專利名稱：人表皮生長因子受體外顯子19及21突變檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用PCR技術(shù)檢測人基因組表皮生長因子受體(EGFR)外顯子19、 21突變的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
肺癌目前是世界范圍內(nèi)發(fā)生率和死亡率第一的惡性腫瘤，雖經(jīng)多年努力，總的治療效果仍不樂觀。進入二i^一世紀以來，以表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)為靶標的分子靶向藥物的出現(xiàn)為肺癌的治療帶來了新的希望和手段，以 Gefitinib (商品名易瑞沙，由阿斯利康公司生產(chǎn))和Erlotinib (商品名特羅凱，由羅氏公司生產(chǎn))為代表的酪胺酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor, TKI)是目前被多國批準并被廣泛應(yīng)用于進展或難治性非小細胞肺癌的小分子靶向藥物。最初的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，經(jīng)化療失敗的非小細胞肺癌病人對TKI藥物治療的總有效率可達10%以上，而對TKI藥物有效的病人可在癥狀改善、病灶控制和生存時間等方面獲得明顯益處。東方人種、腺癌、女性和不吸煙是TKI藥物治療的優(yōu)勢人群，通過這種優(yōu)勢人群的選擇可使TKI藥物的有效性升高到40%以上。2004年，在“科學”和“新英格蘭醫(yī)學雜志”等期刊上發(fā)表了幾篇關(guān)于EGFR突變與TKI藥物敏感性關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)EGFR突變的病人使用TKI藥物的有效性高達71-100%?，F(xiàn)在已有許多大型醫(yī)療中心正在采用EGFR檢測進行TKI藥物治療病人的選擇，實踐證明，通過EGFR檢測可使TKI的有效率提高到80%以上。目前有關(guān)EGFR突變的檢測方法采用的均是核苷酸測序方法，即對EGFR外顯子19 和21進行PCR擴增，之后對PCR產(chǎn)物進行測序。應(yīng)用核苷酸測序的方法檢測EGFR外顯子 19和21突變有如下缺點1)如果樣本基因組DNA發(fā)生的是EGFR雜合性突變，就會出現(xiàn)兩種PCR產(chǎn)物，而基因測序一般只能測出其中一種產(chǎn)物的序列。因此這種方法的缺點是1)不能檢測出雜合子的情況幻在雜合子情況下，測序信號可能有紊亂。3)在雜合子存在的情況下可能出現(xiàn)假陰性，即正常的EGFR序列可能隨機成為檢測結(jié)果。應(yīng)用核苷酸測序的方法還存在費用較高，耗時較長的缺點。目前提供核苷酸測序服務(wù)的公司都集中在北京、上海等大型城市，國內(nèi)目前有許多省會城市沒有提供核苷酸測序服務(wù)的公司，這將導致檢測周期過長的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決在檢測EGFR突變中存在的上述問題，我們發(fā)明了一種直接用PCR法即可以檢測出EGFR突變情況的技術(shù)，該技術(shù)的要點是，直接根據(jù)EGFR外顯子19、21已知存在的 3個突變類型的突變位點設(shè)計出特異性引物，特異性引物只擴增相對應(yīng)的突變類型，經(jīng)過電泳即可鑒定是哪一類的類型突變。與前述的測序方法相比，該方法經(jīng)濟、簡單、快速，根據(jù) EGFR正常序列的引物還可以清晰地判斷出突變類型是雜合性突變還是純合性突變。根據(jù)Gene Bank檢索人EGFR 19、21外顯子的正常核苷酸序列，根據(jù)相應(yīng)文獻報道確定EGFR外顯子19、21突變的序列。EGFR外顯子19突變類型為E746-A750缺失突變、 L747-S752缺失突變；EGFR外顯子21為L858R點突變。根據(jù)這些突變的核苷酸序列設(shè)計特異性引物，用于擴增特異性的核苷酸序列。本發(fā)明設(shè)計的引物如下EGi7R 外顯子 19 野生型上游引物5、tcccgtcgctatcaaggaattaag外顯子 19E746-A750 缺失突變上游引物5~ gttaaaattcccgtcgctatcaaaa夕卜顯子 19L747-A752 缺失突變上游弓丨物5~ gttaaaattcccgtcgctatcaagacEGFR 外顯子 19 通用下游引物5、GCTCA CCAAG AGCAC TCACT CATCA 3、EGFR 外顯子 21 野生型上游引物5~ CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT 3、EGFR 外顯子 21L858R 突變上游引物5~ CATGT CAAGA TCACA GATTT TGGGCG 3、EGFR 夕卜顯子 21 通用下游弓丨物5、cagtggaccaccaaggcagctgtgac取病人血液標本，提取基因組，應(yīng)用常規(guī)PCR反應(yīng)條件做PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物做電泳檢測，即可判斷出其是否發(fā)生突變，突變的類型、突變?yōu)榧兒闲赃€是雜合性。根據(jù)上述引物所設(shè)計的PCR試劑盒，可用于人基因組中EGFR外顯子19和21常見突變的檢測。


圖1 :EGFR外顯子19、L858R野生型PCR產(chǎn)物電泳圖泳道1 :DNA Marker 2000 ；泳道2 =EGFR外顯子19野生型，可見約360nt長度的PCR產(chǎn)物；泳道3 外顯子19E746-A750缺失突變，無PCR產(chǎn)物；泳道4 外顯子19L747-A752缺失突變型；無PCR產(chǎn)物；泳道5 :EGFR外顯子21野生型，可見415nt長度的PCR產(chǎn)物；泳道6 =EGFR外顯子21L858R突變型；無PCR產(chǎn)物。圖2 =EGFR外顯子19E746-A750缺失突變型PCR產(chǎn)物電泳圖泳道1 :DNA Marker 2000 ；泳道2 =EGFR外顯子19野生型，可見約360nt長度的PCR產(chǎn)物；泳道3 外顯子19E746-A750缺失突變，可見約!350nt長度PCR產(chǎn)物；泳道4 外顯子19L747-A752缺失突變上游引物，無PCR產(chǎn)物；泳道5 :EGFR外顯子21野生型，可見415nt長度的PCR產(chǎn)物。泳道6 :EGFR外顯子21L858R突變型，無PCR產(chǎn)物。圖3 =EGFR外顯子19L747-A752缺失突變型PCR產(chǎn)物電泳圖泳道1 :DNA Marker 2000 ；泳道2 =EGFR外顯子19野生型，可見約360nt長度的PCR產(chǎn)物；泳道3 外顯子19E746-A750缺失突變型，無PCR產(chǎn)物；泳道4 外顯子19L747-A752缺失突變型，可見約!350nt長度PCR產(chǎn)物泳道5 :EGFR外顯子21野生型，可見415nt長度的PCR產(chǎn)物。圖4 =EGFR外顯子子21L858R突變型PCR產(chǎn)物電泳圖泳道1 :DNA Marker 2000 ；
泳道2 =EGFR外顯子19野生型，可見約360nt長度的PCR產(chǎn)物；泳道3 外顯子19E746-A750缺失突變型，無PCR產(chǎn)物。泳道4 外顯子19L747-A752缺失突變型，無PCR產(chǎn)物。泳道5 :EGFR外顯子21野生型，可見415nt長度的PCR產(chǎn)物。泳道6 :EGFR外顯子21 L858R突變型，可見415nt長度的PCR產(chǎn)物。
具體實施例方式實施例1應(yīng)用引物特異性PCR法檢測臨床病人EGFR外顯子19、21突變材料寡核苷酸引物均有北京中美泰和有限公司合成，引物名稱和序列如下EGi7R 外顯子 19 野生型上游引物5、tcccgtcgctatcaaggaattaag外顯子 19E746-A750 缺失突變上游引物5~ gttaaaattcccgtcgctatcaaaa夕卜顯子 19L747-A752 缺失突變上游弓丨物5~ gttaaaattcccgtcgctatcaagacEGFR 夕卜顯子 19 通用下游弓丨物gctcaccaagagcactcactcatcaEGFR 外顯子 21 野生型上游引物5~ catgtcaagatcacagatttgggctEGFR 外顯子 21L858R 突變上游引物5~ catgtcaagatcacagattttgggcgEGFR 外顯子 21 通用下游引物5~ CAGTG GACCA CCAAG GCAGC TGTGA C 3、血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒均購自北京天根生物技術(shù)有限公司；病人血液標本均來自吉林大學第一醫(yī)院。方法1)人全血基因組提取(1)用患者姓名拼音標記1. 5ml離心管、CB3吸附柱；取患者全血200ul，加入對應(yīng)的離心管內(nèi)。(2)加入20ul蛋白酶K溶液，加樣器吸打二次；加人200ul緩沖液GB，吸打二次，
蓋蓋后顛倒混勻三次；置70°水浴10分鐘，溶液應(yīng)變清亮。(3)加入200ul無水乙醇，顛倒震蕩15秒；加液體于相同標記的吸附柱內(nèi)，吸附柱放入離心管中，SOOOrpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管。(4)向吸附柱內(nèi)加入500ul緩沖液⑶，8000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回
收集管；向吸附柱內(nèi)加入700ul漂洗液PW，8000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱放回
收集管；向吸附柱內(nèi)加入500ul漂洗液PW，8000rpm離心1分鐘，棄廢液。(5)將吸附柱放回收集管內(nèi)，SOOOrpm離心5分鐘，棄廢液；室溫放置10_15分鐘； 將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的收集管中，向吸附膜中間部位滴加200ul洗脫緩沖液TE，室溫放置3分鐘，8000rpm離心4分鐘。將收集管中的液體吸出，放入標有患者姓名的1.5ml離心管內(nèi)，置4°備用。2) PCR 反應(yīng)(I)PCR反應(yīng)體系前步提取的病人基因組模板Iul ；上下游引物各Iul，終濃度0. 2uM ；dNTP Iul，水 35. 5ul，5X 緩沖液 IOul ；Taq 酶 0. 5ul。
(2)反應(yīng)條件950C 15min ；95°C 25\59°C 40\72°C 30\40cycles ；72°C 3min。3) PCR產(chǎn)物電泳將PCR產(chǎn)物行濃度瓊脂糖凝膠電泳。90V，電泳20分鐘。用凝膠成像儀拍攝電泳結(jié)果。結(jié)果電泳結(jié)果顯示，可檢測出EGFR外顯子正常及各種突變情況，和核苷酸測序鑒定的
結(jié)果一致。附圖中圖1-圖4的PCR產(chǎn)物電泳圖的病人標本分別鑒定為EGFR外顯子19野生型、外顯子19E746-A750缺失突變型、外顯子19L747-A752缺失突變型、EGFR外顯子21 L858R突變型。各種缺失類型均為雜合性缺失。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測人基因組表皮生長因子受體外顯子19及21突變用途的PCR方法， 該PCR方法的特征是，其引物是由可以特異性擴增人基因組表皮生長因子受體外顯子19 及21野生型和突變型的引物組成，這里的外顯子19及21野生型和突變型是指外顯子 19E746-A750缺失突變、外顯子19L747-A752缺失突變、EGFR外顯子21L858R突變?nèi)N突變類型。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述引物為上游引物，為SEQNO. 1-5所示序列的核苷酸。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述引物是以SEQNO. 1-5為核心序列的核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的引物是化學修飾的引物，這里的化學修飾包括但不限于部分硫代修飾、全硫代修飾。
5.權(quán)利要求1-4任一所述的方法用于制備用于檢測人基因組表皮生長因子受體外顯子19及21突變試劑盒的用途。
6.按照權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的試劑盒是用于指導酪氨酸激酶受體抑制劑類抗癌藥物臨床應(yīng)用的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用PCR技術(shù)檢測人基因組表皮生長因子受體(EGFR)外顯子19、21突變的檢測試劑盒，該試劑盒由EGFR外顯子19、21正常引物和突變引物組成的PCR反應(yīng)試劑盒，可用于檢測人雪中EGFR突變的各種形式。
文檔編號C12Q1/68GK102199657SQ201010131040
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者史紅艷, 孫延波, 李菁華, 溫劍平 申請人:吉林大學