專利名稱：基于蛋白質(zhì)三聚化模序的高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外源蛋白的表達(dá)方法，尤其涉及一種高分泌性三聚體蛋白的表達(dá) 方法，屬于三聚體蛋白的表達(dá)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
絕大多數(shù)分泌性蛋白質(zhì)的氨基端都有一段15 35個氨基酸的信號肽 (signalp印tide)，其功能是引導(dǎo)新生的蛋白質(zhì)多肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。信號 肽在穿越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜后即被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的信號肽酶水解切除，此時新生多肽鏈開始折疊及其 他一系列修飾過程，再通過囊泡系統(tǒng)進(jìn)入高爾基體完成進(jìn)一步修飾，最終形成成熟的分泌 蛋白。可見，對于分泌性蛋白而言，只有確保信號肽及時準(zhǔn)確地切除，才能在細(xì)胞內(nèi)生成足 夠量的活性蛋白，并最終獲得理想的分泌產(chǎn)量(Li，Y.，et al. ,Viral liposomes released from insect cells infected withrecombinant baculovirus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus. J Virol,1993. 67(7) :p. 4415-20. Kypr, J. and J. Mrazek, Unusual codon usage ofHIV. Nature, 1987. 327(6117) :p. 20.)。因此篩選具有 相對實用性廣和可高效率引導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌表達(dá)的信號肽序列是優(yōu)化蛋白質(zhì)外源表達(dá)的關(guān) 鍵策略之一。基于信號肽可介導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌及可在不同蛋白質(zhì)間互通使用的特點(diǎn)，可以通 過優(yōu)化信號肽序列或引入外源高分泌性信號肽來提高目的蛋白的產(chǎn)量和分泌效率。人組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)的信號肽(Met -Asp-Ala-Met-Lys-Arg-Gly-Leu-Cys-Cys-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Gly-Ala-Val-Phe-Val-Ser-Pro-Ser)是目前應(yīng)用最廣泛的外源性信號肽之一。tPA信號肽具有強(qiáng)分泌信號肽的典 型特征1)信號肽N端有兩個正電荷氨基酸，介導(dǎo)信號肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜信號肽受體的識別；2) 序列中部主要由疏水氨基酸組成疏水核心，具有形成α螺旋的傾向，有利于信號肽與脂質(zhì) 雙層作用，引導(dǎo)新生肽穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；3)序列C末端靠近切割處主要由極性氨基酸組成，形 成β折疊，容易斷裂，符合信號肽酶的切割位點(diǎn)的特點(diǎn)。由于上述特征，tPA信號肽往往作 為外源性信號肽應(yīng)用于人體內(nèi)或體外人類細(xì)胞系中目的蛋白的分泌表達(dá)。Chapman等首次將tPA信號肽作為外源性分泌信號應(yīng)用于HIV-1包膜糖蛋 白(envelope glycoprotein, Env)的體外表達(dá)，其構(gòu)建策略是刪除目的蛋白的信號肽 序列，將tPA信號肽引入目的蛋白的氨基端。用tPA信號肽替換Env原有信號肽后， Env 蛋白分泌水平顯著上升(Chapman, B. S.，et al.，Effect of intron A fromhuman cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expressionin mammalian cells. Nucleic Acids Res，1991. 19 (14) :p. 3979-86.)。隨后的研究進(jìn)一 步表明，tPA引導(dǎo)的Env蛋白的免疫原性明顯強(qiáng)于野生株Env蛋白(Pfeiffer，Τ.，et al. , Effects of signal peptide exchange on HIV-I glycoprotein expression and viral infect ivity in mammalian cells. FEBS Lett, 2006. 580 (15) :p. 3775-8.)。截止目 前，tPA信號肽也廣泛用于結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌、輪狀病毒、日本腦炎病毒、痘苗病 毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒等多種細(xì)菌、病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的分泌表達(dá)，均不同程度地提高了目的蛋白的表達(dá)量和免疫原性。2003年，中國國家知識產(chǎn)權(quán)局公開了四個SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒 pVPH(CN1449827)、pVPM(CN1449828)、pVPS (CN1449829)、pVPS2 (CN1449831)。其構(gòu)建策略 是將tPA信號序列插入SARS病毒M基因、HE基因、S基因或S蛋白抗原決定簇基因的N末 端，再將融合基因克隆至原核或真核表達(dá)載體，作為SARS病毒的DNA疫苗候選。上述關(guān)于tPA信號肽的應(yīng)用和專利主要利用了 tPA信號肽的高效分泌特性，其研 究對象是蛋白質(zhì)的一個亞基或一個亞單位，獲得的目的蛋白以分泌形式表達(dá)至細(xì)胞外。但 是，對于天然狀態(tài)下以三聚體形式存在的蛋白質(zhì)，如HIV-IEnv蛋白、SARS病毒S蛋白、流感 病毒血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)等，除了需要實現(xiàn)蛋白的分泌表達(dá)之外，還必須考慮 如何模擬和維持蛋白質(zhì)的天然三聚體結(jié)構(gòu)，以便研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能、提高蛋 白質(zhì)的免疫原性。然而，截止目前，國內(nèi)尚無以tPA作為外源信號肽引導(dǎo)三聚體蛋白分泌表 達(dá)的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服三聚體蛋白質(zhì)在表達(dá)過程中所存在的分泌效 率不高、三聚體產(chǎn)物比例小，純度低等問題，提供一種可廣泛應(yīng)用的分泌性三聚體蛋白質(zhì)的 表達(dá)方法，該方法所表達(dá)的目的蛋白能高效分泌表達(dá)，同時還可模擬和維持蛋白的三聚體 構(gòu)象，三聚體產(chǎn)物比例大，純度高。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法，包括以下步驟(1)將tPA信號肽基因序列、目的蛋白基因和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列連接在 一起，三者位于同一讀碼框內(nèi)，得到融合基因；其中，目的蛋白的N末端與tPA信號肽相連， 目的蛋白的C末端與蛋白質(zhì)三聚化模序N末端相連；(2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表達(dá)載體，構(gòu)建得到融合蛋 白的原核或真核表達(dá)載體；(3)利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)，體內(nèi)或體外表達(dá)融合蛋白，即得。上述表達(dá)方法中，所述的蛋白質(zhì)三聚化模序的氨基酸序列為SEQ ID NO :2所示，編 碼蛋白質(zhì)三聚化模序的基因序列可以為SEQ ID NO 1所示；該三聚化模序(MTI)的三聚化 趨勢強(qiáng)，三聚化程度高，分子量小，對目的蛋白的結(jié)構(gòu)影響很小，可廣泛應(yīng)用于三聚化蛋白 質(zhì)的表達(dá)。所述的tPA信號肽的氨基酸序列為SEQ ID NO 4所示；編碼該tPA信號肽的基因 序列為SEQ ID NO 3所示。當(dāng)然，含有tPA信號肽基因序列(SEQ ID NO 3)和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列 (SEQ ID NO 1)的任何一種重組原核或真核表達(dá)載體都落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明通過向目的蛋白的氨基端引入一個組織性纖溶酶原激活物tPA的信號肽 序列以及向目的蛋白的羧基端引入一個三聚化蛋白模序MTI，形成一個新組合，實現(xiàn)目的蛋 白在原核或真核細(xì)胞高水平分泌及三聚化表達(dá)。本發(fā)明方法的主要優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用1、本發(fā)明表達(dá)方法可廣泛用于天然構(gòu)象為三聚體的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究。
2、本發(fā)明所涉及的表達(dá)方法可用于天然以三聚體形式存在的蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而 篩選與三聚體目的蛋白相互作用的配體分子。3、本發(fā)明表達(dá)方法可用于構(gòu)建和表達(dá)天然以三聚體形式存在的病毒表面抗原，產(chǎn) 物可作為DNA免疫原，用于體內(nèi)表達(dá)，構(gòu)建候選基因疫苗；表達(dá)產(chǎn)物可作為蛋白免疫原，構(gòu) 建候選亞單位疫苗，有潛在的遠(yuǎn)期社會和經(jīng)濟(jì)效益。4、本發(fā)明表達(dá)方法可用于天然以三聚體形式存在的病毒表面蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn) 物可用于診斷試劑的開發(fā)并應(yīng)用于病毒性疾病的診斷，將產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是tPA信號肽和三聚化模序MTI引入目的蛋白的模式圖；圖2是將融合蛋白基因引入表達(dá)載體的模式圖；圖3A-3D是目的蛋白在293T細(xì)胞瞬時表達(dá)及鑒定的結(jié)果圖；其中，圖3A是目的蛋 白在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的檢測結(jié)果(以GAPDH為內(nèi)參照)；圖3B是目的蛋白在培養(yǎng)上清中的 檢測結(jié)果；圖3C是細(xì)胞裂解產(chǎn)物中目的蛋白的相對化學(xué)發(fā)光(ECL)信號強(qiáng)度，以HAlwt轉(zhuǎn) 染細(xì)胞中目的蛋白的信號強(qiáng)度為100%。圖3D是細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的相對化學(xué)發(fā)光 信號強(qiáng)度，以HAlwt轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)上清中目的蛋白的信號強(qiáng)度為100% ；圖4A-4B是融合蛋白表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后三聚化融合蛋白在細(xì)胞培 養(yǎng)上清中分泌表達(dá)及鑒定的結(jié)果圖；其中，圖4A是非還原PAGE的檢測結(jié)果；圖4B是圖 HAl-MTI泳道中各個聚合形式目的蛋白相對百分比構(gòu)成。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證 的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1本實施例所述的三聚化模序MTI的氨基酸序列是=Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-L yS-Glu-Glu-IIe-Ala-Lys-IIe-LyS-Glu-Glu-IIe-Ala-Lys-IIe-Lys-Glu-Lys-IIe-Ala-Gl u-IIe-Glu-Lys-Arg-IIe-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys-Arg-IIe-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys(SEQ ID No 2)。本實施例所述的tPA信號肽的氨基酸序列是=Met-Asp-Ala-Met-Lys-Arg-Gly-Le u-Cys-Cys-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Gly-Ala-Val-Phe-Val-Ser-Ala-Ser(SEQ ID No :4)。一、流感病毒血凝素蛋白HAl亞基與MTI的融合重組體的構(gòu)建1、獲取目的基因首先提取流感病毒A/Hong Kong/8/68 (購自美國ATCC)總RNA， 以獲得的總RNA為模板，進(jìn)行RT反應(yīng)產(chǎn)生cDNA ；再以cDNA為模板，利用引物HAlUP (TACAGGA TCCGCCATGAAGACTATCATTGCT)和 HA1D0WN(TCTAGCTAGCAGTTTGTTTCTCTGGTACATTTCGC)PCR 擴(kuò) 增保留天然信號肽的HAl基因，或利用引物HAlEUP (CGACGAATTCCAAAAACTTCCT GGAAATGAC) 和引物HA1D0WN PCR擴(kuò)增刪除信號肽序列的HAl基因。反應(yīng)條件為98°C 15s，60°C 10s， 72°C 2min，共 30 個循環(huán)，DNA聚合酶為 PrimeStar HS DNA Polymerase (購自日本TaKaRa)。2、融合重組體的構(gòu)建再將純化后的天然HAl基因克隆至載體pcDNA3. 1⑴(購自 美國Invitrogen)獲得天然HAl蛋白表達(dá)載體HAlwt ；將編碼MTI蛋白的基因(GGAGGTTCTG
5GAGGGATTAAAGAGGAGATTGCCAAAATCAAAGAAGAAATAGCTAAGATCAAAGAGAAGATAGCTGAGATTGAAAAG AGAATCGCAGAAATTGAMAGAGAATTGCTGGCGGTTGTTGC) (SEQ ID No 1)合成于載體 pcDNA3. 1 (+) 的多克隆位點(diǎn)EcoR I, Xho I之間獲得載體pcMTI，再將tPA信號肽編碼基因(ATGGATGCAA TGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGGCCAGC) (SEQ ID No 3)合成 至pcMTI上獲得載體pcT-MTI，再將純化后的不含信號肽序列的HAl基因克隆至pcT-MTI上 獲得融合蛋白表達(dá)載體HAl-MTI，其中tPA基因C末端與HAl基因的N末端相連，HAl基因 的C末端與MTI的N末端相連，三者位于同一讀碼框內(nèi)。二、融合蛋白的表達(dá)1、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗將人胚腎293T細(xì)胞(購自美國ATCC)以5X105個/孔的密 度鋪于6孔板內(nèi)，置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面積 的85% -90%時，將4μ g HAl重組質(zhì)粒HAlwt或重組質(zhì)粒HAl-MTI轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，所 用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen)，轉(zhuǎn)染操作參考試劑說明書。2、表達(dá)產(chǎn)物的收獲轉(zhuǎn)染后72h，將Iml 293T細(xì)胞培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至2. Oml離心管 內(nèi)，3000 Xg離心5min，棄去細(xì)胞碎片，將離心上清分裝于0. 5ml離心管中，于_40°C保存。 用PBS簡單洗滌細(xì)胞層，消化并收獲細(xì)胞沉淀。向細(xì)胞沉淀中加入ΙΟΟμ IlXlysis buffer 裂解細(xì)胞，10000 Xg離心lOmin，將離心上清轉(zhuǎn)移至0. 5ml離心管中，于_40°C保存。三、利用特異性抗體通過western blotting方法檢測產(chǎn)物中的重組蛋白1、SDS-PAGE電泳向100 μ 1收獲的細(xì)胞裂解產(chǎn)物或細(xì)胞上清中加入 20 μ 16X loading buffer (0. 35M Tris-HCl ρΗ6· 8，30 % 甘油，10 % SDS，0· 012 % 溴酚藍(lán)， 6% β-巰基乙醇)，充分混勻，100°C煮沸5min后，4°C 8000Xg，離心lOmin，取40μ 1離心 上清加載至12% SDS-PAGE凝膠中，160V電泳lh。細(xì)胞裂解產(chǎn)物以GAPDH為內(nèi)參照調(diào)整樣 品上樣量，培養(yǎng)上清各泳道總蛋白上樣量為250 μ g。2、非還原PAGE電泳向125 μ 1收獲的細(xì)胞上清中力Π入25 μ 1 6Xnon-reducedloading buffer (0. 35M Tris-HCl ρΗ6· 8，30 % 甘油，10 % SDS，0· 012 % 溴酚藍(lán))，充分混勻，100°C煮沸2min后，4°C 8000Xg,離心lOmin，蛋白樣品加載至8 % SDS-PAGE凝膠中，160V電泳lh。各泳道總蛋白上樣量均為900 μ g。3,ffestern blotting 電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉于 37°C封閉2h。封閉后的PVDF膜與兔抗HA單克隆抗體(1 1000，購自美國CST)于4°C過 夜孵育，再與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG于37°C孵育lh。加入過氧化物酶 底物，顯示蛋白條帶。實驗結(jié)果如圖3、圖4所示。圖3是目的蛋白在293T細(xì)胞瞬時表達(dá)及鑒定的結(jié)果圖。其中，圖3A是目的蛋 白在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的檢測結(jié)果(以GAPDH為內(nèi)參照)，圖3B是目的蛋白在培養(yǎng)上清中 的檢測結(jié)果(各泳道總蛋白上樣量均為250yg)。各自的第一泳道是天然形式目的蛋白 HAl (60KD)；各自的第二泳道是tPA信號肽替換及引入MTI后表達(dá)的目的蛋白HAl (60KD)； 各自的第三泳道是陰性對照。圖3C是細(xì)胞裂解產(chǎn)物中目的蛋白的相對化學(xué)發(fā)光(ECL)信號 強(qiáng)度，以HAlwt轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白的信號強(qiáng)度為100%。圖3D是細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋 白的相對化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，以HAlwt轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)上清中目的蛋白的信號強(qiáng)度為100%。從圖3可見，轉(zhuǎn)染72h后，HAl-MTI轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)量較HAlwt轉(zhuǎn)染組
6提高2. 25倍(圖3A，圖3C)，分泌至上清中的目的蛋白較HAlwt轉(zhuǎn)染組提高1. 24倍(圖 3B,圖 3D)。圖4是融合蛋白表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后三聚化融合蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)上清 中分泌表達(dá)及鑒定的結(jié)果圖。其中，圖4A是非還原PAGE的檢測結(jié)果，第一泳道是HAlwt轉(zhuǎn) 染組培養(yǎng)上清中檢測到的單體形式目的蛋白，第二泳道是HAl-MTI轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清中檢測 到的單體、二聚體和三聚體形式目的蛋白，第三泳道是陰性對照，各泳道總蛋白上樣量均為 900 μ g。圖4B是HAl-MTI泳道中各個聚合形式目的蛋白相對百分比構(gòu)成。從圖4可見，HAl-MTI轉(zhuǎn)染上清中目的蛋白多以三聚體的形式存在，其構(gòu)成比為 58 %，具有優(yōu)勢，產(chǎn)物純度較高?？梢?，tPA信號肽與三聚化模序MTI組合后，不僅提高目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的表達(dá) 量，同時提高了三聚體蛋白的分泌水平，實現(xiàn)了目的蛋白的高效性三聚化分泌表達(dá)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，對本發(fā)明而言僅僅是說明性的，而非限制性 的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變， 修改，甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將tPA信號肽基因序列、目的蛋白基因序列和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列連接在一起，得到融合基因；其中，目的蛋白的N末端與tPA信號肽相連，目的蛋白的C末端與蛋白質(zhì)三聚化模序蛋白N末端相連；(2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表達(dá)載體，構(gòu)建得到融合蛋白原核或真核表達(dá)載體；(3)利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)，體內(nèi)或體外表達(dá)融合蛋白，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)三聚化模序的氨基酸 序列為SEQ ID NO 2所示。
3.按照權(quán)利要求2所述的表達(dá)方法，其特征在于，編碼蛋白質(zhì)三聚化模序的基因序列 為 SEQ ID NO 1 所示。
4.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述的tPA信號肽的氨基酸序列為 SEQ ID NO 4 所示。
5.按照權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于，編碼所述tPA信號肽的基因序列為 SEQ ID NO 3 所示。
6.一種重組原核或真核表達(dá)載體，其特征在于，包括tPA信號肽基因序列和蛋白質(zhì)三 聚化模序基因序列。
7.按照權(quán)利要求6所述的原核或真核重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)三聚 化模序的基因序列為SEQ ID NO 1所示。
8.按照權(quán)利要求6所述的原核或真核重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的tPA信號肽的 基因序列為SEQ ID NO 3所示。
9.權(quán)利要求6-8任何一項所述的重組原核或真核表達(dá)載體在表達(dá)三聚體蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法。該表達(dá)方法包括(1)將tPA信號肽基因序列、目的蛋白基因和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列連接在一起；其中，目的蛋白的N末端與tPA信號肽相連，其C末端與蛋白質(zhì)三聚化模序蛋白N末端相連；(2)將融合基因克隆至原核或真核表達(dá)載體，得到融合蛋白原核或真核表達(dá)載體；(3)體內(nèi)或體外表達(dá)融合蛋白，即得。本發(fā)明通過向目的蛋白的氨基端引入一個組織性纖溶酶原激活物tPA的信號肽序列以及向其羧基端引入一個三聚化蛋白模序MTI，實現(xiàn)目的蛋白在原核或真核細(xì)胞高水平分泌及三聚化表達(dá)，獲得功能性蛋白。本發(fā)明可廣泛用于天然以三聚體形式存在的病毒以及其他蛋白在原核或真核細(xì)胞的分泌性高水平表達(dá)。
文檔編號C12N15/79GK101948864SQ20101013309
公開日2011年1月19日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者凌虹, 李妍, 楊丹, 王甲業(yè), 程德春, 陳文江 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)