方法，所述方法包括改變腫 瘤細(xì)胞中annenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
8.一種調(diào)節(jié)鉬類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù)量的方法，所述方法包括改變腫瘤細(xì) 胞中annenxin A3表達(dá)水平的步驟，其中，優(yōu)選地，所述鉬類化療藥物是順鉬；優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法通過提高腫瘤細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋 白A3表達(dá)實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3基因而提高細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白 A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過使用表達(dá)正義膜聯(lián)蛋白A3基因的質(zhì)粒來提高所述細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋 白A3的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法通過減少和/或抑制腫瘤細(xì) 胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地，通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)膜聯(lián)蛋白A3的反義核酸和/ 或特異于膜聯(lián)蛋白A3的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)，更優(yōu)選地，通過 使用表達(dá)反義膜聯(lián)蛋白A3的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體來降低細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白A3的含量。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及化療藥物耐藥性領(lǐng)域，具體地，涉及如下方面一種檢測(cè)鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基上清中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)水平的方法、一種調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A3外泌量的方法、一種評(píng)估腫瘤患者對(duì)鉑類化療藥物耐藥性的方法、一種調(diào)節(jié)鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞釋放鉑的方法、一種調(diào)節(jié)鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中DNA與鉑結(jié)合的方法、以及一種調(diào)節(jié)鉑類化療藥物耐藥腫瘤細(xì)胞中囊泡數(shù)量的方法。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101893630SQ201010121278
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者尹婕, 潘凌亞, 閆雪冬 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院