專利名稱：一種從脂肪組織中分離純化許旺細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、 純化許旺細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
許旺細(xì)胞(ktiwarm cells, SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中重要的一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，由 Schwann (1939)首先發(fā)現(xiàn)，在有髓神經(jīng)纖維髓鞘化，損傷神經(jīng)修復(fù)中起到重要的作用。也是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的重要來源，能夠分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子(CNTF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等。成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)損傷的軸突欠缺再生能力，但周圍神經(jīng)損傷后，軸突再生能力較為強(qiáng)大，有學(xué)者認(rèn)為，這種軸突再生能力的差異是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)自身的微環(huán)境不適宜軸突再生。進(jìn)一步研究表明，將周圍神經(jīng)移植至中樞神經(jīng)后，軸突能再生長(zhǎng)入周圍神經(jīng)內(nèi)，而起關(guān)鍵作用的成分正是SCs.說明SCs 不僅在周圍神經(jīng)損傷后，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，髓鞘化起到關(guān)鍵的作用，再中樞神經(jīng)的損傷修復(fù)中也有重要的作用。目前組織工程神經(jīng)構(gòu)建所需的許旺細(xì)胞的組織來源以坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)的許旺細(xì)胞，一下原因限制了其應(yīng)用一，供體神經(jīng)來源有限，往往帶來新的創(chuàng)傷，且效果不是很理想；二所得細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，擴(kuò)增能力有限，不能滿足組織工程對(duì)種子細(xì)胞數(shù)量的要求。新生乳鼠和胚胎鼠來源的神經(jīng)細(xì)小，柔嫩，脆而易斷，且剝離外膜困難，束膜更是無(wú)法剝離。出生6天后至成年鼠神經(jīng)來源的施萬(wàn)細(xì)胞增殖能力較弱，采用體外體內(nèi)預(yù)變性處理比較耗時(shí)，且增殖能力仍然不是很理想。我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)皮下脂肪組織中也可以分離出許旺細(xì)胞，且許旺細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)增殖能力更強(qiáng)，采用專利(申請(qǐng)?zhí)?200910195924. 0)純化方法就可以獲得高純度的許旺細(xì)胞。故我們?cè)O(shè)計(jì)采用從脂肪組織中利用混合酶分步消化法獲得許旺細(xì)胞，不會(huì)給供區(qū)或供體帶來感覺或運(yùn)動(dòng)障礙，且操作簡(jiǎn)單，分離徹底，獲得原代許旺細(xì)胞的純度就可以達(dá)到60%以上。進(jìn)行人工神經(jīng)的研究需要大量的許旺細(xì)胞，所以如何高效、高純度的培養(yǎng)許旺細(xì)胞成為學(xué)者們關(guān)注的要點(diǎn)。但在體外培養(yǎng)和純化過程中無(wú)法避免成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，在長(zhǎng)有大量成纖維細(xì)胞的環(huán)境中，雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)呈漸進(jìn)式的衰減和死亡，而夾雜有少量成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境中，雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖良好。成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖速度遠(yuǎn)超于許旺細(xì)胞，要在接種之前把成纖維細(xì)胞清除，傳統(tǒng)的許旺細(xì)胞純化方法有多種應(yīng)用抗體，抗有絲分裂劑抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，其細(xì)胞毒性可能對(duì)許旺增殖有影響；組織塊差速貼壁法純化純度不高；無(wú)血清培養(yǎng)法，成本較高。工程化的許旺細(xì)胞數(shù)量上至少應(yīng)達(dá)到1 X 107個(gè)/ ml才能保證其所產(chǎn)生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、層黏蛋白等起到保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)再生的作用， 雖然用以上幾種方法已經(jīng)能夠較好的取得大量且純度相對(duì)較高的許旺細(xì)胞，但臨床應(yīng)用需要在盡量短的時(shí)間內(nèi)獲取足夠量的細(xì)胞進(jìn)行移植，從而減少許旺細(xì)胞在體外的凋亡及失神經(jīng)所致的肌肉萎縮的發(fā)生。因此，尋找更方便有效的分離純化許旺細(xì)胞的方法就成了學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。我們采用專利(申請(qǐng)?zhí)?009101959 . 0)純化方法純化許旺細(xì)胞，也是利用了許旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁能力不同，許旺細(xì)胞在膠原酶的作用下首先從培養(yǎng)瓶壁脫落，從而可達(dá)到去除成纖維細(xì)胞的目的。我們從脂肪組織中分離許旺細(xì)胞，并使用復(fù)合膠原酶和酵素酶分離純化。利用差速消化法，經(jīng)過第一次純化后，許旺細(xì)胞的純度就可達(dá)到 80 %。再次純化擴(kuò)增后，許旺細(xì)胞的純度就可以接近95 %。采用復(fù)合膠原酶NB4純化優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，所需作用時(shí)間短，純化步驟簡(jiǎn)單，價(jià)格比較適中。由于脂肪組織具有取材方便，操作簡(jiǎn)單，分離徹底，不會(huì)給供區(qū)或供體帶來感覺或運(yùn)動(dòng)障礙。從脂肪組織中分離純化的許旺細(xì)胞，可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和遺傳背景穩(wěn)定等特點(diǎn)， 且避免了異體移植所造成的免疫排斥反應(yīng)，因此從脂肪組織中分離的許旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)組織工程的理想種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從脂肪組織中簡(jiǎn)易、高效的分離、純化許旺細(xì)胞的方法。 尤其涉及一種從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、純化許旺細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供了一種從脂肪組織中分離、純化許旺細(xì)胞的方法，步驟包括(1)無(wú)菌情況下剝離脂肪組織，切碎并清洗；(2)用3-20倍組織量的質(zhì)量體積比為0. 05 0. 3%的消化酶溶液消化脂肪組織碎塊45 90分鐘；所述的消化酶是酵素酶、膠原酶NB4或者兩者的混合液；(3)將步驟(2)得到的混懸液用吸管反復(fù)吹打3 5分鐘；(4)對(duì)步驟(3)中解離的細(xì)胞在600_1500g離心3-10分鐘，棄上清，得到細(xì)胞團(tuán)塊；(5)用許旺細(xì)胞培養(yǎng)液重懸步驟⑷得到的細(xì)胞，以1χ104-5χ104個(gè)/cm2接種于纖維粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿。該方法還可以包括檢測(cè)分離獲得的許旺細(xì)胞的標(biāo)志物p75、slOO和GFAP。所述的消化酶溶液中膠原酶NB4的濃度可以為0. 1 0. 2%。所述的消化酶溶液中酵素酶的濃度可以為0. 1 0. 2%。所述的消化酶可以是膠原酶NB4和酵素酶。所述的溶劑是DMEM培養(yǎng)基。所得的許旺細(xì)胞依次經(jīng)過下述步驟可以進(jìn)行擴(kuò)增A.將所得的許旺細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48 72小時(shí)；B.消化細(xì)胞，收集細(xì)胞混懸液，以600g離心5 10分鐘，棄去上清；C.用許旺細(xì)胞培養(yǎng)液重懸步驟B得到的細(xì)胞，培養(yǎng)48 72小時(shí)即可；D.細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶的密度為2 4X IO4細(xì)胞/cm2。所述的消化細(xì)胞的過程是吸去培養(yǎng)液，加入2 3ml質(zhì)量體積比為0. 06 0. 1 % 的酵素酶，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱作用15 30分鐘；然后水平輕輕振蕩所得細(xì)胞。分離得到的許旺細(xì)胞可以作為神經(jīng)種子細(xì)胞。也可以作為神經(jīng)移植物中的營(yíng)養(yǎng)。上述方法中，所述的組織為人或動(dòng)物的脂肪組織，脂肪組織碎塊體積為 0. 5-10mm3。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中神經(jīng)碎塊體積平均為1mm3。上述方法中，步驟(1)的DMEM培養(yǎng)基體積是脂肪組織體積的5_10倍。
上述方法中，步驟O)中消化酶可以使用酵素酶和膠原酶NB4的混合液?；旌弦褐?，膠原酶NB4的濃度較好為0. 1 0. 3%，例如0. 1%、0. 2%、0. 3% ；酵素酶的濃度較好為 0. 05 0. 2%。上述方法中，步驟O)中消化酶混合酶的溶液是DMEM培養(yǎng)基，可含胎牛血清。DMEM培養(yǎng)基是一種在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的，含各種氨基酸和葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)基。與MEM相比，增加了各種成分用量，同時(shí)根據(jù)其D(+)_葡萄糖的含量又分為高糖型 (低于4.5g/L)和低糖型(低于1.0g/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等?？寺∨囵B(yǎng)用高糖效果較好，常用于雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞和 DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)和各種初代病毒宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)及單一細(xì)胞培養(yǎng)；如 A9、3T6、BALB/3T3、C0S-1、C0S-3、C0S-7、L6, WEHI-3b 等細(xì)胞系的培養(yǎng)。如GIBCO，SIGMA等公司都有售。本發(fā)明中，酵素酶即dispase，購(gòu)自sigma公司。dispase又被稱為分散酶、中性蛋白酶。本發(fā)明中，許旺細(xì)胞培養(yǎng)液是指含2μ M forskolin，10ng/ml heregulin-β-1的 DMEM培養(yǎng)基。其中，毛喉萜O^orskolin)是多種組織細(xì)胞腺苷環(huán)化酶的特異性激動(dòng)劑，具有抗腫瘤作用。鑒定細(xì)胞種類和純度通?？梢圆捎妹庖邿晒夥ê土魇郊?xì)胞儀?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的操作方法或者按照下面的方法進(jìn)行。免疫熒光法將經(jīng)過第一次純化的許旺細(xì)胞種植在6孔板中，12小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定20分鐘，然后PBS洗三次，每次5分鐘；再加入羊血清封閉30分鐘， 然后棄掉羊血清加入兔抗鼠P75多克隆抗體37°C孵育2小時(shí)，然后用PBS清洗三遍，每次 5分鐘，再加入PE表記的羊抗兔單克隆抗體常溫孵育1小時(shí)后PBS清洗三遍，每次5分鐘， 然后加入DAPI染細(xì)胞核10秒鐘，然后加入PBS Iml熒光顯微鏡拍照。隨機(jī)取6個(gè)100倍視野計(jì)數(shù)，計(jì)算許旺細(xì)胞純度。相同方法鑒定經(jīng)過第二次純化的許旺細(xì)胞，計(jì)算許旺細(xì)胞純度。流式細(xì)胞儀鑒定許旺細(xì)胞純度將純化后的許旺細(xì)胞，收集到離心管中，加入 0. 25%胰酶2分鐘進(jìn)一步分散，加入適量10%血清的培養(yǎng)液中和胰酶，然后用單細(xì)胞濾器過濾，用含4%血清的PBS即Buffer液清洗兩邊，然后加入一抗，37度孵育30分鐘，然后用 4% FCS清洗三遍，在加入二抗常溫孵育30分鐘，然后清洗三遍，重懸于0. 5ml4% FCS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。許旺細(xì)胞是重要的外周神經(jīng)膠質(zhì)，能夠分泌多種神經(jīng)生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，形成髓鞘支持神經(jīng)，加快有髓神經(jīng)的信號(hào)傳導(dǎo)，另外在外周和中樞神經(jīng)損傷后修復(fù)中也起到重要的作用，能夠促進(jìn)外周神經(jīng)的軸突生長(zhǎng)延長(zhǎng)，保持損傷神經(jīng)元活性及重新建立突觸連接。近年來組織工程神經(jīng)研究不斷深入，由單純生物導(dǎo)管到復(fù)合種子細(xì)胞的仿生神經(jīng)導(dǎo)管，但是許旺細(xì)胞來源有限必須要損傷自體神經(jīng)，造成供體感覺障礙，帶來新的創(chuàng)傷，而且許旺細(xì)胞在體外培養(yǎng)中容易和成纖維細(xì)胞混雜且增殖比較慢。而神經(jīng)在損失后，必須在盡量短的時(shí)間內(nèi)修復(fù)，才能最大限度的恢復(fù)其支配區(qū)感覺及運(yùn)動(dòng)功能，否則容易造成不可逆的關(guān)節(jié)僵硬，肌肉萎縮。本發(fā)明是從脂肪組織中分離許旺細(xì)胞，并使用復(fù)合膠原酶和酵素酶分離純化。利用差速消化法，經(jīng)過第一次純化后，許旺細(xì)胞的純度就可達(dá)到80%。再次純化擴(kuò)增后，許旺細(xì)胞的純度就可以接近95%。此外，許旺細(xì)胞因?yàn)槭墙K末分化細(xì)胞體外增殖能力差，目前大多采用培養(yǎng)液增加生長(zhǎng)因子以促進(jìn)許旺細(xì)胞的增殖，但是僅僅增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子，許旺細(xì)胞的增殖仍然不夠理想，因?yàn)樵S旺細(xì)胞可以分泌因子促進(jìn)自身的分裂增殖，所以本發(fā)明設(shè)計(jì)許旺細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)，以促進(jìn)許旺細(xì)胞的增殖，取得非常好的效果。利用本發(fā)明能夠?yàn)閾p傷神經(jīng)修復(fù)提供大量無(wú)雜質(zhì)的許旺細(xì)胞。經(jīng)過第一次純化后，許旺細(xì)胞的純度就可達(dá)到80%。再次純化擴(kuò)增后，許旺細(xì)胞的純度就可以接近95%。形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫熒光證明了純化后的細(xì)胞具有成熟許旺細(xì)胞的表型，利用本發(fā)明能夠低成本、高效率的獲得大量高純度的許旺細(xì)胞，而且沒有損傷神經(jīng)，提供一種組織工程學(xué)中獲得種子細(xì)胞的新方法，為損傷神經(jīng)修復(fù)提供豐富優(yōu)質(zhì)許旺細(xì)胞。


圖1 原代混合細(xì)胞。圖2 熒光顯微鏡下的原代細(xì)胞。圖3 加0. 復(fù)合膠原酶NB4作用10分鐘后，見許旺細(xì)胞變亮變圓，部分漂起；輕輕振蕩后，可見許旺細(xì)胞漂起，而脂肪干胞仍然貼附完好。圖4:熒光顯微鏡下的圖3。圖5 經(jīng)過二次純化后，許旺細(xì)胞的純度明顯提高而脂肪干細(xì)胞的比例明顯降低。圖6 熒光顯微鏡下的圖5 (40x)。圖7 相差顯微鏡下普通照片，其中顯示有脂肪來源的其它細(xì)胞。圖8熒光顯微鏡下的照片。圖9P75染色后，許旺細(xì)胞呈紅色。圖10 熒光顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色。圖11是8圖、9圖和10圖的組合，許旺細(xì)胞呈黃色，而脂肪來源的細(xì)胞呈綠色 (IOOx)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1分離純化許旺細(xì)胞新生6天SD小鼠，脫白處死后，放入75%酒精中，浸泡5-10分鐘。無(wú)菌情況下取雙側(cè)腹股溝脂肪。1.無(wú)菌情況下取小鼠的脂肪，用剪刀剪碎至Imm3大小，置于其3_10倍量的DMEM
培養(yǎng)基中清洗，離心棄上清。2.用5-20倍組織量的質(zhì)量體積比為0. 1 0. 2 %的復(fù)合膠原酶NB4和0. 05 0. 1 %的dispase混合酶DMEM溶液消化神經(jīng)碎塊30 60分鐘。3.將步驟2得到的混懸液用吸管反復(fù)吹打3 5分種。4.將步驟3得到的混懸液以600g離心5 10分鐘，棄上清，得到細(xì)胞團(tuán)塊。5.用許旺細(xì)胞培養(yǎng)液(含 2 μ M forskolin, 10ng/ml heregulin-β -1 的 DMEM 培養(yǎng)基)重懸步驟4得到的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按2 4X IO4細(xì)胞/ml種植于25cm2培養(yǎng)瓶，置37°C， 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
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顯微鏡下可以看到脂肪干細(xì)胞和許旺細(xì)胞的典型形態(tài)。實(shí)施例2擴(kuò)增許旺細(xì)胞a.待48 72小時(shí)，吸去實(shí)施例1中步驟5所述培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入2 3ml 37°C溫浴的質(zhì)量體積比為0. 06 0. 的dispase，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱作用15 30 分鐘。b.水平輕輕振蕩步驟a所述培養(yǎng)瓶3 5分鐘，收集細(xì)胞混懸液。c.將步驟b得到的細(xì)胞混懸液以600g，離心5 10分鐘，棄去上清。d.用實(shí)施例1中步驟5所述培養(yǎng)液重懸步驟c得到的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按2 4X IO4 細(xì)胞/ml種植于25cm2培養(yǎng)瓶，置37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。e.待48 72小時(shí)，重復(fù)步驟b_d，即得到大量高純度的許旺細(xì)胞。顯微鏡和免疫組化結(jié)果顯示，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，純度很高。實(shí)施例3兩種消化酶體系消化結(jié)果比較一 )取原代細(xì)胞二、新生6天C57BL6小鼠6只，脫臼處死后，放入75%酒精中，浸泡5 10分鐘三、無(wú)菌情況下取雙側(cè)腹股溝脂肪組織，用剪刀剪碎至Imm3大小，置于其3_10倍量的DMEM培養(yǎng)基中清洗，離心棄上清。四、將脂肪組織碎塊分別放入盛有5ml 2 %復(fù)合膠原酶NB415ml離心管A和盛有 5ml 2%復(fù)合膠原酶NB4和2ml 0. 1% dispasell 15ml離心管B中。五、放入含5% C02, 37°C培養(yǎng)箱中，每隔五分鐘振蕩一次，消化約1個(gè)半小時(shí)。六、將管A和管B 600g離心5分鐘，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)種植到培養(yǎng)瓶中，每瓶0.5min。二)許旺細(xì)胞的純化待原代細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，細(xì)胞接近融合狀態(tài)然后將所獲得細(xì)胞分成兩組，一組用0. 05%復(fù)合膠原酶純化，一組用dispase純化。將培養(yǎng)液吸除后，將A組加入aiil 0. 05%膠原酶NB4將B組加入0. 06% dispase 然后放入培養(yǎng)箱中，孵育約15 30min然后輕輕振蕩約5min然后離心收集細(xì)胞計(jì)數(shù)按 1 1計(jì)數(shù)傳代。96小時(shí)后重復(fù)上述步驟近一步純化一次，計(jì)數(shù)。三)純度鑒定1免疫熒光法將經(jīng)過第一次純化的許旺細(xì)胞種植在6孔板中，12小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定20分鐘，然后PBS洗三次，每次5分鐘；再加入羊血清封閉30分鐘，然后棄掉羊血清加入兔抗鼠P75多克隆抗體37°C孵育2小時(shí)，然后用PBS清洗三遍，每次5分鐘，再加入 PE表記的羊抗兔單克隆抗體常溫孵育1小時(shí)后PBS清洗三遍，每次5分鐘，然后加入DAPI 染細(xì)胞核10秒鐘，然后加入PBS Iml熒光顯微鏡拍照。隨機(jī)取6個(gè)100倍視野計(jì)數(shù)，計(jì)算許旺細(xì)胞純度。相同方法鑒定經(jīng)過第二次純化的許旺細(xì)胞，計(jì)算許旺細(xì)胞純度。表1.許旺細(xì)胞的純度(i±s，n-10)
權(quán)利要求
1.一種從脂肪組織中分離、純化許旺細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括步驟(1)無(wú)菌情況下剝離脂肪組織，切碎并清洗；(2)用3-20倍組織量的質(zhì)量體積比為0.05 0. 3%的消化酶溶液消化脂肪組織碎塊 45 90分鐘；所述的消化酶是酵素酶、膠原酶NB4或者兩者的混合液；(3)將步驟(2)得到的混懸液用吸管反復(fù)吹打3 5分鐘；(4)對(duì)步驟(3)中解離的細(xì)胞在600-1500g離心3-10分鐘，棄上清，得到細(xì)胞團(tuán)塊；(5)用許旺細(xì)胞培養(yǎng)液重懸步驟(4)得到的細(xì)胞，以IX104-5X IO4個(gè)/cm2接種于纖維粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括檢測(cè)分離獲得的許旺細(xì)胞的標(biāo)志物 p75、slOO 和 GFAP。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是消化酶溶液中膠原酶NB4的濃度為0.1 0. 2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是消化酶溶液中酵素酶的濃度為0.1 0.2%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的消化酶是膠原酶NB4和酵素酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是消化酶的溶劑是DMEM培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求1所述的方法的應(yīng)用，其特征是將所得的許旺細(xì)胞依次經(jīng)過下述步驟進(jìn)行擴(kuò)增A.將權(quán)利要求1所得的許旺細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48 72小時(shí)；B.消化細(xì)胞，收集細(xì)胞混懸液，以600g離心5 10分鐘，棄去上清；C.用許旺細(xì)胞培養(yǎng)液重懸步驟B得到的細(xì)胞，培養(yǎng)48 72小時(shí)即可；D.細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶的密度為2 4XIO4細(xì)胞/cm2。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是所述的消化細(xì)胞的方法是吸去培養(yǎng)液，加入 2 3ml質(zhì)量體積比為0. 06 0. 1 %的酵素酶，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱作用15 30分鐘； 然后水平輕輕振蕩所得細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1所述的方法的應(yīng)用，其特征是將分離得到的許旺細(xì)胞作為神經(jīng)種子細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1所述的方法的應(yīng)用，其特征是將分離得到的許旺細(xì)胞作為神經(jīng)移植物中的營(yíng)養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從利用脂肪組織分離、純化許旺細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。該方法步驟包括(1)無(wú)菌情況下剝離脂肪組織，切碎并清洗；(2)用3-20倍組織量的消化酶溶液消化脂肪組織碎塊；所述的消化酶是酵素酶、膠原酶NB4或者兩者的混合液；(3)將得到的混懸液用吸管反復(fù)吹打3～5分鐘；(4)對(duì)解離的細(xì)胞在600-1500g離心3-10分鐘，得到細(xì)胞團(tuán)塊；(5)用許旺細(xì)胞培養(yǎng)液重懸步驟(4)得到的細(xì)胞接種于纖維粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿。許旺細(xì)胞的純度就可以接近95％。利用本發(fā)明能夠低成本、高效率的獲得大量高純度的優(yōu)質(zhì)許旺細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/079GK102191220SQ201010124579
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者沈尊理, 祝加學(xué), 秦金保 申請(qǐng)人:上海市第一人民醫(yī)院