專(zhuān)利名稱(chēng)：花粉輻射誘變創(chuàng)制梨s基因純合體新種質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質(zhì)的方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
梨是我國(guó)乃至世界主要水果之一，我國(guó)現(xiàn)有栽培面積108. 74萬(wàn)公頃(2007年中 國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒的數(shù)據(jù))，是典型的配子體型自交不親和性果樹(shù)，絕大多數(shù)梨品種自花授粉不結(jié) 實(shí)，生產(chǎn)上必須合理配置授粉樹(shù)才能保證坐果，正因?yàn)槿绱?，梨屬植物中目前尚沒(méi)有基因純 合的品種(個(gè)體)。此外，在梨屬植物中還存在品種間雜交授粉不親和的現(xiàn)象，因而田間配 置授粉品種存在一定的盲目性。迄今的研究已經(jīng)表明，梨自花授粉不結(jié)實(shí)以及品種間雜交 授粉不結(jié)實(shí)是受S基因控制的，表現(xiàn)為當(dāng)花粉的1個(gè)S基因與花柱中兩個(gè)S基因之一相同 時(shí)，它們之間相互授粉就不能結(jié)實(shí)，即花粉的自花授粉不結(jié)實(shí)的表現(xiàn)型是由花粉(配子體， Gametophyte)自身的S基因型決定。因此，弄清梨花粉S基因與S基因及其產(chǎn)物的特異性 識(shí)別功能，對(duì)于研究梨自花授粉不親和性機(jī)理具有實(shí)質(zhì)性意義。但是，梨品種存在兩個(gè)不同 的S基因位點(diǎn)，即存在兩個(gè)花粉S基因和兩個(gè)花柱S基因，這種異源二倍體基因型在研究梨 花粉特異性識(shí)別功能和梨花柱S糖蛋白特異識(shí)別功能時(shí)會(huì)存在相互間的干擾，無(wú)法弄清是 哪個(gè)基因的作用。創(chuàng)制梨S基因純合體種質(zhì)是深入開(kāi)展相關(guān)研究的前提條件，也為梨基因 組學(xué)研究與特異性狀基因的分析等提供了基本保障。另外，在倍性育種方面，梨S基因純合 體的創(chuàng)制也為本項(xiàng)工作的順利開(kāi)展奠定基礎(chǔ)，人們可以根據(jù)自身研究的需要，自行創(chuàng)制組 合所需要的S基因植株，這些材料不僅豐富了育種資源，還為以后培育出優(yōu)良的新品種創(chuàng) 造了條件?？傊?，創(chuàng)制梨S基因純合體不僅有著良好的理論價(jià)值，而且還有著廣闊的應(yīng)用前 景，為完善自花授粉不結(jié)實(shí)性理論體系提供了重要的試材。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)要求本發(fā)明的目的是提供了一種快速創(chuàng)制梨S基因純合體新種質(zhì)的方法。通過(guò)對(duì)花 粉實(shí)施誘變后利用其進(jìn)行自花授粉的方法，達(dá)到有效克服梨自花授粉不結(jié)實(shí)，從而獲得了 自交的后代，從后代中篩選出S基因純合體的植株，并建立了快速鑒定梨S基因純合體新種 質(zhì)的技術(shù)體系，為梨倍性育種、花粉與雌蕊的相互識(shí)別的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、S基因時(shí)空表達(dá)特 性及其蛋白產(chǎn)物的功能驗(yàn)證等方面的研究提供了很好的試材。技術(shù)方案花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質(zhì)的方法，其特征在于將采集好的‘黃花’、‘豐水’梨花粉用Co6tlY射線進(jìn)行輻射處理，輻射劑量40Gy，輻 射時(shí)間15min，各重復(fù)2次，處理當(dāng)日即對(duì)去雄的‘黃花’、‘豐水’進(jìn)行人工自花授粉，套上硫 酸紙袋，授粉后25d調(diào)查花序坐果率，每花序留1 2個(gè)果，種子成熟后采果并取出種子，育 苗；
根據(jù)梨S-RNase基因的保守序列，用Primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)正反向通用引物PF 5' -GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3‘PR 5' -CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3‘?dāng)U增兩自花授粉后代株系的基因組DNA，檢測(cè)梨S-RNase基因的擴(kuò)增技術(shù)體系反應(yīng)體系總體積為25μ L :10XPCR Buffer 2. 5 μ L 3. OmM MgCl2,0. 2mM dNTP, 各引物0. 1 μ Μ, 20-50ng模板，Taq酶1. OU ；通用引物PCR所用程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min, 94°C 15s, 48°C 30s, 72°C 3min, 10 個(gè)循環(huán)后，94°C變性 15S，48°C退火 30S，72°C 3. 5min，25 個(gè)循環(huán)后72°C延伸7min ；在‘黃花’花粉誘變自交后代的株系中，若只能擴(kuò)增出一條S2-RNase的1347bp帶 型，則說(shuō)明該株系為S2S2的純合體，若只能擴(kuò)增出一條S1-RNase的367bp帶型，則說(shuō)明該株 系為S1S1的純合體；在‘豐水’花粉誘變自交后代的株系中，均可擴(kuò)增出一條384bp的擴(kuò)增片段，用 AlwNI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，AlwNI酶切技術(shù)體系為:15μ 1反應(yīng)體系中，IOXBuffer R 1. 5 μ 1， Cail 0. 5 μ 1，PCR產(chǎn)物7. 5 μ 1，ddH205. 5 μ 1，酶切反應(yīng)條件37°C環(huán)境下反應(yīng)12h 14h， 若酶切后帶型為121bp和263bp兩條帶型，則對(duì)應(yīng)該株系為S5S5的純合體；若酶切后依然是 一條384bp的帶型，則說(shuō)明該株系為S3S3的純合體，從而獲得純合的S基因種質(zhì)。有益效果本發(fā)明所提供的花粉誘變自花授粉創(chuàng)制梨S基因純合體種質(zhì)的方法，具有以下優(yōu)占.
^ \\\ ·(1)本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，分子標(biāo)記鑒定方法準(zhǔn)確快速。梨為典型的配子體型自交不 親和性植物，自花授粉通常不結(jié)實(shí)，故很難得到S基因純合的植株。通過(guò)花粉的輻射誘變， 讓自交不親和性發(fā)生紊亂，以便讓自花花粉能順利通過(guò)花柱到達(dá)子房完成受精，從而得到S 基因純合的植株。本發(fā)明花粉處理方法簡(jiǎn)單，所用到的標(biāo)記鑒定只涉及基因組DNA的PCR 擴(kuò)增，和簡(jiǎn)單的酶切反應(yīng)，可以在幼苗期進(jìn)行，不受環(huán)境條件的影響，并可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行 大量樣品的檢測(cè)，節(jié)約生產(chǎn)成本。(2)本發(fā)明采用Co6tlY射線進(jìn)行輻射處理定向誘變，試驗(yàn)證明，重復(fù)性好。創(chuàng)制出 的S基因純合體種質(zhì)對(duì)今后梨倍性育種、梨花粉特異性識(shí)別功能的驗(yàn)證和梨花柱S糖蛋白 特異性功能等方面的研究都提供了優(yōu)良的試材，并可用于指導(dǎo)田間授粉，具有良好的理論 研究?jī)r(jià)值和實(shí)際應(yīng)用前景。從29株黃花誘變輻射自交后代中篩選出S1基因純合體植株7 株、S2基因純合體植株4株。從14株豐水誘變輻射自花授粉后代中篩選出S3基因純合體 植株3株、S5基因純合體植株2株。(3)本發(fā)明所運(yùn)用的分子標(biāo)記檢測(cè)準(zhǔn)確性高。該標(biāo)記與控制花粉自花不結(jié)實(shí)基因 的遺傳距離為0，沒(méi)有遺傳重組，檢測(cè)的準(zhǔn)確性為100%。
四

圖1 ‘黃花’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳；圖2 ‘豐水’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電 泳；
A ‘豐水’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳；B ‘豐水’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴(kuò)增產(chǎn)物AlwNI酶切產(chǎn)物瓊脂糖電 泳；C ‘豐水’輻射自花授粉后代的S-RNase基因擴(kuò)增產(chǎn)物Eco0109I酶切產(chǎn)物瓊脂糖 電泳；H 黃花；1 29 : ‘黃花’花粉輻射誘變自花授粉的29株后代；
F 豐水；1 14 : ‘豐水’花粉輻射誘變自花授粉的14株后代；
五具體實(shí)施例方式(一 )實(shí)驗(yàn)方法1、供試品種‘黃花，(HuanghuhS1S2)和‘豐水，(Hosui，S3S5)均為生產(chǎn)上主要栽培 品種(中國(guó)梨在線，http //www. pear. org. cn/)。2、選取品種長(zhǎng)勢(shì)為5-6年生樹(shù)，采集各品種幼嫩葉片，保存液氮中備用。采集 開(kāi)花前Id或當(dāng)天花蕾，取出花藥，置于硫酸紙上，于干燥處自然散粉后裝入密閉瓶?jī)?nèi)，貯 于-20°C冰柜內(nèi)備用。將采集好的‘黃花’、‘豐水’花粉用Co6tlY射線進(jìn)行輻射處理，輻射劑量40Gy，輻射 時(shí)間15min，各重復(fù)2次。處理當(dāng)日即對(duì)去雄的‘黃花’、‘豐水’進(jìn)行自花授粉，各授100朵 花序，再套上硫酸紙袋。授粉后25d調(diào)查花序坐果率，每花序留1 2個(gè)果，種子成熟后采 果并取出種子，育苗。3、CTAB法(張妤艷，黃紹西，張紹鈴，等.京白梨等品種S基因型鑒定及新基因 S28、S3(I的核苷酸序列分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33 (3) 496-500)提取各后代株系幼葉的基 因組DNA。4、禾Ij用設(shè)計(jì)的梨雌蕊S基因(S-RNase)通用引物 PF(5' -GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3‘ )PR(5' -CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3‘)對(duì)各自交 后代株系DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μ L 10 X PCR Buffer 2. 5 μ L 3. OmM MgCl2,0. 2mM dNTP，各 引物 0. 1 μ M，20_50ng 模板，Taq 酶 1. OU ；通用引物PCR所用程序?yàn)?94°C 預(yù)變性 2min，94°C 15s，48°C 30s, 72 °C 3min，10 個(gè)循環(huán)后，94 °C變性155，481退火305，721 3. 5min，25個(gè)循環(huán)后72°C延伸7min ；應(yīng)用 PTC-200擴(kuò)增儀(BIO-RAD)進(jìn)行擴(kuò)增。5、反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μ 1，用1. 5%的瓊脂糖凝膠在80V電壓條件下電泳45 分鐘，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。EB染色，在紫外燈下觀測(cè)。6、利用 AlwNI 內(nèi)切酶(酶切位點(diǎn)5，... CAGNNN J, CTG... 3，，3，... GTC NNNGAC— 5，)和 Eco0109I 內(nèi)切酶(酶切位點(diǎn)5，...PuG J, GNCCPy... 3，，3，-PyCCNG GPu." 5，) 酶切‘豐水’誘變輻射自花授粉后代的PCR產(chǎn)物反應(yīng)體系為15μ 1 反應(yīng)體系中，IOXBuffer R 1. 5μ 1, Mbol 0. 5 μ 1，PCR 產(chǎn)物 7. 5 μ 1，ddH205. 5 μ 1。酶切反應(yīng)條件37°C環(huán)境下反應(yīng)12h 14h。7、取7 μ 1酶切產(chǎn)物在1. 5%的瓊脂糖凝膠在80V電壓條件下電泳45分鐘，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)酶切譜帶。( 二)結(jié)果與分析如圖1所示‘黃花’誘變輻射自花授粉的后代株系表現(xiàn)出三種不同的S-RNase帶 型一種只擴(kuò)增出一條S2-RNase的1347bp帶型，另一種是只擴(kuò)增出一條S1-RNase的367bp 帶型，還有一種是兩種兼有的帶型。根據(jù)基因的分離規(guī)律，二倍體的黃花基因型為S1S2，其 自交后代應(yīng)該具有三種不同的基因型，即S1SpS1S2A2Sy故根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物帶型可以確定，若 只能擴(kuò)增出一條S2-RNase的1347bp帶型，則說(shuō)明該株系為S2S2的純合體，若只能擴(kuò)增出一 條S1-RNase的367bp帶型，則說(shuō)明該株系為S1S1的純合體。故從29株黃花誘變輻射自交 后代中篩選出S1基因純合體植株7株、S2基因純合體植株4株。如圖2A所示，豐水花粉誘變自花授粉的后代均能擴(kuò)增出一條384bp的帶型。根據(jù) AlwNI特異酶切結(jié)果可以確定(圖2B)，酶切后帶型為121bp和263bp兩條帶型，則該株系為 S5S5的純合體；酶切后依然是一條384bp的帶型，則說(shuō)明該株系為S3S3的純合體。Eco0109I 內(nèi)切酶均可將14株后代切出118bp和266bp兩條帶型(圖2C)，故可確認(rèn)‘豐水’自花授粉的后代中確實(shí)只存在S3-RNase或S5-RNase基因型，符合基因的分 離規(guī)律。故從14株豐水誘變輻射自花授粉后代中篩選出S3基因純合體植株3株、S5基因 純合體植株2株。最終，共從43株自花授粉后代中篩選鑒定出S1基因純合體植株7株，S2基因純合 體植株4株，S3基因純合體植株3株，S5基因純合體植株2株。
權(quán)利要求
花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質(zhì)的方法，其特征在于將采集好的‘黃花’、‘豐水’梨花粉用Co60γ射線進(jìn)行輻射處理，輻射劑量40Gy，輻射時(shí)間15min，各重復(fù)2次，處理當(dāng)日即對(duì)去雄的‘黃花’、‘豐水’進(jìn)行人工自花授粉，套上硫酸紙袋，授粉后25d調(diào)查花序坐果率，每花序留1～2個(gè)果，種子成熟后采果并取出種子，育苗；根據(jù)梨S-RNase基因的保守序列，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)正反向通用引物PF 5′-GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′PR 5′-CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3′擴(kuò)增兩自花授粉后代株系的基因組DNA，檢測(cè)梨S-RNase基因的擴(kuò)增技術(shù)體系反應(yīng)體系總體積為25μL10×PCR Buffer 2.5μL 3.0mM MgCl2，0.2mM dNTP，各引物0.1μM，20-50ng模板，Taq酶1.0U；通用引物PCR所用程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min，94℃15s，48℃30s，72℃3min，10個(gè)循環(huán)后，94℃變性15S，48℃退火30S，72℃3.5min，25個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min；在‘黃花’花粉誘變自交后代的株系中，若只能擴(kuò)增出一條S2-RNase的1347bp帶型，則說(shuō)明該株系為S2S2的純合體，若只能擴(kuò)增出一條S1-RNase的367bp帶型，則說(shuō)明該株系為S1S1的純合體；在‘豐水’花粉誘變自交后代的株系中，均可擴(kuò)增出一條384bp的擴(kuò)增片段，用AlwNI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，AlwNI酶切技術(shù)體系為15μl反應(yīng)體系中，10×Buffer R 1.5μl，Cail 0.5μl，PCR產(chǎn)物7.5μl，ddH2O5.5μl，酶切反應(yīng)條件37℃環(huán)境下反應(yīng)12h～14h；若酶切后帶型為121bp和263bp兩條帶型，則對(duì)應(yīng)該株系為S5S5的純合體；若酶切后依然是一條384bp的帶型，則說(shuō)明該株系為S3S3的純合體，從而獲得純合的S基因種質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及花粉輻射誘變創(chuàng)制梨S基因純合體新種質(zhì)的方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。通過(guò)Co60γ40Gy誘變劑量輻射‘黃花’和‘豐水’梨花粉，再進(jìn)行人工自花授粉，共從自交后代株系篩選鑒定出S1基因純合體植株7株、S2基因純合體植株4株、S3基因純合體植株3株、S5基因純合體植株2株。這些S基因純合體的植株為今后為梨倍性育種、花粉與雌蕊相互識(shí)別的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、S基因時(shí)空表達(dá)特性及其蛋白產(chǎn)物的功能驗(yàn)證等方面的研究提供了很好的試材，并可在田間授粉上起指導(dǎo)作用，具有良好的理論研究?jī)r(jià)值和生產(chǎn)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101836582SQ201010121729
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張紹鈴, 陶書(shū)田, 齊開(kāi)杰, 齊永杰 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)