專利名稱：基因槍多載體共轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因方法，尤其涉及一種將多個(gè)目的基因轉(zhuǎn)至受體植物的方法。
背景技術(shù)：
利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以沖破物種的界限，實(shí)現(xiàn)物種間的基因傳遞，并能改良現(xiàn)有的物種的生物性狀，最大限度為人類服務(wù)。 隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)以前所未有的速度飛速進(jìn)步，人們已經(jīng)不在滿足于單個(gè)基因成功插入原有生物的基因組中，而是把目光放在插入基因的成功表達(dá)和產(chǎn)生有效的生理功能方面。然而自然界的生物是非常復(fù)雜的有機(jī)整體，許多功能性狀并不是單一基因簡(jiǎn)單調(diào)控的。即使象海藻一樣簡(jiǎn)單的雙糖，在酵母中的代謝途徑也需要4個(gè)基因產(chǎn)物的直接參與。更何況，生物體處于復(fù)雜的自然界中，病害，蟲害，各種各樣的自然災(zāi)害隨時(shí)都可能發(fā)生。因此，培育多抗性的物種就需要基因工程利用其"改造生物體和創(chuàng)造新生命"的主要優(yōu)勢(shì)，對(duì)現(xiàn)有的生物體進(jìn)行改造和創(chuàng)新。多基因轉(zhuǎn)化研究是獲得多抗性物種和使多基因控制性狀發(fā)生改變或補(bǔ)充生物體代謝途徑的主要基因工程技術(shù)手段。
傳統(tǒng)的多基因轉(zhuǎn)化指克隆在同一載體分子上的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)化。缺點(diǎn)包括①多基因載體的構(gòu)建和組裝面臨著一系列的技術(shù)難題，如載體容量、大片段DNA的定點(diǎn)切割與連接。②受插入位點(diǎn)的限制，不能再后代中發(fā)生分離。③農(nóng)桿菌方法是傳統(tǒng)多基因轉(zhuǎn)化的主要方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法要受到宿主細(xì)胞的限制，應(yīng)用范圍也就受到相應(yīng)的限制，同時(shí)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法在轉(zhuǎn)化過程中受到細(xì)菌生長(zhǎng)引起的副作用，抑菌一直就是轉(zhuǎn)化過程中普遍存在的技術(shù)弱點(diǎn)。 目前，基因槍轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)成為繼農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化之后的另一普遍應(yīng)用的方法。基因槍轉(zhuǎn)化方法是一種向植物體內(nèi)轉(zhuǎn)入DNA的直接有效方法。基因槍轉(zhuǎn)化方法克服了農(nóng)桿菌受體范圍的限制，具有可以轉(zhuǎn)化幾乎所有的細(xì)胞和組織的特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單易行，轉(zhuǎn)化所用的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，同時(shí)可以消除應(yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)引起的副作用，轉(zhuǎn)化的過程只需要少量的DNA，有在轉(zhuǎn)化后的幾天內(nèi)就可以檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)?；驑尫梢越?br> 決許多不能利用其他方法轉(zhuǎn)化的植株的轉(zhuǎn)基因問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種獲得多抗性物種，使多基因控制性狀發(fā)生改變或補(bǔ)充
生物體代謝途徑和不受生物組織類型限制的新的基因槍多載體共轉(zhuǎn)化方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的先獲得分別克隆在不同載體上的多個(gè)基因，利
用基因槍轉(zhuǎn)化法把所有的載體一同轉(zhuǎn)入植物組織或細(xì)胞中，對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選
后的植物組織或細(xì)胞再生，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。 具體采用以下步驟 1.利用植物組織或細(xì)胞作為靶組織或細(xì)胞，轟擊前，將植物組織或細(xì)胞接入高滲
3培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中部，滲透處理，即可進(jìn)行轟擊； 2.利用基因槍對(duì)植物組織或細(xì)胞進(jìn)行轟擊； 3.材料轟擊后，繼續(xù)滲透，然后轉(zhuǎn)至原培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)； 4.繼代一次后，接入合適選擇壓力的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，再生后獲得轉(zhuǎn)基因植 株； 5.對(duì)獲得的初步篩選的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR篩選鑒定。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是 本發(fā)明不受生物組織類型限制，可以轉(zhuǎn)化幾乎所有的細(xì)胞和組織，還可以同時(shí)轉(zhuǎn) 化任意數(shù)目的質(zhì)粒，對(duì)克隆策略、載體要求低，同時(shí)可以消除應(yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌生長(zhǎng) 引起的副作用，轉(zhuǎn)化的過程只需要少量的DNA，可以在轉(zhuǎn)化后的幾天內(nèi)就可以檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá) 的結(jié)果?；驑尪噍d體共轉(zhuǎn)化方法可以解決許多不能利用其他方法轉(zhuǎn)化的植株的轉(zhuǎn)基因問 題。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明在具體應(yīng)用時(shí)，根據(jù)受體材料的不同，采用不同的高滲培養(yǎng)基，不同的轟擊 參數(shù)，和適合不同受體材料的培養(yǎng)基。對(duì)受體材料進(jìn)行篩選時(shí)，根據(jù)所用載體含有的篩選標(biāo) 記基因進(jìn)行篩選，初篩后用PCR進(jìn)行篩選鑒定。下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行說明
實(shí)施例l: 玉米基因槍多載體共轉(zhuǎn)化。材料自交系H99 ;培養(yǎng)基MSZ培養(yǎng)基為基礎(chǔ)；基因及 載體1301-amtlI，3300-GSl，3300-AAPl，3300-SAG12(篩選標(biāo)記都為Bar)。剝離玉米幼胚， 盾片朝上，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天，用6天的胚性愈傷組織300塊作為靶組織。將胚性愈 傷組織接入0. 2M甘露醇高滲培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)皿中部，直徑約2. 5cm，滲透處理4小時(shí)，即 可進(jìn)行轟擊。DNA包裹金粉在E卯endorf管中取金粉(1 y m) 50mg(100次)加入lml無水 乙醇，震蕩洗滌5min，靜止15min后，15000rpmX5秒，離心后棄盡乙醇。加入lml無菌雙蒸 水，使金粉重新懸浮lmin，靜止lmin， 15000rpmX 5秒，離心后棄盡無菌雙蒸水，重復(fù)3次，然 后加入lml無菌雙蒸水，使終濃度為50mg/ml。取制備好的金粉100 y 1 (10次)繼續(xù)渦旋 5min以打破金粉凝集，邊渦旋邊加入10iU(4種不同質(zhì)粒按照1 :1:1: l混合)質(zhì)粒 DNA溶液(1 y g/ y 1)混勻后分別加入100 ii 1氯化鈣(2. 5M高壓滅菌)禾P 40 yl亞精氨溶 液(0. 1M抽濾滅菌)，繼續(xù)渦旋3min，在室溫下放置10min，離心3min (1000r/min)，棄去上 清，加入lml無水乙醇，震蕩洗滌5min，15000rpmX5秒，重復(fù)兩次，最后用120 yl 100%乙 醇溶液混勻即可上樣，每載玻片用量10yl。PDS-1000/He型基因槍操作。每皿轟擊兩次，受 體材料距阻擋網(wǎng)9cm，27inchHg，氦氣壓力為1100psi。材料轟擊后，繼續(xù)滲透24小時(shí)。然 后轉(zhuǎn)至原培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)(25°C ) 1周。繼代一次后，10天后將其接入3mg/L(Basta)選 擇壓力的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。25t:黑暗條件下連續(xù)篩選3次，每輪10天。得到抗性愈傷組 織115塊，在無篩選劑的恢復(fù)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)一次。10天后將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng) 基上，25t:下由弱光逐漸向強(qiáng)光進(jìn)行過渡，10天后繼代一次。在之后的繼代過程中隨時(shí)將分 化的芽從分開，小苗長(zhǎng)至3-4cm時(shí)及時(shí)放入生根培養(yǎng)基生根。待小苗長(zhǎng)出3-4條3-5cm根 時(shí)將瓶口打開向瓶?jī)?nèi)倒入10ml水練苗，2天后將小苗取出洗凈根上附著的培養(yǎng)基，移入澆 透水的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，外面用透明的塑料薄膜罩起來保持濕度，3天后逐漸掀去薄膜，5天后將營(yíng)養(yǎng)缽拿到溫室練苗，7天后將小苗帶土一起移入花盆。待移栽植株長(zhǎng)到4-5片葉時(shí)，取葉 片進(jìn)行PCR檢測(cè)得到6個(gè)四基因轉(zhuǎn)化株系，10個(gè)三基因轉(zhuǎn)化株系，7個(gè)雙基因轉(zhuǎn)化株系，9個(gè) 單基因轉(zhuǎn)化株系。
權(quán)利要求
一種基因槍多載體共轉(zhuǎn)化方法，其特征是采用以下步驟完成(1)利用植物組織或細(xì)胞作為靶組織或細(xì)胞，轟擊前，將植物組織或細(xì)胞接入高滲培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中部，滲透處理，即可進(jìn)行轟擊；(2)利用基因槍對(duì)植物組織或細(xì)胞進(jìn)行轟擊；(3)材料轟擊后，繼續(xù)滲透，然后轉(zhuǎn)至原培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)；(4)繼代一次后，接入合適選擇壓力的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，再生后獲得轉(zhuǎn)基因植株；(5)對(duì)獲得的初步篩選的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR篩選鑒定。
全文摘要
一種基因槍多載體共轉(zhuǎn)化方法，涉及一種植物轉(zhuǎn)基因方法，由以下步驟完成，1、利用植物組織或細(xì)胞作為靶組織或細(xì)胞；2、利用基因槍對(duì)植物組織或細(xì)胞進(jìn)行轟擊；3、材料轟擊后，繼續(xù)滲透，然后轉(zhuǎn)至原培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)；4、繼代一次后，接入合適選擇壓力的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，再生后獲得轉(zhuǎn)基因植株；5、對(duì)獲得的初步篩選的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR篩選鑒定。本發(fā)明方法可以轉(zhuǎn)化幾乎所有的細(xì)胞和組織，還可以同時(shí)轉(zhuǎn)化任意數(shù)目的質(zhì)粒，對(duì)克隆策略、載體要求低，同時(shí)可以消除應(yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)引起的副作用。
文檔編號(hào)C12N15/87GK101768605SQ20101012553
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者孫傳波, 孟凡梅, 曲文麗, 李海華, 袁英, 郭嘉, 陶蕊 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院