專利名稱：水稻穎殼發(fā)育基因啟動子p-TRI1及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水稻穎殼發(fā)育基因啟動子P-TRIl及其應用。
背景技術：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是單子葉植物發(fā)育生物學研究較理想的模式植物。水稻花器官還是糧食賴以形成的基礎。對水稻花發(fā)育的研究已開始成為植物分 子遺傳學的一個新的焦點。近年來有關水稻花發(fā)育基因調(diào)控的研究已取得了長足的進展。通過對擬南芥和金魚草的同源異型基因突變體的研究，確定了雙子葉植物的ABC 模式，即四個輪環(huán)的花器官是由三類基因的互作控制，這三類基因分別稱為A、B、C類基因， 其中每類基因負責調(diào)控相鄰兩個輪環(huán)的花器官的形成。其中A類基因負責調(diào)控第一、第二 輪環(huán)，即花萼、花瓣的形成；B類基因負責調(diào)控第二、第三輪環(huán)，即花瓣、雄蕊的形成；C類基 因負責調(diào)控第三、第四輪環(huán)，即雄蕊、心皮的形成。通過對一些A、C類基因的突變體研究 表明，A、C兩類基因的作用是相互拮抗的(Coen ES andMeyerowitz EM. The war of the whorls :Genetic interactions controlling flowerdevelopment. Nature,1991,353 31-37 ；Theissen G,and Saedler H. Plant biology. Floral quartets. Nature, 2001,409 469-471.)。水稻的花發(fā)育研究是在雙子葉模式植物擬南芥和金魚草的基礎上發(fā)展起來的。單 子葉植物的花和花分生組織的許多特征明顯不同于雙子葉植物。在單子葉植物中，禾本 科植物的花最具多樣性，其中水稻的花器官在禾本科植物中更具代表性。水稻花的單位 是小穗，小穗由兩個穎片和一朵小花所構成，小花從內(nèi)向外依次由一個雌蕊，六枚雄蕊，兩 個漿片，一個內(nèi)稃和一個外稃構成。盡管在花器構成方面雙子葉植物和禾本科植物——7jC 稻具有很大差異，但其大致結構也可看成是由四個輪環(huán)組成。通過對一些已經(jīng)克隆的突 變基因，如 SPWl(Nagasawa N, Miyoshi M, Sano Y, Satoh H, HiranoH, Sakai H, Nagato, Y.SUPERffOMANl and DROOPING LEAF genes control floral organidentity in rice. Development,2003,130 :705_718), DL(Yamaguchi T, NagasawaN, Kawasaki S, Matsuoka, Nagato Y, Hirano HY. The YABBY gene DROOPING LEAFregulates carpel specification and midrib development in Oryza sativa.The PlantCell,2004,16 500-509)以 及其他水稻的 MADS-box 基因，如 0sMADS2 和 0sMADS4，0sMADS3 和 0sMADS58 (Bommert P, Satoh-Nagasawa N, Jackson D, and Hirano HY.Genetics and evolution of inflorescence and flower development in grasses. PlantCell Physiol.,2005,46 69-78 ；Yamaguchi T, Lee DY, Miyao A, Hirochika H, An G, and Hiranoa HY. Functional diversification of the two C-class MADS Boxgenes 0sMADS3 and 0sMADS58 in Oryza sativa. Plant Cell, 2006,18 =15-28.)的研究表明，B類和C類基因在調(diào)控水稻漿片，雄蕊 和心皮的發(fā)育三個輪環(huán)上是保守的。但是有關內(nèi)外穎的發(fā)育調(diào)控機制一直都比較模糊，也是最受爭議的。Yuan 等(YuanZ, Gao S，Xue DW, Luo D，Li LT, Ding SY, Yao X，Wilson ZA, Qian Q，ZhangDB. Retardedpaleal controls palea development and floral zygomorphy in rice. PlantPhysiol. , 2009,149 =235-244.)發(fā)現(xiàn)了一個內(nèi)穎發(fā)育異常的基因REP1。這個基因的 突變導致內(nèi)穎發(fā)育異常，并且在變異的內(nèi)穎中具有五個維管束組織，這一特質(zhì)與外穎相似。 基因的表達在起始階段也被限制在內(nèi)穎原基中，之后擴散到其他的組織中。研究者使用了 組成型啟動子進一步研究基因的功能。因而，對于內(nèi)外穎的發(fā)育的機理研究，特別是與內(nèi)外穎發(fā)育相關基因的研究就更少了。從突變體庫中發(fā)現(xiàn)新的花器發(fā)育的新基因及其啟動子不僅在水稻穎花發(fā)育機理研究 方面具有重要作用，在農(nóng)業(yè)領域具有廣闊的應用和市場前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻穎殼發(fā)育基因啟動子P-TRIl及其應用。本發(fā)明提供的水稻穎殼發(fā)育基因啟動子，其名稱為p-TRIl，來源于稻屬普通栽培 稻(0. sativa L.)93-11。本發(fā)明提供的DNA片段(啟動子)，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。上述嚴格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下 雜交并洗膜。序列表中序列1所示的DNA序列由2229個核苷酸組成，含有作用元件E2F、AP-2 和T-Ag，這些轉(zhuǎn)錄因子與細胞的分裂增殖相關。利用該基因啟動子片段構建的誘導性表達 載體可以在植物細胞增殖區(qū)域特別是維管束區(qū)強烈地誘導目標基因的表達。含有所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的 保護范圍。用于構建含有所述啟動子的植物表達載體的出發(fā)載體可為pCAMBIA1300、pBI121、 pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1381 或 pCAMBIA1301_UbiN 等。所述重組載體可為在 pCambial381的多克隆位點插入DNA片段得到重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為將序列1 所示DNA片段插入pCambial381的EcoRI和SalI酶切識別位點間得到的重組質(zhì)粒。擴增所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述DNA片段可應用于啟動目的基因表達。所述目的基因表達可為組織特異表達 和/或時間特異性表達。所述組織特異表達具體可為穎殼特異性表達。水稻穎殼上具有較 高的表達活性，特別是穎殼的維管束處達到最高，而在其他組織如劍葉、枝梗和節(jié)間中的表 達量極低，甚至不表達。所述時間特異性表達為花序發(fā)育期特異性表達。水稻花序發(fā)育的 各個時期(花序軸長度0. 2-6. 0cm)都有強烈表達。所述DNA片段可應用于培育轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)基因植物可為轉(zhuǎn)基因水稻，如中 花17。所述應用中，可將所述重組載體導入水稻品種中花17，得到轉(zhuǎn)基因水稻；所述轉(zhuǎn)基因 水稻中，由所述DNA片段啟動GUS基因的表達。本發(fā)明啟動子的發(fā)現(xiàn)和其功能的闡明，將對水稻花器發(fā)育機理特別是穎殼發(fā)育機制的研究，具有特定粒型的水稻品種的選育具有重要的理論及實際意義。該啟動子對于水稻穎殼發(fā)育分子機制的研究，以及水稻粒型分子育種具有重要的理論及實際意義。本發(fā)明 在農(nóng)業(yè)領域具有廣闊的應用和市場前景。


圖1為93-11花序各個發(fā)育時期及不同器官中基因的表達分析，其中9InS 93-11的花序軸長度< 0. 5cm，9InL 花序軸長度在0. 5-1. 5cm，9InLl 9311花序軸長度在
1.5-3cm，9InL2 花序軸長度在3_4cm，9InL3 花序軸長度在4_5cm，9InL4 花序軸長度在5-6cm的發(fā)育成型的幼嫩穎殼(長度< 0. 5cm),9LE 成型綠色外穎，9PE 成型綠色內(nèi)穎， 9ST 雄蕊，9PI 雌蕊和子房，9BRA 枝梗，9LEAF 劍葉，9N0DE 穗下節(jié)，9CULM 穗下節(jié)間。圖2為以93-11基因組DNA為模板在引物7E⑶S引導下的PCR擴增產(chǎn)物；1為 MarkerIII (所用Marker為天根生化科技有限公司的Markerlll，貨號MD102_01) ；2為PCR 產(chǎn)物。圖3為P-TRIl轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S組織染色結果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責任 公司完成。93-11 國家種質(zhì)資源庫。中花17 國家種質(zhì)資源庫。pCambial381 =GenBank 號AF234302o實施例1、水稻穎殼發(fā)育基因啟動子P-TRIl的發(fā)現(xiàn)一、水稻穎殼發(fā)育基因TRIl的發(fā)現(xiàn)將93-11經(jīng)EMS(甲基磺酸乙脂)處理并經(jīng)過多代自交和性狀觀察后，形成基因 型純和的突變體系。通過對這些突變體系的篩選發(fā)現(xiàn)了一個穎殼發(fā)育異常的突變體，這個 突變體的具體表現(xiàn)是突變體穎殼比正常的野生型穎殼寬度變窄，即9311的穎殼寬度為
2.84士0. 08mm，突變體的穎殼寬度為2.33士0. 11mm。但二者的穎殼在長度上無差異。最明 顯的特征是在其尖端展現(xiàn)出三角形狀的變異，故命名為tril。將tril分別與93-11，特青，桂朝2號，中花17，C418等常規(guī)品種進行雜交，雜交 F1代表現(xiàn)野生型穎殼特征，從而可以推測出控制這個突變性狀的基因是隱身的。雜交5經(jīng) 過自交后產(chǎn)生F2后代中隱性個體，即表型與tril相同的單株與野生表型的單株比例接近 3 1 (X2xc < X2xo.05jl = 3. 84)。由此可以得出水稻三角穎殼性狀由一個隱性單基因控制， 這個基因被命名為TRIl。首先用tril與桂朝2號雜交的小F2,將基因TRIl初略定位在第二染色體的SSR 標記RM213附近。之后，用tril與C418回交F2中的隱形個體將基因TRIl初步定位在兩 個標記RM8048和RM3850(RM213附近)之間。這之后，應用四個標記之間的在兩個親本之 間具有差異的SSR標記(RM3774、RM14165、RM3248、RM1255)以及一個CAPs標記(Cl)和兩個測序標記(C2，C3)最終將基因定位在一個CAPs標記(Cl)和一個測序標記之間，中間的 物理距離約60kb。分別上述獲得的區(qū)域，設計引物對HXl (HX1F/HX1R)，擴增tril和93_11基因組 DNA，尋找EMS誘變產(chǎn)生的基因序列方面的差異。PCR擴增的反應體系為水稻基因組DNA模 板 20ng，Taq Plus DNA 聚合酶 0. 5U，2. 0 μ 1 10 XPCR 緩沖液(IOOmM Tris 'ClpH9. 0,500mM KCl, 15mM Mg2+, 1% Triton X-100)，100 μ M dNTPs，正向引物 0. 2 μ M，反向引物 0. 2 μ M，用 ddH20補充反應體系至20 μ 1。PCR反應條件為先94°C4min ；隨后94°C 45sec，58°C 45sec， 72°C 2min，共31個循環(huán)；再72°C IOmin0通過濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物 中是否有目的條帶，檢測到明亮單一的目的條帶后再送奧科測序(測序引物為HX1R)。測序 結果進行比對，發(fā)現(xiàn)與93-11相比，tril中一個C堿基缺失(gagacgca——gagacga)，從而 導致編碼序列發(fā)生移碼。HXlF :5，-gtactggcaaagcaagatgg-3，；HXlR :5，_atcgggaagcagattcatcc_3，。通過轉(zhuǎn)RNAi載體驗證了突變體性狀是由于基因TRIl的功能缺失引起的。二、水稻穎殼發(fā)育基因啟動子P-TRIl的發(fā)現(xiàn)首先研究TRIl在水稻各個發(fā)育時期和不同的組織中的表達情況。通過對不同組 織的RNA提取和之后的實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)TRIl在啟動子的牽引下，具有時 空表達差異。在水稻小穗發(fā)育的各個時期均有較高水平的轉(zhuǎn)錄本積累，在水稻內(nèi)、外穎、雌 蕊和穗下節(jié)中均有表達，但在劍葉和節(jié)間中表達量很低，在雄蕊的花藥中基本不表達(圖 1)。利用primerf引物設計軟件設計引物，在引物兩端引入限制性內(nèi)切酶識別位點及 保護堿基，引物序列如下7EGUSF :5，-aRcGAATTCctRccacaaRatatRttcRR-3’ 7EGUSR :5，-a caei￡eA￡gcaacctgaatcacaagaagc-3’;7EGUSF中，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoRI識別 位點，其前面的age為保護堿基；7EGUSR中，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SalI的識別位 點，其前面的aca為保護堿基。以93-11的基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應程序為先94°C 5min ；然 后 94°C 30sec，58°C 45sec，68°C 2min30sec，共 30 個循環(huán)；最后 68°C lOmin，獲得目的產(chǎn)物。 反應結束后，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示。將PCR產(chǎn)物 進行測序，測序結果表明，PCR產(chǎn)物具有序列表的序列1所示的DNA片段，將序列表的序列1 所示的DNA片段命名為p-TRIl(水稻穎殼發(fā)育基因啟動子)。將序列1所示的DNA片段在promoter scan(http //www-bimas. cit. nih. gov/molbio/proscan/) r^WifyMfi, RM^t^^.^ 內(nèi)含有與細胞的分裂增殖相關的轉(zhuǎn)錄因子作用元件E2F、AP-2和T-Ag。實施例2、P-TRIl轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其鑒定一、P-TRIl植物表達載體的構建一、p-LTT7植物表達載體的構建
1、以93-11水稻的基因組DNA為模板，用特異性引物對T7EUS (T7EUSF/T7EUSR)，使 用東洋紡(Τ0Υ0Β0)生物公司的KODplus酶反應試劑盒進行PCR擴增，反應結束后，對PCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化2229bp的DNA片段(p_LTT7)(所用回收試劑盒為天根生化科技有限公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒，貨號DP204-02)。2、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI酶切步驟1回收的PCR產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sal I酶切植物表達載體pCambial381，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物與步驟3的載體骨架(5-10摩爾酶切產(chǎn)物1摩爾載體骨架)連接(16°C過夜)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO (北京拓英坊科技有限公司)感受態(tài)， 涂布具有卡那霉素抗性的LB平板，37°C培養(yǎng)14-16個小時，挑取白斑37°C搖菌后提取重組 質(zhì)粒。5、將重組質(zhì)粒進行測序，測序結果表明，得到了重組質(zhì)粒pCambia1381-pTRIl (在 pCambial381的EcoRI和SalI酶切位點之間插入序列表的序列1所示的DNA片段)。二、轉(zhuǎn)化水稻將pCambia1381-pTRIl用基因槍法轉(zhuǎn)化中花17的成熟胚愈傷組織，用含50mg/L 潮霉素的NB培養(yǎng)基進行2輪篩選，每輪篩選20-30天，經(jīng)預分化、分化得到陽性植株。將陽 性植株進行PCR鑒定，結果表明，得到了 Ttl代轉(zhuǎn)基因植株。將pCambial381用基因槍法轉(zhuǎn)化日本晴的成熟胚愈傷組織，用含50mg/L潮霉素的 NB培養(yǎng)基進行2輪篩選，每輪篩選20-30天，經(jīng)預分化、分化得到Ttl代轉(zhuǎn)空載體對照植株。三、轉(zhuǎn)基因水稻的組織表達特異性分析將Ttl代植株進行自交，得到Ttl代植株的種子(T1代)。將Ttl代植株的種子(轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)空載體對照植株)進行培養(yǎng)，對獲得的稻穗 進行GUS組織染色，結果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的GUS基因在水稻穎殼即內(nèi)外穎上具有較高的表 達活性，特別是穎殼的維管束處達到最高，而在其他組織如劍葉、枝梗和節(jié)間中的表達量極 低，甚至不表達(圖3)；轉(zhuǎn)空載體對照植株的各個發(fā)育時期的組織和器官均未染色成功，脫 色反應之后均為白色的。實施例2的實驗重復進行三次，都得到的同樣的結果。
權利要求
一種DNA片段，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
2.含有權利要求1所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
3.如權利要求2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pCambial381的多 克隆位點插入權利要求1所述DNA片段得到重組質(zhì)粒。
4.如權利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將序列1所示DNA片 段插入pCambial381的EcoRI和SalI酶切識別位點間得到的重組質(zhì)粒。
5.擴增權利要求1所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對。
6.權利要求1所述DNA片段在啟動目的基因表達中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述目的基因表達為組織特異表達和/或 時間特異性表達。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述組織特異表達為穎殼特異性表達，優(yōu)選 穎殼維管束特異性表達；所述時間特異性表達為花序發(fā)育期特異性表達。
9.權利要求1所述DNA片段在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因水稻，優(yōu)選中花 17 ；所述應用中，將權利要求4所述重組載體導入水稻品種中花17，得到轉(zhuǎn)基因水稻；所述 轉(zhuǎn)基因水稻中，由權利要求1所述DNA片段啟動GUS基因的表達。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻穎殼發(fā)育基因啟動子p-TRI1及其應用。本發(fā)明提供的啟動子來源于稻屬普通栽培稻(O.sativa L.)93-11，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。本發(fā)明啟動子的發(fā)現(xiàn)和其功能的闡明，將對水稻花器發(fā)育機理特別是穎殼發(fā)育機制的研究，具有特定粒型的水稻品種的選育具有重要的理論及實際意義。該啟動子對于水稻穎殼發(fā)育分子機制的研究，以及水稻粒型分子育種具有重要的理論及實際意義。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領域具有廣闊的應用和市場前景。
文檔編號C12N15/11GK101812451SQ20101012241
公開日2010年8月25日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權日2010年3月11日
發(fā)明者付永彩, 劉鳳霞, 孫傳清, 孫連軍, 才宏偉, 朱作峰, 李曉嬌, 謝道昕, 譚祿賓 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學