專利名稱：一種產(chǎn)白藜蘆醇細胞的制備方法及其專用懸浮培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種產(chǎn)白藜蘆醇細胞的制備方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，化學(xué)名為3，5，4，-三羥基1，2_ 二苯乙烯(3，5， 4' -trihydroxystilbene)，是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物。研究發(fā)現(xiàn)，Res 可有效抑制血小板的凝集及心血管的異常收縮，降低血脂水平從而起到預(yù)防心血管疾病的作用；Res因其抗誘變，抑制與癌癥相關(guān)的酶活性等作用被視為抑制和治療癌癥的有效藥物之一；此外，Res在抗氧化，消除人體自由基，抗病原微生物以及預(yù)防老年癡呆癥等方面也發(fā)揮重要作用，并可廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領(lǐng)域。目前世界上有十余個國家和地區(qū)在開發(fā)Res原料及其制劑，全球的年生產(chǎn)能力約為50_60t，而市場的年需求量可達100t。而且，隨著Res在醫(yī)藥、保健品、化妝品及食品添加劑等領(lǐng)域的進一步的開發(fā)和應(yīng)用，市場需求量會迅速擴大。因此，對Res的研究開發(fā)既具有可觀的經(jīng)濟前景，又具有良好的社會效益。人類攝取Res目前主要有兩種途徑，直接食用葡萄和葡萄加工品，二是服用以葡萄、落花生以及中藥材植物為原料制取的Res藥片及相關(guān)保健品。葡萄是人類栽培面積最大的果樹樹種之一，種質(zhì)資源極其豐富，且本身Res含量也相對較高，因此，葡萄及葡萄加工品被認(rèn)為是人類食品中Res的最主要來源。盡管葡萄種質(zhì)資源豐富，但自然條件下不同葡萄種質(zhì)間Res含量差異很大，僅有極少數(shù)雜交種含量極高。除此之外，同一葡萄屬植物的不同器官間Res含量差異較大，在自然條件下，葡萄果皮、種子和果穗軸都含有較高的Res， 葉片中含量較低，而枝條、芽、花、果肉和果汁中的含量極少。目前，僅僅以大面積栽培品種葡萄果實為原料，Res人工提取的效率低，成本將會很高，而采用含量極高的品種為原料進行提取，產(chǎn)量低且受到氣候條件的嚴(yán)格限制，而以提取Res為目標(biāo)栽培自然條件下高Res含量的種質(zhì)，其經(jīng)濟效益也受到很大的限制。隨著植物細胞培養(yǎng)工程技術(shù)的發(fā)展，人們選擇不同的培養(yǎng)方式，改變影響細胞培養(yǎng)的物理化學(xué)因素等，可以大大加快植物細胞的生長，提高目的物質(zhì)的含量，并且不受地理、季節(jié)和氣候條件的限制，節(jié)省野生植物和土地資源，具有生長周期短，經(jīng)濟效益顯著等優(yōu)點。迄今為止，人們已經(jīng)對1000多種植物進行了細胞培養(yǎng)方面的研究，利用該技術(shù)至少能夠生產(chǎn)上百種次生代謝物質(zhì)，而能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的只有人參、黃連、長春花、紫草等少數(shù)幾種。目前關(guān)于葡萄細胞培養(yǎng)的研究，主要集中在細胞培養(yǎng)篩選突變體、原生質(zhì)體培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)化等方面，由于技術(shù)上的原因，僅有花色素可以利用葡萄細胞培養(yǎng)的方法進行小規(guī)模生產(chǎn)，而圍繞Res大量生產(chǎn)展開的工作僅在實驗水平。盡管利用葡萄細胞培養(yǎng)研究Res 已有報道，但多數(shù)學(xué)者采用轉(zhuǎn)基因的方法提高細胞中Res的含量，但這種通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到的Res能否正常用于食品及醫(yī)藥工業(yè)一直飽受爭議。所以，建立一種成熟，純天然的葡萄高產(chǎn)細胞體系是解決大量生產(chǎn)Res和食品安全之間矛盾有著重要的意義。 目前為止，國內(nèi)外關(guān)于從自然條件下高產(chǎn)Res葡萄基因型及組織器官來著手進行
高產(chǎn)Res細胞生產(chǎn)的研究尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種懸浮培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的懸浮培養(yǎng)基，是在&基本培養(yǎng)液或NN1969培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的培養(yǎng)基酸水解酪蛋白、NAA、BA和碳源；所述懸浮培養(yǎng)基中，酸水解酪蛋白的終濃度為0. 015-0. 030g/100ml、NAA的終濃度為0. 01-1. 00mg/L、BA的終濃度為0. 05-1. 00mg/L以及碳源的終濃度是2_4g/100ml ；所述&基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述NN1969培養(yǎng)液的溶質(zhì)是水、溶質(zhì)如表1所示。表1. &和NN1969基本培養(yǎng)液的溶質(zhì)
成分B5NN1969KNO32500950NH4NO3-720MgS04-7H20250185KH2P04-68CaCl2.2H20150166KCl--Ca3PO4--NaH2P04-2H20150-MnSO4-H2O1025ZnS04.7H20210
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)白藜蘆醇細胞的懸浮培養(yǎng)基，它是在&基本培養(yǎng)液或NN1969培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的培養(yǎng)基酸水解酪蛋白、NAA、BA和碳源；所述懸浮培養(yǎng)基中，酸水解酪蛋白的終濃度為0. 015-0. 030g/100ml、NAA的終濃度為 0. 01-1. 00mg/L、BA的終濃度為0. 05-1. 00mg/L以及碳源的終濃度是2_4g/100ml ；所述4基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述NN1969培養(yǎng)液的溶質(zhì)是水、溶質(zhì)如表1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述碳源是蔗糖或葡萄糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述懸浮培養(yǎng)基中，酸水解酪蛋白、 NAA、BA和碳源的終濃度是如下1)或2)或3):1)酸水解酪蛋白的終濃度為0.015-0. 025g/100ml、NAA的終濃度為0. 01-0. lmg/L、BA 的終濃度為0. 05-0. lmg/L以及碳源的終濃度是2-4g/100ml ；2)酸水解酪蛋白的終濃度為0.025-0. 03g/100ml、NAA的終濃度為0. 1-1. 00mg/L、BA 的終濃度為0. 1-1. 0mg/L以及碳源的終濃度是2-4g/100ml ；3)酸水解酪蛋白的終濃度為0.025g/100ml、NAA的終濃度為0. lmg/L、BA的終濃度為 0. lmg/L以及碳源是終濃度是3g/100ml。
4.一種制備產(chǎn)白藜蘆醇細胞的方法，包括以下步驟1)將葡萄外植體置于愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得愈傷組織；3)將步驟幻中獲得的愈傷組織在權(quán)利要求1-3任一所述的懸浮培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，得到含有愈傷組織的培養(yǎng)液；4)往步驟幻中的含有愈傷組織的培養(yǎng)液中加入甲基茉莉酸進行誘導(dǎo)處理，得到產(chǎn)白藜蘆醇細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述外植體是葉片、種子或果皮；所述外植體優(yōu)選是葉片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述葉片選自‘植168’、‘貝達’、‘酶露輒’ 或‘京秀’品種；所述葉片優(yōu)選來自‘植168’或‘貝達’品種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在&基本培養(yǎng)液或NN1969培養(yǎng)液中添加蔗糖、2，4-D、BA和凝膠劑得到的培養(yǎng)基；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖的終濃度為3g/100ml、2，4-D的終濃度為0. 05-2. 00mg/L、BA的終濃度為 0. 05-1. 00mg/L ；所述&基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述NN1969培養(yǎng)液的溶質(zhì)是水、溶質(zhì)如表1所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一所述的方法，其特征在于所述增殖培養(yǎng)基是在&基本培養(yǎng)液或NN1969培養(yǎng)液中添加蔗糖、酸水解酪蛋白、2，4-D、KT、BA和凝膠劑得到的培養(yǎng)基；所述增殖培養(yǎng)基中蔗糖的終濃度為3g/100ml、酸水解酪蛋白的終濃度為 0. 015g/100ml-0. 030g/100ml、2，4-D 的終濃度為 0. 01-1. 00mg/L、KT 的終濃度為 0. 1-2. 00mg/L、BA 的終濃度為 0. 05-1. 00mg/L ；所述&基本培養(yǎng)液的溶劑是水、溶質(zhì)如表1所示；所述NN1969培養(yǎng)液的溶質(zhì)是水、溶質(zhì)如表1所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一所述的方法，其特征在于所述懸浮培養(yǎng)的條件是搖床轉(zhuǎn)速 110-130rmp，溫度25士2°C，培養(yǎng)周期是14天。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述加入甲基茉莉酸進行誘導(dǎo)處理是在所述懸浮培養(yǎng)的第7天進行；所述甲基茉莉酸的濃度是0-50 μ mol · L—1 (不包括0)，優(yōu)選是 0. 5-50 μ mol · L—1，更優(yōu)選是5. 0 μ mol · Γ1 ；所述誘導(dǎo)處理時間為2天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)白藜蘆醇細胞的制備方法及其專用懸浮培養(yǎng)基，本發(fā)明的專用懸浮培養(yǎng)基是在B5基本培養(yǎng)液或NN1969培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的培養(yǎng)基酸水解酪蛋白、NAA、KT、BA和碳源；其中酸水解酪蛋白的終濃度為0.015-0.030g/100ml、NAA的終濃度為0.01-1.00mg/L、KT的終濃度為0.1-2.00mg/L、BA的終濃度為0.05-1.00mg/L。本發(fā)明將外植體先誘導(dǎo)愈傷組織；再將愈傷組織轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；然后利用紫外線照射的誘導(dǎo)方法確定高產(chǎn)白藜蘆醇的葡萄基因型。然后再確定高產(chǎn)白藜蘆醇的器官類型。最后通過懸浮培養(yǎng)，大量擴繁細胞并誘導(dǎo)處理，最終獲得高產(chǎn)白藜蘆醇細胞。
文檔編號C12N5/04GK102191214SQ201010122050
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者劉 文, 劉春艷, 吳本紅, 李紹華, 段偉, 王立軍, 范培格 申請人:中國科學(xué)院植物研究所