專利名稱：：鹿血清的提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種鹿血清的提純方法。
背景技術(shù)：
：鹿血自古以來視為珍品，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明它具有抗疲勞、抗衰老，增強免疫功能和治療貧血功能。然而，鹿血的特點之一是代謝廢物尿素的含量遠高于人的血液和其他動物血液。尿素是最早被認定的一種尿毒癥毒素，它在體內(nèi)的蓄積會引起一系列中毒癥狀，如疲乏、嘔吐、嗜睡、頭痛、皮膚瘙癢及出血等。尿素的毒性作用與其代謝產(chǎn)物氰酸鹽有關(guān)。氰酸鹽與蛋白質(zhì)作用后產(chǎn)生氨基甲酰衍生物，當其在血中的濃度升高時，可以抑制酶的活性。同時，細胞內(nèi)的氰酸鹽不易擴散至細胞外，長期蓄積于細胞內(nèi)導(dǎo)致高血糖、低體溫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受抑制的癥狀。在腸道中由于尿素的分解，產(chǎn)生氨而有腸道剌激癥狀，在調(diào)整飲食到低蛋白飲食時，腸道剌激癥狀即減輕，可以明顯看到這是減少尿素的緣故。尿素可抑制單胺氧化酶、黃嘌呤氧化酶、以及ADP對血小板第3因子的激活作用。并能使胍基琥珀酸產(chǎn)生增多，從而導(dǎo)致血小板功能異常和出血。尿素還可抑制NaK2Cl的協(xié)同轉(zhuǎn)運，降低氧和Hb的親和性，在轉(zhuǎn)錄水平抑制巨噬細胞誘導(dǎo)NO的合成。此外，尿素增高還會引起糖耐量降低。上述表明尿素對人體的危害遠超過"三聚氰胺"。鹿全血不加抗凝劑，在凝固后，離心得到鹿血清。鹿血的保健作用來自鹿血清，將全血改為血清，再除去鹿血清中的尿素，作為保健食品原料屬于去粗取精，有利于提高鹿血的功效。目前，還沒有發(fā)現(xiàn)去除鹿血清中尿素的文獻記載。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡單、提純效果好和收率高的鹿血清的提純方法。本發(fā)明鹿血清的提純方法包括以下幾個步驟a.處理凝膠將葡聚糖凝膠S印hadexG-25用蒸餾水充分膨脹后備用；b.裝柱用脫脂棉花堵在色譜柱的下端，將處理好的凝膠一次性緩慢倒入色譜柱中，打開色譜柱的活塞，讓凝膠自由沉降，同時用蒸餾水洗脫，凝膠沉降完畢，待水面高度下降至與凝膠表面基本一致時，關(guān)閉色譜柱活塞，準備加樣；c.加樣用移液槍吸取鹿血清，沿色譜柱環(huán)周壁加入，打開色譜柱活塞，待鹿血清高度下降至與凝膠表面基本一致時，關(guān)閉色譜柱活塞，準備洗脫；d.洗脫用吸管吸取配置好的O.9XNaCl洗脫劑溶液，控制流速為0.180.4ml/min，沿色譜柱環(huán)周壁加入，打開色譜柱活塞收集流出液；e.檢測用雙縮脲試劑檢測收集流出液樣品，樣品中加入雙縮脲試劑呈紫色，表明有蛋白洗脫下來，繼續(xù)收集流出液，樣品中加入雙縮脲試劑呈無色，表明沒有蛋白洗脫下來，停止收集。鹿血清蛋白濃度對尿素清除率有較大的影B向，而且，隨著蛋白濃度的增高，尿素清除率有降低的趨勢，本方法鹿血清蛋白濃度最好是7075g/L;在洗脫過程中，流速對尿素清除率影響較大，隨著流速的增加，尿素清除率呈下降趨勢，所以，為了有效除去尿素，應(yīng)該適當減慢流速，但是流速不宜過慢，否則影響生產(chǎn)效率，本方法優(yōu)化的方案是在洗脫過程中，控制流速為0.20.3ml/min。步驟e使用的雙縮脲試劑的配制方法是首先，稱定240.Og氫氧化鈉NaOH，加蒸餾水定容至1000ml，即得6mol/L氫氧化鈉NaOH;然后，稱定24g五水硫酸銅CuS04*5H20，810g酒石酸鉀鈉NaKC4H4064H20，810g氯化鈉NaCl，46g碘化鉀KI，57mol/L氫氧化鈉NaOH80120ml，加蒸餾水定容至1000ml，制得雙縮脲試劑。步驟e使用的雙縮脲試劑優(yōu)選的配制方法是首先，稱定240.0g氫氧化鈉NaOH，加蒸餾水定容至1000ml，即得6mol/L氫氧化鈉Na0H;然后，稱定3g五水硫酸銅CuS045H20，9g酒石酸鉀鈉NaKC4H4064H20，9g氯化鈉NaCl，5g碘化鉀KI，6mol/L氫氧化鈉Na0H100ml，加蒸餾水定容至1000ml，制得雙縮脲試劑。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明方法簡便、重復(fù)性好，工藝穩(wěn)定可靠，尿素清除率能達到76%以上，蛋白得率達到90%以上。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步說明。實施例l:a.鹿血清凍融處理將鹿血清放置于-20攝氏度冰箱中保存，待用時，將凍好的鹿血清放置于4攝氏度冰箱中解凍，然后取出即用；b.配制洗脫液稱定9gNaCl，溶解于1000ml的蒸餾水中，備用；c.配制雙縮脲試劑首先，稱定240.0g氫氧化鈉NaOH，加蒸餾水定容至1000ml，即得6mol/L氫氧化鈉Na0H;然后，稱定3.0g五水硫酸銅CuS04.5H20，9.0g酒石酸鉀鈉NaKC4H406*4H20，9.Og氯化鈉NaCl，5.Og碘化鉀KI，6mol/L氫氧化鈉NaOH100ml，加蒸餾水定容至lOOOml;d.處理凝膠取s印hadexG-25凝膠，規(guī)格是Medium,25g，加蒸餾水使其充分溶脹24小時；e.裝柱將上述溶脹好的凝膠填充于在柱長是120cm，柱直徑是2cm的色譜柱中；具體步驟如下(l)用一根細長的無銹并清洗后的鐵絲將一小團脫脂棉花堵在色譜柱的下端，防止填料漏液；(2)關(guān)閉色譜柱的活塞，將處理好的凝膠一次性緩慢倒入色譜柱中，注意防止氣泡產(chǎn)生，凝膠倒完畢后，抽出鐵絲；(3)打開色譜柱的活塞，讓凝膠自由沉降，同時用水洗脫；(4)凝膠沉降完畢后，檢查沒有填料漏液及色譜柱中沒有氣泡，待水面高度下降至與凝膠表面基本一致時，關(guān)閉色譜柱活塞，準備加樣；f.加樣用規(guī)格為100lOOOul的移液槍吸取解凍后蛋白濃度為72g/L的鹿血清2ml，沿環(huán)周壁加入；打開色譜柱活塞，待鹿血清高度下降至與凝膠表面基本一致時，關(guān)閉色譜柱活塞，準備加洗脫劑；g.洗脫用吸管吸取配置好的洗脫劑O.9XNaCl溶液，沿環(huán)周壁加入，控制流速為0.25ml/min，注意防止凝膠液面不平和凝膠柱流干，打開色譜柱活塞收集流出液；h.檢測用吸管吸取收集的樣品一滴，滴入試管中，然后再用吸管吸入配置好的雙縮脲試劑于試管中，觀察顏色的變化，如果出現(xiàn)紫色，表明有蛋白洗脫下來；將雙縮脲試劑進行跟蹤洗脫，直至無紫色現(xiàn)象時，停止收集。實施例2:工藝驗證試驗為了驗證本發(fā)明方法工藝的穩(wěn)定性，對采用不同樣品和不同流速進行試驗，檢測尿素清除率、蛋白得率等指標。試驗結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可以看出，采用不同樣品，不同流速，上樣體積為2ml，洗脫體積為44ml481111，尿素清除率在70%80%之間，平均尿素清除率為76%。蛋白的平均得率為90%。權(quán)利要求一種鹿血清的提純方法，它包括以下幾個步驟a.處理凝膠將葡聚糖凝膠SephadexG-25用蒸餾水充分膨脹后備用；b.裝柱用脫脂棉花堵在色譜柱的下端，將處理好的凝膠一次性緩慢倒入色譜柱中，打開色譜柱的活塞，讓凝膠自由沉降，同時用蒸餾水洗脫，凝膠沉降完畢，待水面高度下降至與凝膠表面基本一致時，關(guān)閉色譜柱活塞，準備加樣；c.加樣用移液槍吸取鹿血清，沿色譜柱環(huán)周壁加入，打開色譜柱活塞，待鹿血清高度下降至與凝膠表面基本一致時，關(guān)閉色譜柱活塞，準備洗脫；d.洗脫用吸管吸取配置好的0.9％NaCl洗脫劑溶液，控制流速為0.18～0.4ml/min，沿色譜柱環(huán)周壁加入，打開色譜柱活塞收集流出液；e.檢測用雙縮脲試劑檢測收集流出液樣品，樣品中加入雙縮脲試劑呈紫色，表明有蛋白洗脫下來，繼續(xù)收集流出液，樣品中加入雙縮脲試劑呈無色，表明沒有蛋白洗脫下來，停止收集。2.按照權(quán)利要求1所述的鹿血清的提純方法，其特征在于鹿血清蛋白濃度為7075g/L，在洗脫過程中，控制流速為0.20.3ml/min。3.按照權(quán)利要求1或2所述的鹿血清的提純方法，其特征在于步驟e使用的雙縮脲試劑的配制方法是首先，稱定240.Og氫氧化鈉NaOH，加蒸餾水定容至lOOOml，即得6mol/L氫氧化鈉NaOH;然后，稱定24g五水硫酸銅CuS045H20，810g酒石酸鉀鈉NaKC4H4064H20，810g氯化鈉NaCl，46g碘化鉀KI，57mol/L氫氧化鈉NaOH80120ml，加蒸餾水定容至lOOOml，制得雙縮脲試劑。4.按照權(quán)利要求3所述的鹿血清的提純方法，其特征在于步驟e使用的雙縮脲試劑的配制方法是首先，稱定240.Og氫氧化鈉NaOH，加蒸餾水定容至lOOOml，即得6mol/L氫氧化鈉NaOH;然后，稱定3g五水硫酸銅CuS045H20，9g酒石酸鉀鈉NaKC4H4064H20，9g氯化鈉NaCl，5g碘化鉀KI，6mol/L氫氧化鈉NaOH100ml，加蒸餾水定容至lOOOml，制得雙縮脲試劑。全文摘要本發(fā)明提供了一種鹿血清的提純方法，它是采用葡聚糖凝膠SephadexG-25過濾處理的方法，包括把鹿血清加入葡聚糖凝膠SephadexG-25色譜柱內(nèi)，用0.9％NaCl洗脫劑洗脫，用雙縮脲試劑檢測收集流出液樣品等步驟。該方法簡便、重復(fù)性好，工藝穩(wěn)定可靠，尿素清除率可以達到76％以上，蛋白得率達到90％以上。文檔編號A23L1/29GK101773521SQ20101012378公開日2010年7月14日申請日期2010年2月7日優(yōu)先權(quán)日2010年2月7日發(fā)明者龐秀明,董栗,郭盈盈申請人:董栗