專利名稱：防治梨枯梢病害的生防菌株sm16的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治梨枯梢病的枯草芽孢桿菌生防菌株SM16，屬于果樹(shù)病害防控 技術(shù)領(lǐng)域，專用于梨枯梢病害無(wú)公害防治。
背景技術(shù)：
梨枯梢病害是由歐文氏屬細(xì)菌引起病害，該病對(duì)于梨產(chǎn)業(yè)影響較大。病菌在梨樹(shù) 花期初侵染，受侵染花器產(chǎn)生水漬狀病斑，不久萎焉變黑枯死。在潮濕條件下，受侵染花器、 果柄、葉柄等組織上有菌膿滲出。感染的梨枝梢萎焉枯死，枯葉不脫落。枝梢枯萎發(fā)展較快， 條件適宜時(shí)，幾天內(nèi)即可擴(kuò)展15-30cm以上，造成整枝死亡。有時(shí)，病害僅局限于簇芽或新 梢，在簇芽或新梢與二年生枝梢交界處形成潰瘍斑，可能為病菌越冬提供場(chǎng)所。該病害目前 在我國(guó)發(fā)生面積及區(qū)域較小，但危害十分嚴(yán)重。梨枯梢將成為影響我國(guó)梨產(chǎn)業(yè)的重要病害 之一。目前，化學(xué)防治梨枯梢病害主要以農(nóng)用鏈霉素為主要，其防效能達(dá)到80%左右。但 是，農(nóng)用鏈霉素的長(zhǎng)期單一使用已導(dǎo)致使用次數(shù)和用藥濃度增加，也提高了病原菌產(chǎn)生對(duì) 農(nóng)用鏈霉素抗性的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，由于鏈霉素的廣譜性，大量使用不但破壞了微生態(tài)環(huán)境，而 且導(dǎo)致非靶標(biāo)抗性。歐盟已經(jīng)禁止了農(nóng)用鏈霉素在農(nóng)業(yè)中的使用，并將農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)用鏈霉 素殘留作為農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易中的壁壘。非化學(xué)性防治措施目前已成為防治梨枯梢的核 心，其中對(duì)環(huán)境友好、無(wú)農(nóng)殘、防效較好的生物防治則為最有前途的方法之一。國(guó)外利用拮 抗細(xì)菌生物防治由歐文氏病菌引起的植物病害研究報(bào)道較多，生防菌主要集中在假單胞菌 屬、芽孢桿菌屬及泛菌屬。在美國(guó)，P. fluorescens A506、P. agglomeransE325、Bacillus subtilis QST713正在進(jìn)行農(nóng)藥登記；在歐盟，生防菌劑Serenade 和Biopro 已被產(chǎn)業(yè)化 用來(lái)防治由歐文氏病菌引起的梨樹(shù)病害?，F(xiàn)有技術(shù)中按照本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液專利(公 開(kāi)專利號(hào)CN1358838，
公開(kāi)日2002年7月17日)方法，菌體可室溫保存2 3年。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是生物防治梨產(chǎn)業(yè)潛在危害較大的梨枯梢病害，通過(guò)室 內(nèi)離體和果園試驗(yàn)，篩選得到的枯草芽孢桿菌SM16的菌劑防治該病害效果較好，防效可達(dá) 50%以上。技術(shù)方案一種防治梨枯梢病害的生防菌株SM16，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis), 2009年6月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為 CGMCC NO. 3127。生防菌株SM16用于制備生防菌劑的方法為1)將該菌株接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)180rpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時(shí)后在超 凈工作臺(tái)中分別取樣測(cè)600nm處的0D值，測(cè)定過(guò)程中以未接菌的培養(yǎng)液來(lái)調(diào)零；2)當(dāng)培養(yǎng)至0D值在0.5 0.8之間時(shí)，將種子菌液以1 100體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 24小時(shí)，發(fā)酵液pH值維持在7. 0， 溶氧量20%，通氣量5-7m7小時(shí)，罐壓0. 05-0. lKPa。然后6000rpm離心lOmin，每1000ml 培養(yǎng)液獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4X 10"1 1015個(gè)菌體，取濕菌與菌體保藏液按 lg 40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為1X109 lX1012cfu/ml。其中
種子培養(yǎng)LB培養(yǎng)液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH 值為7. 0 ； 發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖2. 5g/L，玉米粉5g/L，黃豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，二水 氯化鈣0. 5g/L，一水硫酸錳0. 5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 ；菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20非 離子型表面活性劑。有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對(duì)梨枯梢病害開(kāi)發(fā)的生防制 劑。由于是生物制劑，完全沒(méi)有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來(lái)的一系列問(wèn)題，因而有利于梨的無(wú) 公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開(kāi)支，而且有利 于梨的出口貿(mào)易。溫室離體花試驗(yàn)顯示，生防菌SM16生防菌劑噴霧至自然發(fā)病花表面，能有效防治 病害，防效達(dá)66.81% (表1)；室內(nèi)離體葉片試驗(yàn)顯示，SM16生防菌劑能有效抑制自然發(fā) 病梨嫩葉上病斑的延伸(圖2.)；自然發(fā)病果園試驗(yàn)中，噴霧生防菌劑SM16防效顯著，高達(dá) 60-70% (表 2)。該菌劑用濕菌與本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液(屬本實(shí)驗(yàn)室已授權(quán)專利，專利號(hào) ZL02112559. 7，公開(kāi)專利號(hào)CN1358838，
公開(kāi)日:2002年7月17日)按1 40 (g/ml)配成 菌劑，可室溫保存2 3年。該菌劑于梨花盛開(kāi)前稀釋噴霧防治病害，也可以將菌劑原液涂 布于梨枯梢病害引起的潰瘍斑上，有效抑制梨枯梢病原菌的越冬。
四

圖1.生防菌劑SM16離體花防治效果(A.清水處理對(duì)照組；B.生防菌劑SM16處理組)圖2.生防菌劑SM16離體葉片防治效果(A.清水處理對(duì)照組；B.生防菌劑SM16處理組)圖3.生防菌劑SM16果園防治效果(A.清水處理對(duì)照組；B.生防菌劑SM16處理組)
五具體實(shí)施例方式一種防治梨枯梢病害的生防菌株SM16，分離于江蘇省鎮(zhèn)江市水稻田中，為枯草芽 孢桿菌(Bacillus subtilis)，細(xì)胞桿狀，成鏈狀排列，端口成圓形，芽孢橢圓或圓形，單芽 孢，兼性好氧，能利用鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露醇、木糖、麥芽糖、D-果糖、D-甘 露糖、山梨糖，最適生長(zhǎng)溫度35-37°C，菌落成乳白色，邊緣整齊，表面有皺褶、隆起，菌落表 面干燥，G+，菌落不透明，M. R試驗(yàn)、V. P試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，可利用丙二酸鹽。生防菌株SM16用于制備生防菌劑的方法為
1)將該菌株接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)180rpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時(shí)后在超 凈工作臺(tái)中分別取樣測(cè)600nm處的0D值，測(cè)定過(guò)程中以未接菌的培養(yǎng)液來(lái)調(diào)零，LB培養(yǎng)液 配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 ；2)當(dāng)培養(yǎng)至0D值在0. 5 0. 8之間時(shí)，將種子菌液以1 100體積比加入裝有 發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 24小時(shí)，發(fā)酵液pH值維持在 7.0，溶氧量20%，通氣量5-7m7小時(shí)，罐壓0.05-0. lKPa。然后6000rpm離心lOmin，每 1000ml培養(yǎng)液獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4X 101(1 1015個(gè)菌體，取濕菌與菌體保藏液 按lg 40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為1X109 lX1012cfu/ml。發(fā)酵培養(yǎng)液配方 麥芽糖2. 5g/L，玉米粉5g/L，黃豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，二水氯化鈣0. 5g/L，一水硫酸錳 0. 5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0。菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含 有濃度為0. 001mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。下面將結(jié)合試驗(yàn)相關(guān)結(jié)果圖，進(jìn)行實(shí)施方案解釋(1)離體花試驗(yàn)自然發(fā)病梨園中選取開(kāi)花數(shù)為25%的花束，室內(nèi)培養(yǎng)評(píng)價(jià)生防菌劑SM16的防病 潛能。花梗浸在10%的蔗糖溶液中，生防菌培養(yǎng)后滅菌水調(diào)至108CFU/ml細(xì)噴霧至花束表 面約形成水層；100%濕度保濕3天后，統(tǒng)計(jì)各處理發(fā)病情況并計(jì)算防效。(2)離體葉片試驗(yàn)自然發(fā)病梨園采集葉片進(jìn)行離體試驗(yàn)。葉片置于托盤后噴霧接種108CFU/ml的生 防菌劑SM16，20 u 1，試驗(yàn)設(shè)立噴霧清水作為對(duì)照組。處理后保濕3天后，觀察葉片發(fā)病情 況。(5)果園防治試驗(yàn)生防菌株劑SM16發(fā)酵制成生防菌劑后稀釋其濃度為108CFU/ml用手動(dòng)噴霧器細(xì) 噴霧至花器上。梨樹(shù)開(kāi)花25%期，第一次噴霧防治；梨樹(shù)開(kāi)花75%期，第二次噴霧防治。試 驗(yàn)以農(nóng)用鏈霉素為化學(xué)藥劑處理組。各處理5次重復(fù)，處理組隨機(jī)排列。梨枯梢病害為自 然發(fā)病，10天后調(diào)查各處理病害嚴(yán)重度統(tǒng)計(jì)防治效果。試驗(yàn)結(jié)果(1)離體花試驗(yàn)生防劑SM16噴霧處理3天后，統(tǒng)計(jì)各處理花束總數(shù)和發(fā)病花束數(shù)，計(jì)算生防菌的 防治效果為66. 81 %。生防菌劑SM16處理組花束發(fā)病較少，而清水對(duì)照組花束全部發(fā)病，變 黑。見(jiàn)圖1。表1.溫室離體花試驗(yàn)防治效果 (2)離體葉片試驗(yàn)處理3天后，觀察葉片發(fā)病情況結(jié)果顯示，自然發(fā)病葉片只做清水處理對(duì)照組葉片變黑腐爛而生防菌劑SM16處理組葉片發(fā)病情況較輕，與清水處理對(duì)照組差異顯著。結(jié)果 如圖2.(3)生防菌劑SM16果園防治梨枯梢效果梨樹(shù)花期噴霧防治2次，能有效控制病害發(fā)生，防治效果達(dá)67. 97%，與農(nóng)用鏈霉 素效果相當(dāng)，見(jiàn)表2.建議梨產(chǎn)業(yè)中可用生防菌劑SM16替代農(nóng)用鏈霉素或者交替使用。統(tǒng) 計(jì)觀察發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)病梨樹(shù)花全部受侵染脫落，嫩葉也萎焉、變黑，濕度大時(shí)可見(jiàn)明顯菌膿 出現(xiàn)。處理組中，梨花正常授粉長(zhǎng)出幼果。部分花受病原菌侵染死亡，有些花瓣出現(xiàn)枯死， 但不會(huì)影響其正常坐果?？梢?jiàn)生防菌SM16效果較好(圖3.)。表2.生防菌劑SM16果園防治效果
權(quán)利要求
一種防治梨枯梢病生防菌株SM16，是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，2009年6月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNO.3127。
2.權(quán)利要求1所述生防菌株SM16制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求2所述生防菌劑在防治梨枯梢病害的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述生防菌株SM16用于制備生防菌劑的方法，包括(1)將該菌株接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)180rpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時(shí)后在超凈工 作臺(tái)中分別取樣測(cè)600nm處的0D值，測(cè)定過(guò)程中以未接菌的培養(yǎng)液來(lái)調(diào)零；(2)當(dāng)培養(yǎng)至0D值在0.5 0.8之間時(shí)，將種子菌液以1 100體積比加入裝有發(fā)酵培 養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 24小時(shí)，發(fā)酵液pH值維持在7. 0，溶氧 量20%，通氣量5-7m7小時(shí)，罐壓0. 05-0. lKpa ；然后6000rpm離心lOmin，每1000ml培養(yǎng)液 獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4X101(I 1015個(gè)菌體，取濕菌與菌體保藏液按lg 40ml 配成菌劑，成品中活菌總濃度為1X109 lX1012cfu/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生防菌株SM16制備生防菌劑的方法，其中，種子培養(yǎng)LB培養(yǎng)液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為(7. 0 ；發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖2. 5g/L，玉米粉5g/L，黃豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，二水氯化 鈣0. 5g/L，一水硫酸錳0. 5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，調(diào)節(jié)pH值為(7. 0 ；菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20非離子 型表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治梨枯梢病生防菌株SM16，屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。該菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，將該菌接種于培養(yǎng)液中，30℃250rpm發(fā)酵20～24小時(shí)，然后6000rpm離心10min，取濕菌與菌體保藏液按1∶40(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012cfu/ml。果園使用時(shí)，于梨花25％和75％開(kāi)放時(shí)，菌劑兌水稀釋至1×108cfu/ml噴施花表面。該菌劑對(duì)梨枯梢病害防效達(dá)57-68％以上。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101864377SQ201010125070
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者李師默, 郭堅(jiān)華, 陳云 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)