專利名稱：一種復合豬α干擾素基因及其重組載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一種復合豬α干擾素的基因序列及其重組載體，屬于基因工程生物制品 技術領域。與天然的豬α干擾素相比，有更強的抗病毒活性，可針對性的用于豬的各種病 毒性疾病的防制和早期治療。
背景技術：
干擾素是動物機體最重要細胞因子之一，具有廣譜、高效的抗病毒功能，對免疫 系統(tǒng)起關鍵調(diào)節(jié)作用。早在1986年，Lefevre等就曾對豬α干擾素基因及豬α干擾素 作了詳細研究。得到了一個含α干擾素基因的片段，序列分析表明該片斷有一連續(xù)的 含190個密碼子的開放閱讀框，起始密碼子上游有約100個核苷酸的5’區(qū)域，具ΤΑΤΤΤΑΑ 序列(現(xiàn)已證實ΤΑΤΤΤΑΑ序列存在于絕大多數(shù)豬α干擾素基因中)，被認為是經(jīng)修飾的 Hogness-Goldberg盒，然而在終止密碼子下游的499bp中沒有AATAAA或ATTAAA類多聚腺 嘌呤位點。此基因編碼的成熟豬α干擾素的70 80位氨基酸有一個潛在的N-糖基化 位點。此基因與HuIFN-α 1核苷酸的編碼序列有78. 5%同源，編碼的氨基酸與HuIFN-α 1 有64%同源，是所有已知豬IFN-α基因中與人同源性最高的。1986年Lefevre等用 HuIFN-a 1作探針從豬基因庫中分離出10多個豬α干擾素基因和假基因，并測出其中2個 基因的基因序列PoIFN-a 1和PoIFN-a 2。1990年Lefevre等在成熟豬α干擾素編碼序 列的第一個密碼子TGT前引入序列5，CATATG 3，，即一個起始密碼子和一個NdeI限制性酶 切位點，從而在大腸桿菌中表達出了豬α干擾素蛋白。所得豬α干擾素為重組豬a 1型干 擾素，分子量為17. 5kDa，與天然豬α干擾素具有相同的N端氨基酸序列(缺失Met)。在 同源的豬細胞上重組豬a 1型干擾素的抗病毒活性至少比天然豬白細胞干擾素高6倍。但 他們運用的是組合型表達載體，表達量較低，約為5%，目的蛋白以可溶形式存在，可用親和 層析方法小量純化，難以在實際生產(chǎn)中應用。1995年Moore BR指出干擾素作為一種廣譜抗 病毒劑有巨大的應用價值；Piasecki E對豬天然干擾素(Natural porcine interferons, PoIFNs)的活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)在豬的干擾素家族中，豬α干擾素的種屬特異性較弱， 可在豬、牛、人及鼠類等細胞上產(chǎn)生活性。1999年Ch in sangaram等研究表明豬IFN-a 能有效抑制口蹄疫病毒的活力，2001年RifTault等研究表明感染TGEV的仔豬，可在腸道 上皮組織中迅速產(chǎn)生抗TGEV的IFN-α。謝海燕等采用PCR技術克隆得到的豬IFN-α基 因由501個核苷酸組成，共編碼166個氨基酸；2002年國內(nèi)學者陳濤等成功地在畢赤酵母 表達系統(tǒng)和大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達出重組干擾素基因，表達產(chǎn)物占菌體總蛋白的比率在 20% 35%之間，表達產(chǎn)物具有抗病毒活性，為基因工程干擾素的規(guī)?；a(chǎn)和應用提供 了可能。2003年Moraes等用表達豬IFN-α (包含信號肽)的重組腺病毒Ad5_IFN-α和表 達 FMDV(Foot-and-mouth disease virus，口蹄疫病毒)A24P1 蛋白和 FMDV A12 3C 蛋白的 重組腺病毒(Ad5A24)對豬體進行聯(lián)合免疫使其獲得保護，來抵抗口蹄疫病毒的攻擊并獲 得成功。國內(nèi)秦耀明等報道豬白細胞干擾素在乳豬的結扎腸段中可明顯干擾豬流行性腹 瀉病毒的增殖；2003年鄭永波等用豬白細胞干擾素作臨床試驗，試驗結果表明如果直進行治療，更能顯著提高對患病動物的治率；2005年張泉軍等通過實驗和臨床擴大試驗發(fā)現(xiàn)豬 白細胞干擾素對哺乳仔豬和斷奶仔豬某些病毒性腹瀉、細菌性腹瀉或病毒、細菌混合感染 引發(fā)的腹瀉，均有良好的預防和治療用；2006年杜以軍等構建的重組腺病毒rAd-poIFN-a 在HEK-293A細胞上獲得的表達產(chǎn)物(含有豬IFN-α )在接種ΡΚ-15細胞的上清中表現(xiàn)出 了較強的抗豬口蹄疫病毒的活性。九十年代，美國安進公司研究出一種全新的人復合alpha干擾素dnfergen。這 種復合干擾素是一種非自然的干擾素，166aa序列的獲得是通過對幾種天然alpha亞型干 擾素序列的掃描，把最常見的氨基酸轉移到各個相應的位置。為便于分子構造，還 另改變了 4個氨基酸。Infergen序列與alpha II型干擾素的同源性為88%，與beta干擾素的同源 性為30%，且相似性較任何天然的alpha干擾素要高。實驗證明=Infergen的抗多種病毒 的活性較天然的干擾素高5倍，按WHO人源干擾素抗病毒策略為標準得到其抗病毒活性為 lX109U/mg。為了進一步研究干擾素作用和擴大干擾素在生物領域的發(fā)展應用，我們進行 了豬復合新型干擾素的研究工作設計該干擾素時選擇野生型及抗病力較強的品種的α干擾素亞型為模板；將收 集的干擾素氨基酸序列用DANMAN或者Lasergene DNAstar等軟件進行比對分析，以擇量錄 取原則，選擇出現(xiàn)頻率最高的氨基酸，拼接出一個人造干擾素氨基酸序列模板。Lasergene DNAstar分析新干擾素氨基酸結構，與其他表達或不表達蛋白質(zhì)結構進行比較結構越簡 單越有利于表達；確定好氨基酸序列后，按照偏嗜密碼子的偏嗜性改造新型干擾素基因序 列，在偏嗜性差別不大或密碼子出現(xiàn)頻率不很極端的情況下，選擇GC含量高的偏嗜密碼 子，使酵母表達的基因GC含量控制在45%左右，接近酵母本身基因組的GC含量。確定好新 基因序列后根據(jù)其長度設計引物，用Primer Premier 5. 0軟件共設計了十四條引物，根據(jù) 擴增長度按常規(guī)擴增條件反應進行擴增。由誘生劑誘導產(chǎn)生豬IFN-α，因來源少、成本高、純化工藝復雜等諸多限制而價 格昂貴，極大程度上限制了臨床和科研的應用。原核表達系統(tǒng)中其產(chǎn)物主要以無生物活性 的包涵體形式存在，若要想獲得具有生物活性的重組蛋白必須對包涵體進行變性、復性等 繁瑣的后續(xù)處理工作，而后續(xù)處理工作中重組蛋白的損失量大而且對工作人員的技術水 平要求也很高，這不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本試驗采用酵母表達系統(tǒng)(J.L.Cereghin0， J. Μ. Cregg, Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris)。此表達系統(tǒng)具有營養(yǎng)要求簡單，生長快，操作方便，易于培養(yǎng)，成本低，密度高， 發(fā)酵技術已非常成熟，具有大規(guī)模生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品的潛力等優(yōu)點，發(fā)酵上清液中的雜蛋 白含量很低，更易進行大規(guī)模的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題本發(fā)明的目的在于對豬α干擾素結構進行改造，研制出一種復合重組 非天然豬α干擾素的基因序列的生產(chǎn)方法及其重組表達載體，達到高表達、高穩(wěn)定、高分 泌、高活性的生產(chǎn)，可廣泛用于豬的各種病毒性疾病的防制和早期治療，以及增強豬群的整 體免疫力。技術方案一種復合豬α干擾素基因，其序列為SEQ ID Ν0. 1，大小為501bp ；
上述復合豬α干擾素基因的應用，包括(一 )含有復合豬α干擾素基因酵母表達載體的構建與鑒定將人工合成的權利要求1所述復合豬α干擾素基因SEQ ID NO. 1加EcoRI和 XbaI兩個酶切位點后設計引物，PCR擴增該豬α干擾素基因的產(chǎn)物與pPICZ α-A酵母載體 連接后，酶切，Τ4 DNA Ligase連接過夜，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)Ε. coli DH5 α得到重組表達載體，重組表達載體再進行雙酶切鑒定，酶切切下大小為501bp的條帶則鑒定為陽性載體， DNA序列測定完全正確的陽性載體即為構建的含有豬α干擾素基因酵母表達載體，命名為
PpICZa-MPoIFNa ；( 二 )酵母菌畢赤酵母Χ-33感受態(tài)細胞的制備(三)含有復合豬α干擾素基因酵母表達載體電轉化入酵母菌X-33感受態(tài)細胞取經(jīng)SacI酶線性化后的上述含有豬α干擾素基因的酵母表達載體 PpICZ a -MPoIFN a 10 μ L，與80 μ L上述酵母菌畢赤酵母Χ_33感受態(tài)細胞混勻，然后轉移到 冰預冷的0. 2cm的電轉化杯中，冰上放置5min ；將電轉化杯放在電穿孔儀上用脈沖電流進 行電擊一次，電擊結束，立即加入ImL冰預冷的Imol山梨醇，混勻，移入1. 5mL的Eppendof 管中，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)lh，然后取250 μ L轉化物涂含有100 μ g/mLZeocin (博來 霉素)抗性的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28°C恒溫培養(yǎng)2-4天，將在YPDS培養(yǎng)基上生長的含有 PpICZa-MPoIFNa的重組酵母菌落進行陽性鑒定；(四)含PpICZa -MPoIFNa載體重組酵母菌株的陽性鑒定(1)提取含PpICZ a -MPoIFNa載體重組酵母菌株的基因組DNA(2)用來陽性鑒定的AOXl引物上游5，-gactggttccaattgagaagc-3， 下游5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR擴增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以AOXl引物為特異性引物進行PCR 擴增，獲得擴增片段總長度為1089bp的條帶，則為含有PpICZ α -MPoIFN α載體的重組酵母 陽性菌株,命名為X-33/PpICZ α-MPoIFNa ；(五)X_33/PpICZ a-MPoIFNa 的誘導表達從含有上述菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體 培養(yǎng)基中，經(jīng)28°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl = 2-6時，室溫1500rpm/min離心5min收獲菌體，將收 獲的菌體用IOOmL的BMMY培養(yǎng)液懸浮于500mL的三角瓶中，置于28°C搖床進行誘導表達， 每24h向培養(yǎng)基中補加終濃度為體積比的甲醇，以保持誘導的持續(xù)表達，在誘導72h時 離心法收集培養(yǎng)的X-33/PpICZ a -MPoIFNa表達的上清進行純化；(六)X-33/PpICZ a-MPoIFNa 表達產(chǎn)物的純化用45%的硫酸銨沉淀上述收集的X-33/PpICZ a -MPoIFNa表達上清，12000rpm/ min離心30min，倒掉上清，0. 9M硫酸銨重懸蛋白沉淀，然后過疏水柱(Phenyl Sepharose 6FastFlow)脫鹽，脫鹽后的蛋白再經(jīng)陰離子交換柱(Q Sepharose Fast Flow)純化后即得 到了本發(fā)明復合豬α干擾素基因的表達蛋白；有益效果本發(fā)明采用的畢赤氏酵母基因工程菌生產(chǎn)的復合豬α干擾素與傳統(tǒng)生產(chǎn)的天然 豬α干擾素和用大腸桿菌表達的天然豬α干擾素相比有以下幾個優(yōu)點A表達豬α干擾素成熟蛋白的基因擴增簡單方便只要設計好引物不要模板就可以擴增出表達豬α干擾素成熟蛋白的基因。B獲得具有生物活性的復合豬α干擾素方法和程序都簡單只需收集表達的上清 進行透析除鹽、過濾除菌處理后無需純化即可投入臨床使用；C無毒害物質(zhì)酵母不會分泌像大腸桿菌表達的外源蛋白那樣附帶一些對豬體細 胞有毒害的毒素；
D純度高酵母表達的豬α干擾素的SDS-PAGE結果經(jīng)薄層掃描顯示，重組酵母豬 α干擾素的目的條帶占總表達蛋白量的80% ；E廣譜抗病毒作用現(xiàn)國內(nèi)外資料表明豬干擾素對豬的各種病毒性疾病的病毒均 有較好的抑制作用，尤其對一些烈性傳染性病毒性疾病如藍耳病、口蹄疫的早期治療和預 防有很好的作用，能在很大程度上遏制各種豬傳染性的病毒性疾病的流行和爆發(fā)；F抗病毒作用強該新型基因組表達的蛋白與酵母表達的天然豬α干擾素相比， 有更好的抗病毒活性，其在ΡΚ-15細胞上抵抗IOOTCID5ciVSV病毒感染的作用提高了 44.4 倍。G有強大的免疫調(diào)節(jié)作用醫(yī)學臨床把干擾素用于SARS、肝炎以及各種病毒性疾 病治療和預防的成功例子為復合豬α干擾素用于豬群各種病毒性疾病的治療和防制提供 了可靠的依據(jù)。復合豬α干擾素的成功研制，以及它所具有的一系列的便于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點 和強大的抗病毒功能，必將給我國豬病毒性疾病的防制帶來新的局面。將本發(fā)明新設計的 復合豬α干擾素的基因序列重組到PPICZ α-A載體，然后通過電轉化方式整合到酵母菌 上的特定位置。并采用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達外源基因，有利于豬干擾素商業(yè)化生產(chǎn)。該基 因組表達的蛋白與酵母表達的天然干擾素相比，其表達量提高了 3. 17倍。用PK-15-VSV系 統(tǒng)檢測該復合豬α干擾素的抗病毒活性，比酵母表達的天然豬α干擾素提高了 44. 4倍。 100U該復合干擾素在ΡΚ-15細胞上能完全抑制IOOTCID5ci的水皰性口炎病毒以及偽狂犬病 毒的攻擊。
四

圖1 復合豬α干擾素基因PCR產(chǎn)物電泳分析1，DNA分子量標準；2，PCR擴增目的片段圖2 =PpICZ α -MPoIFN α陽性克隆載體的酶切鑒定1，空質(zhì)粒酶切對照；2，EcoR I 和 XbaI 酶切的 PpICZ α-MPoIFN α ；3，4500DNA 分子
量標準圖3 重組酵母菌的PCR鑒定Ι,Χ-33/PpICZ α -MPoIFNa ；2，未重組上的空酵母Χ-33 對照；3，4500DNA分子量標 準圖4 :X-33/PpICZ a -MPoIFNa表達的復合豬α干擾素SDS-PAGE分析及 westernblot 鑒定 1，Protein Marker ；2，X-33/pPICZa 表達上清；3，復合豬 α 干擾素表達 產(chǎn)物；4，復合豬α干擾素westernblot結果圖5 干擾素抑制PK-15細胞的MTT結果1，2，3，4，5，6，7，8 分別是濃度為 0,0. 156,0. 313,0. 625，1. 25，2. 5,5,10 的干擾素
圖6 干擾素抑制PRVmRNA表達的SYBR Green I實時熒光定量PCR結果1，PRV對照；2，天然豬α干擾素；3，復合豬α干擾素生物材料保藏菌株X-33/PpICZ α-MPoIFNa，屬巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，于2010 年01月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO. 3570。
五具體實施例方式一、試驗材料Escherichia coli DH5a、酵母菌X-33和pPICZ α-A載體均購自上海英俊公司；所 用化學試劑及試劑盒均購自Takara公司；Phenyl S印harose 6Fast Flow和Q S印harose FastFlow購自上海GE公司；PK-15細胞(豬腎細胞)、VSV (水泡型口炎病毒)、PRV (豬偽 狂犬病病毒)和豬天然α干擾素均為公知公用(曹瑞兵等，一種新的豬α-干擾素基因 克隆及其在大腸桿菌中表達，農(nóng)業(yè)生物技術學報JournalofA griculturalBiotechnology 2004，12(3) :278 282)。二、試驗設計及生產(chǎn)方法(一 )重組到畢赤酵母上的新型復合豬α干擾素的基因序列的的設計及擴增(A)在GenBank上查找豬α干擾素的基因序列，選擇野生型及抗病力較強的27條 豬α干擾素亞型為模板；(B)將選出的27條豬α干擾素通過DANMAN或者Lasergene DNAstar等軟件進 行比對分析，以擇量錄取原則，拼接出一條人造干擾素氨基酸序列模板，將此氨基酸序列翻 譯成核苷酸序列SEQ ID Ν0. 1，根據(jù)密碼子偏嗜性，全部換用酵母的偏嗜性密碼子(趙翔， 霍兢，李育陽；畢赤酵母的密碼子用法分析)?；騁C含量控制在45%左右，接近酵母本 身基因組 GC 含量(Graham Sinclair，F(xiàn)rancis Y. Μ. Choy. Synonymous codon usagebias and the exp ression of human glucocerebro sidase in the methylotrophic yeast, Pichiapastoris)；該核苷酸序列模板為含501bp的新的堿基序列SEQ ID N0. 1，加兩個酶 切位點及保護性堿基，共522bp，(C)將加了酶切位點和保護性堿基的新型豬α干擾素核苷酸序列522bp設計引 物，用Primer Premier 5. O設計引物，共設計14條引物如表1。(D) SOE 法進行 PCR 擴增，反應體系5 X Prime STAR Buffer 10. O μ L ；Prime STA 0. 4 μ L ；50pmol/ μ L 上游引物 1· 0 μ L ； dNTP4. 0 μ L ；50pmol/ μ L 下游引物1· 0 μ L ；ddH2033. 6 μ L ；在PCR 儀上設置 95°C 5min,隨后 94°C 15s，54°C 15s，72°C 15s，共 30 個循環(huán)，結束 循環(huán)后72°C lOmin;對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的豬α干擾素基因大小。以上面體系對引物兩兩進行擴增，然后回收PCR產(chǎn)物，再以PCR產(chǎn)物為模板進行如 下體系擴增
5X Prime STAR Bufier 10. 0 μ L ；Prime STAR 0. 4 μ L ；50pmol/ μ L 上游引物 0· 25 μ L ；dNTP4. 0 μ L ；50ρπιο1/μ L 下游引物 0.25“1^;模板12. 0 μ L ；模板22. 0 μ L ； ddH2031. 1 μ L ；在PCR 儀上設置 95°C 5min,隨后 94°C 15s，54°C 15s，72°C 15s，共 30 個循環(huán)，結束
循環(huán)后72°C lOmin;對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的豬α干擾素基因大小。最后擴增出PCR產(chǎn)物的基因片段大小為522bp見圖1 ；表 1 ( 二 )含有復合豬α干擾素基因酵母表達載體的構建與鑒定將人工合成的復合豬α干擾素基因SEQ ID NO. 1加EcoRI和XbaI兩個酶切位
點后設計引物用PCR擴增該豬α干擾素基因SEQ ID NO. 1，擴增產(chǎn)物與pPICZ α-A酵母載
體分別進行EcoRI和XbaI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，Τ4 DNA Ligase連接過夜，連接產(chǎn)物轉化
Ε. coli DH5a感受態(tài)細胞得到重組表達載體，重組表達載體再進行酶為EcoR I和XbaI的雙酶切鑒定，酶切切下大小為501bp的條帶則鑒定為陽性載體，對陽性載體送上海英俊公 司進行DNA序列測定，序列測定完全符合SEQ ID NO. 1，其陽性載體即為構建的含有豬α干 擾素基因酵母表達載體，命名為PpICZa-MPoIFNa ；見圖2 ；(三)酵母菌感受態(tài)細胞的制備
挑取畢赤酵母Χ-33菌平板上的一個單菌落轉接于2mLYPD (Pichia Expression Kit)試管中，28°C 250rpm恒溫搖過夜活化12h后，取500 μ L的活化后的畢赤酵母Χ_33菌 液轉接于50mL的含有無菌5mLYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28°C恒溫 搖床250rpm搖蕩培養(yǎng)20h左右，待菌液OD600 = 1. 3-1. 5時，4°C 2500rpm/min離心Imin收 獲畢赤酵母X-33菌體，菌體依次用ImL冰預冷水洗滌兩遍，再用ImL冰預冷的Imol山梨醇 洗滌，4V 2500rpm/min離心lmin，最后用0. 8mL冰預冷的Imol山梨醇懸浮菌體，分裝不同 的1. 5mL的Eppendof管后，置4°C待用，即為制備的酵母菌畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞；(四)含X-33/PpICZα -MPoIFN α的表達載體電轉化入酵母菌(1)取經(jīng)SacI酶線性化后的上述含有豬α干擾素基因的酵母表達載體10 μ L，與 80 μ L上述酵母菌畢赤酵母x-33感受態(tài)細胞混勻，然后轉移到冰預冷的0. 2cm的電轉化杯 中，冰上放置5min ；(2)將電轉化杯放在電穿孔儀上用脈沖電流進行電擊一次，電擊條件電壓 1500V,電容 25uF,電阻 200 Ω，時間 5ms ；(3)電擊結束，立即加入ImL冰預冷的Imol山梨醇，混勻，移入1. 5mL的Eppendof 管中，置于28 °C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)lh，然后取250 μ L轉化物涂含有100 μ g/mLZeocin 抗性的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28 °C恒溫培養(yǎng)2-4天，將在YPDS培養(yǎng)基上生長的含有 PpICZ α -MPoIFN α的重組酵母菌落進行陽性鑒定；(五)含X-33/PpICZα -MPoIFN α載體重組酵母菌株的陽性鑒定(1)提取酵母基因組DNA 將上述YPDS培養(yǎng)基上生長的含PpICZ α -MPoIFN α載體 的重組酵母菌落挑至含100 μ g/mLZeocin的YPDS液體培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)36h_48h， 然后從該菌液中提取酵母基因組DNA 取ImL的菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min 離心lmin，棄上清，用ImL的滅菌水重懸菌體，重復兩次，然后加100 μ L的滅菌水，100°C 煮10分鐘，消解酵母菌細胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，100°C煮10分鐘，12000rpm/ min離心取上清液，即為酵母基因組DNA，以其為模板進行PCR陽性鑒定(Linder，S.， Schliwa, Μ. ,Kube-Granderath,Ε.,1996.Direct PCR screening of P. pastoris clones. BioTechniques)；(2)用來陽性鑒定的AOXl引物上游5，-gactggttccaattgagaagc-3， 下游5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3) PCR擴增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以AOXl引物為特異性引物進行PCR擴增，PCR擴增體 系為 滅菌水補體積至50 μ L
擴增程序:95V5min, 94°C Imin，54V 1. 5min, 72°C 2. 5min, 30 個循環(huán)，72°C 7min,
擴增結束，取5μ L反應液做瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得擴增片段總長度為IlOlbp的條帶， 則為含有PpICZ α-MPoIFN α載體的重組酵母陽性菌株，命名為X_33/PpICZ α-MPoIFN α ； 見圖3 ；
(六)X-33/PpICZ α-MPoIFNa 的誘導表達從含有上述菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體 培養(yǎng)基(Pichia Expression Kit)中，經(jīng) 28°C搖床培養(yǎng)至 OD6tltl = 2-6 時，室溫 1500rpm/min 離心5min收獲菌體，將收獲的菌體用IOOmL的BMMY培養(yǎng)液懸浮于500mL的三角瓶中，置于 28°C搖床進行誘導表達，每24h向培養(yǎng)基中補加終濃度為體積比的甲醇，以保持誘導的 持續(xù)表達，在誘導72h時收集培養(yǎng)的X-33/PpICZ α -MPoIFN α表達的上清進行純化；(七)X-33/PpICZ α-MPoIFNa 表達產(chǎn)物的純化用45%的硫酸銨沉淀上述收集的X-33/PpICZ a -MPoIFNa表達上清，12000rpm/ min離心30min，倒掉上清，0. 9M硫酸銨重懸蛋白沉淀，然后過疏水柱(Phenyl Sepharose 6FastFlow)脫鹽，脫鹽后的蛋白再經(jīng)陰離子交換柱(Q Sepharose Fast Flow)純化后即得 到了本發(fā)明復合豬α干擾素基因的表達蛋白；同時對不同時段表達產(chǎn)物取樣，進行SDS-PAGE電泳(U. K. Laemmli，Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4)發(fā)現(xiàn)在誘 導了 72h時的上清的電泳圖上在14. 4KD與21. 5KD之間有一條大約19KD的明顯的蛋白電 泳條帶，與預測的分子量相同，進行純化后SDS-PAGE電泳見圖4 ；(八)目的蛋白濃度的測定用核酸蛋白分析儀的紫外分光光度法測定樣品在280nm波長的光收值，按照公式 計算樣品中蛋白質(zhì)含量。公式為蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = (OD280 X稀釋倍數(shù))/消光系數(shù)(九)X-33/PpICZ α-MPoIFNa 表達產(chǎn)物的 westenblot 鑒定用純化的天然豬α干擾素免疫兔子，制備多抗血清，用此多抗血清做一抗 SPA-HRP(金黃色葡萄球菌A蛋白)做二抗做westernblot鑒定。轉化重組質(zhì)粒X-33/ PpICZa-MPoIFNa的酵母菌X-33在約19KD處有特異蛋白條帶顯色；見圖5 ；(十)X-33/PpICZa -MPoIFNa表達的復合豬α干擾素在PK-15細胞上的抗細胞 增殖測定A、復合豬α干擾素在PK-15細胞上的MTT測定PK-15細胞記數(shù)后用含10%小牛血清的DMEM營養(yǎng)液稀釋到適當?shù)拿芏?，?2X IO3/孔的濃度滴加到96孔板，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中待細胞貼壁成單層(約 17-18h)后用含10%小牛血清的DMEM營養(yǎng)液將酵母表達的復合豬α干擾素進行兩倍倍比 稀釋，10μ g/ml、5y g/ml、2. 5μ g/ml、l. 25μ g/ml、0. 625μ g/ml、0. 313 μ g/ml，每個濃度做 五個重復。在96孔細胞培養(yǎng)板上將兩倍倍比稀釋的復合豬α干擾素樣品以100 μ 1/孔分 別預處理ΡΚ-15細胞72h后，每孔加入20 μ 1濃度為5mg/ml的MTT，置于37°C，5% CO2培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后每孔加入200 μ 1DMS0 (二甲基亞砜)終止培養(yǎng)，在振蕩器上振 蕩十分鐘后置于570nm波長下讀數(shù)；B、復合豬α干擾素在PK-15細胞上的MTT測定結果
由圖5可知，復合豬α干擾素比相同質(zhì)量的天然豬α干擾素能更有效地抑制 PK-15細胞的增殖。(十一)酵母表達的復合豬α干擾素生物活性的測定，并與天然豬a干擾素進行 活性比較A、⑴復合豬α干擾素在ΡΚ-15細胞上抗VSV的活性 待ΡΚ-15細胞在96孔細胞培養(yǎng)板中長成單層后，傾去營養(yǎng)液，用維持液洗兩遍，每 孔加入用含10%小牛血清的1640營養(yǎng)液作連續(xù)10倍稀釋的復合豬α干擾素和天然豬α 干擾素各IOOyL,每一稀釋度接種四孔。將細胞培養(yǎng)板置于5% C02，37°C細胞培養(yǎng)箱中繼 續(xù)培養(yǎng)，24h后傾去上清，用維持液洗兩遍，每孔加入100 μ L 1000TCID50/mLVSV病毒液，同 時設不加干擾素的陰性對照和不加病毒的空白對照，吸附Ih后棄去上清，加入含2%小牛 血清的維持液，置于37°C，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)致病毒陽性孔細胞病變達75%， 約24h，置倒置顯微鏡下觀察結果，以最后的記錄結果為最終的結果，據(jù)Reed-Muench公式 算干擾素效價。試驗重復三次。將抑制50%細胞病變的干擾素的最高稀釋度定為1個干擾 素單位。A、(2) SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測復合豬α干擾素在ΡΚ-15細胞上抗 PRV的活性待ΡΚ-15細胞在24孔細胞培養(yǎng)板中長成單層后，傾去營養(yǎng)液，用維持液洗兩遍，每 孔加入用含10%小牛血清的1640營養(yǎng)液稀釋10_6的復合豬α干擾素各100 μ L。將細胞 培養(yǎng)板置于5% C02，37°C細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后傾去上清，用維持液洗兩遍，每孔加 入100 μ L 1000TCID50/mlPRV病毒液，同時設不加干擾素的陰性照和不加病毒的空白對照， 吸附Ih后棄去上清，加入含2%小牛血清的維持液，置于37°C，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù) 培養(yǎng)24h后提取病毒DNA。用Takara公司病毒DNA提取試劑盒按其操作說明書提取PRVDNA，溶于30ml超純 水中，用于SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測。在ABI公司7300型全自動實時熒光定 量PCR儀上擴增并檢測熒光。同時采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參。所 用的 PCR 引物 GAPDH-F 5-ACTCACTCTTCTACCTTTGATGCT-3 ；GAPDH-R 5-TGTTGCTGTAGCCAAATTCA-3 ；PRV-F 5-CTCGCCATCGTCAGCAA-3 ；PRV-R :-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3。25 μ LPCR 反應體系中含 2XSYBR Green PCRMasterMix 12. 5 μ L, 10pmol/L 的上、下游引物各 1 μ L, DNA2 μ L, 2. 5mMdNTP2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0. 25 μ L，超純水 6. 25 μ L。擴增參數(shù)為95 °C 30s，95°C 10s,55 °C 15s、 72 °C 30s，共40個循環(huán)。反應結束后，進行熔解曲線的測定，反應條件為95°C 15s、 60°C lmin、95°C 15s、60°C 15s。反應結束后通過 ABI PRISM7300SDS software (Applied Biosystems)軟件分析數(shù)據(jù)。本實驗中采用2_Δ 法進行PRV的相對定量。即提取PRV的DNA作10倍梯度稀 釋(稀釋范圍為IOi-IO6TCID5ciAiI)的樣品做出標準曲線，由此確定各組所用的稀釋度，同時 測得各組樣品的ct值，然后采用2_ΔΔ"相對定量公式，經(jīng)內(nèi)參基因GAPDH的內(nèi)均一化處理 后即可算出各組樣品相對于對照組樣品的表達量。B、(1)抗 VSV 的結果在ΡΚ-15細胞上接水皰性口炎病毒24小時后觀察可見陽性對照孔完全出現(xiàn)100%嚴重病變，而加入進行10倍倍比稀釋的酵母表達的復合豬α干擾素的細胞孔中，IO8未見 任何細胞病變，陰性對照孔中的PK細胞未見異常。從上述結果得出復合豬α干擾素的生 物學活性為1.716Χ108，天然豬a干擾素的生物學活性為3. 873X 106，復合豬α干擾素的 生物學活性是天然豬α干擾素的生物學活性的44. 4倍；表2復合豬α干擾素與天然豬a干擾素的活性比較
天然豬a千擾素復合豬a干擾素
~比活性(U/mg)比活性(U/mg)
1 1. 778X 10s1. 000X108 B、(2) SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測復合豬α干擾素在ΡΚ-15細胞上抗 PRV的活性結果取各組接毒24h后的細胞懸液抽提病毒DNA后進行熒光定量PCR。采用
進行PRV的相對定量，圖6顯示，接入干擾素的細胞孔中的PRVmRNA水平顯著低于對照組中 的水平，與對照組相比，接入復合豬α干擾素和天然豬α干擾素的細胞孔中PRVmRNA的水 平分別降低了 37倍和14倍。根據(jù)以上實驗結果可以說明新型復合豬α干擾素已被成功研制出來，本研究為 復合豬α干擾素在養(yǎng)豬業(yè)中的應用奠定了基礎。
權利要求
一種復合豬α干擾素基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1，大小為501bp。
2.權利要求1所述復合豬α干擾素基因的應用，包括(一)含有復合豬α干擾素基因酵母表達載體的構建與鑒定將人工合成的權利要求1所述復合豬α干擾素基因SEQ ID NO. 1加EcoR I和XbaI 兩個酶切位點后設計引物，PCR擴增該豬α干擾素基因的產(chǎn)物與pPICZ α-A酵母載體連 接后，酶切，T4DNA Ligase連接過夜，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)Ε. coli DH5a得到重組表達載 體，重組表達載體再進行雙酶切鑒定，酶切切下大小為501bp的條帶則鑒定為陽性載體， DNA序列測定完全正確的陽性載體即為構建的含有豬α干擾素基因酵母表達載體，命名為PpICZa-MPoIFNa ；(二)酵母菌畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞的制備(三)含有復合豬α干擾素基因酵母表達載體電轉化入酵母菌X-33感受態(tài)細胞取經(jīng)SacI酶線性化后的上述含有豬α干擾素基因的酵母表達載體 PpICZ a -MPoIFNa 10 μ L，與80 μ L上述酵母菌畢赤酵母Χ_33感受態(tài)細胞混勻，然后轉 移到冰預冷的0. 2cm的電轉化杯中，冰上放置5min ；將電轉化杯放在電穿孔儀上用脈沖 電流進行電擊一次，電擊結束，立即加入ImL冰預冷的Imol山梨醇，混勻，移入1. 5mL的 Eppendof管中，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)lh，然后取250 μ L轉化物涂含有100 μ g/mL博 萊霉素抗性的YPDS培養(yǎng)基平皿上，置28°C恒溫培養(yǎng)2-4天，將在YPDS培養(yǎng)基上生長的含 PpICZa-MPoIFNa載體的重組酵母菌落進行陽性鑒定；(四)含PpICZa-MPoIFN α載體重組酵母菌株的陽性鑒定(1)提取含PpICZa -MPoIFN α載體重組酵母菌株的基因組DNA(2)用來陽性鑒定的AOXl引物上游5，-gactggttccaattgagaagc-3，下游 5' -gcaaatggcattctgacatcc-3‘(3)PCR擴增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以AOXl引物為特異性引物進行PCR擴增， 獲得擴增片段總長度為1089bp的條帶，則為含有PpICZ α-MPoIFN α載體的重組酵母陽性 菌株,命名為 X-33/PpICZ α-MPoIFNa ；(五)X-3VPpICZa -MPoIFN α 的誘導表達從含有上述菌株的YPDS培養(yǎng)基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體培養(yǎng) 基中，經(jīng)28°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl = 2-6時，室溫1500rpm/min離心5min收獲菌體，將收獲的 菌體用IOOmL的BMMY培養(yǎng)液懸浮于500mL的三角瓶中，置于28°C搖床進行誘導表達，每24h 向培養(yǎng)基中補加終濃度為體積比的甲醇，以保持誘導的持續(xù)表達，在誘導72h時離心法 收集培養(yǎng)的X-33/PpICZ a -MPoIFN α表達的上清進行純化；(六)X-33/PpICZa -MPoIFN α表達產(chǎn)物的純化用45%的硫酸銨沉淀上述收集的X-33/PpICZ a-MPoIFNa的表達上清，12000rpm/ min離心30min，倒掉上清，0. 9M硫酸銨重懸蛋白沉淀，然后過疏水柱Phenyl Sepharose 6 FastFlow脫鹽，脫鹽后的蛋白再經(jīng)陰離子交換柱Q Sepharose Fast Flow純化后即得到了 本發(fā)明復合豬α干擾素基因的表達蛋白。
3.權利要求2的所述復合豬α干擾素基因的應用中所構建的酵母表達載體PpICZa-MPoIFNa。
4.權利要求2的所述復合豬α干擾素基因的應用中所獲得的X-33/PpICZ α -MPoIFN α重組酵母菌株。
5.權利要求2的所述復合豬α干擾素基因的應用中所獲得的Χ-33/ PpICZa-MPoIFNa的表達蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復合豬α干擾素基因及其重組載體，屬于基因工程生物制品技術領域。將新設計的復合豬α干擾素的基因序列重組到pPICZα-A載體，電轉化入酵母菌感受態(tài)細胞，陽性鑒定、高拷貝酵母菌株的篩選、誘導表達。采用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達外源基因，有利于豬干擾素商業(yè)化生產(chǎn)。該基因組表達的蛋白與酵母表達的天然干擾素相比，其表達量提高3.17倍。熒光定量PCR結果顯示，用10-6mg/ml該復合豬α干擾素預處理的PK-15細胞再感染PRV，其PRVmRNA水平明顯低于沒經(jīng)過復合豬α干擾素處理的PK-15細胞感染PRV后的PRVmRNA的水平，其PRVmRNA水平降低了37倍。
文檔編號C12R1/84GK101845441SQ20101012505
公開日2010年9月29日 申請日期2010年3月16日 優(yōu)先權日2010年3月16日
發(fā)明者侯鳳香, 馮秀麗, 劉珂, 周斌, 張麗穎, 曹瑞兵, 王鳳娟, 王秀花, 茅翔, 陳溥言, 魏建超, 黃麗 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學