專利名稱：Her2基因擴增檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳腺癌HER2基因擴增檢測試劑盒，特別是涉及HER2基因?qū)崟r熒光聚合酶鏈式反應(yīng)檢測試劑盒。本試劑盒能對HER2基因擴增水平進行檢測，可廣泛用于由 HER2基因擴增所致的乳腺癌的輔助診斷，指導(dǎo)臨床用藥以及預(yù)后等多個研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳腺癌是發(fā)生于全球婦女中最常見的癌癥，全球每年新增病例100萬例，每年有近400，000人死于乳腺癌。根據(jù)衛(wèi)生部腫瘤防治辦公室提供的2006年我國腫瘤發(fā)病率和十大惡性腫瘤發(fā)病率排序顯示，乳腺癌位居女性惡性腫瘤發(fā)病首位，且發(fā)病年齡有年輕化趨勢。盡管當(dāng)前乳腺癌治療已有長足的發(fā)展，但是絕大多數(shù)的治療效果仍不滿意，乳腺癌綜合治療和個體化治療成為多年來人們關(guān)注的熱點。表皮生長因子受體-2 (Epidermal growth factor rec印tor_2，HER2)，是一種位于乳腺和乳腺癌細胞表面的受體，能夠控制癌細胞的生長、浸潤和癌細胞的轉(zhuǎn)移，大約20% 的乳腺癌病例中存在HER2基因和/或蛋白水平增加，它是乳腺癌的獨立預(yù)后因子，在乳腺癌的靶向治療和預(yù)后判斷中的作用已經(jīng)得到了全世界臨床醫(yī)生的認可。HER2陽性的腫瘤是一種高危腫瘤，HER2癌基因的擴增預(yù)示病情進展迅速，局部復(fù)發(fā)的危險性高，化療緩解期短，無病生存期(DFS)和總生存期(OS)縮短，對某些常規(guī)的化療和激素治療反應(yīng)性差。目前最為常用并經(jīng)FDA批準的適用于治療HER2過度表達或HER2基因擴增的乳腺癌的藥物是曲妥珠單抗(赫賽汀)，由于這種藥物只有針對HER2基因擴增和蛋白過度表達的病人才有效，因此準確評價HER2基因和蛋白水平至關(guān)重要。乳腺癌患者HER2水平檢測已經(jīng)成為常規(guī)的臨床檢測指標(biāo)，目前經(jīng)美國FDA批準的檢測方法主要有兩種免疫組化(IHC)法測定HER2過表達(Here印test/Dako)；熒光原位雜交(FISH)法檢測HER2基因擴增(Path Vision/Vysis) 0目前醫(yī)院廣泛開展的免疫組化 (IHC)檢測方法不能完全正確的判斷患者HER2的狀態(tài)。因為即使IHC(3+)的患者中也有 10%左右的沒有HER2基因擴增，而這部分病人無法從赫塞汀的治療中獲益，不僅造成很高的經(jīng)濟損失，而且耽誤了應(yīng)用其他方案的機會。而IHC(O)、(1+)中也有將近10%左右的假陰性的情況存在，對于這部分患者，將失去獲得有效治療方案的機會。在《乳腺癌臨床實踐指南(中國版)》2007年第一版中的HER2檢測原則中指出IHC方法或FISH技術(shù)都可用于腫瘤HER2基因擴增狀態(tài)的首次評估，IHC檢測結(jié)果呈交界性的樣 本(如IHC++)應(yīng)通過已接受過驗證的其他方法(如FISH)進行再次檢測，而國內(nèi)只有少數(shù)醫(yī)院有能力開展此項檢查， 而且FISH檢測試劑被國外公司壟斷，價格十分昂貴，多數(shù)病人都無法承擔(dān)如此高昂的檢測費用，而失去了獲得準確、規(guī)范的檢測結(jié)果的機會。因此必須尋找一種應(yīng)用簡單、結(jié)果可靠、 價格低廉的技術(shù)來開發(fā)HER2檢測試劑盒以解決上述問題，我們經(jīng)過多種方法的對比評估， 選擇了實時熒光PCR技術(shù)。實時熒光PCR技術(shù)是一種直接檢測核酸的分子生物學(xué)技術(shù)，具有靈敏度高，特異性好，簡便，廉價等優(yōu)點。本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)中的雙色熒光PCR方法，根據(jù)熒光PCR相對定量的原理，即用兩種互不干擾的熒光染料分別標(biāo)記目標(biāo)基因和內(nèi)參基因，在目標(biāo)基因和內(nèi)參基因擴增效率一致的前提下在同一管中進行二者的擴增，最后根據(jù)ACt計算待檢基因的相對拷貝數(shù)，從而判斷其是否出現(xiàn)基因擴增或者缺失等異常情況。本發(fā)明涉及的試劑盒可廣泛運用于乳腺癌患者HER2基因擴增水平的檢測，作為免疫組化方法的可靠補充，提高病理檢測 的可重復(fù)性和準確性，更準確的篩查出適宜曲妥珠單抗藥物治療方案的乳腺癌患者，可以大大地降低醫(yī)療成本和費用，減少醫(yī)療資源的浪費，延長部分患者生存期，提高患者生存質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測乳腺癌HER2基因擴增的試劑盒。本發(fā)明在對GENBANK上所有已知的HER2和備選內(nèi)參基因的核酸序列進行比對的基礎(chǔ)上，尋找HER2和備選內(nèi)參基因的核酸序列的特異性保守區(qū)，并針對保守區(qū)設(shè)計HER2和內(nèi)參基因的靶多核苷酸引物和探針。這些引物探針在含有耐熱DNA聚合酶、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+等的PCR反應(yīng)緩沖液中，通過熒光PCR擴增儀實現(xiàn)體外核酸的循環(huán)擴增，篩選出與HER2基因擴增一致的內(nèi)參基因APP基因，根據(jù)△ Ct計算待檢基因的相對拷貝數(shù)，從而達到快速檢測HER2基因擴增狀態(tài)的目的。本發(fā)明所涉及的試劑盒中主要包括1)PCR反應(yīng)液、Taq酶系、HER2陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是PCR反應(yīng)液由PCR反應(yīng)緩沖液、一對HER2特異性的正、反向引物、一條HER2特異性的探針、一對APP特異性的正、反向引物、一條APP特異性的探針組成，其特征在于用于HER2靶多核苷酸擴增的正向和反向引物的序列分別是 5’ -CTGGAGGACGATGACATGTG-3’ (SEQ ID NO 1)禾口 5’ -CTGGACAGAAGAAGCCCTGC-3’ (SEQ ID NO 2)，用于熒光PCR擴增和監(jiān)測體系的HER2基因寡核苷酸探針，其序列是5，-TGG TGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCC-3，(SEQ ID NO :3)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團TAMRA ；用于APP靶多核苷酸擴增的正向和反向引物的序列分別是 5，-AGGTTGACGCCGCTGTTC-3，(SEQ ID NO 4)和 5，-CGTAGCCGTTCTGCTGCTT-3，(SEQ ID N0:5)，用于熒光PCR擴增和監(jiān)測體系的APP基因寡核苷酸探針，其序列是 5’-CCCAGAGGAGCGCCACCTGAC-3’ (SEQ ID NO :6)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團HEX 和熒光淬滅基團TAMRA。HER2基因和APP基因具有相同的擴增效率。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是PCR反應(yīng)緩沖液由TriS-HCl (50mmol/L,ρΗ8. 0)、 MgCl2 (8mmol/L)、KCl (250mmol/L)、甲酰胺(5% )禾Π dNTPs (25mmol/L)組成。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是所用引物探針的濃度均為lOymol/L。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是Taq酶系可采用市售的產(chǎn)品，如Qiagen公司產(chǎn)品，其中每人份試劑Taq酶的用量為3U。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是PCR擴增的條件為94°C 3分鐘；94°C 30秒， 580C 45秒，10個循環(huán)；94°C 15秒，58°C，1分鐘，35個循環(huán)。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是試劑盒中陰性質(zhì)控品為經(jīng)免疫組化方法和PCR 方法證明為HER2擴增陰性的乳腺癌組織DNA，HER2陽性質(zhì)控品為經(jīng)免疫組化方法和PCR 方法證明為HER2擴增陽性的乳腺癌組織DNA，用紫外分光光度計分別測定260nm的吸光度(0D260)和280nm的吸光度(0D280)，要求1. 60 < 0D260/0D280 < 2. 10。試劑盒中進行待檢標(biāo)本檢測同時進行兩種質(zhì)控品的檢測，僅當(dāng)HER2陽性質(zhì)控品檢測呈陽性，陰性質(zhì)控品檢測呈陰性時，待檢標(biāo)本的檢測結(jié)果才有效。本發(fā)明的試劑盒在擴增待檢標(biāo)本時，內(nèi)參基因與目的基因均會產(chǎn)生閾循環(huán)值(即 Ct值)，通過計算內(nèi)參基因與目的基因的Ct值的差值即△ Ct值，可實現(xiàn)對乳腺癌組織標(biāo)本中的HER2基因擴增水平進行檢測。本發(fā)明中所選用的內(nèi)參基因在組織中的表達比較穩(wěn)定， 因此Δ Ct值的大小表示乳腺癌組織標(biāo)本中HER2基因的擴增程度。0《Δ Ct <0.5表示乳腺癌組織中HER2基因無擴增；0. 5《Δ Ct < 1表示乳腺癌組織中HER2基因有擴增；Δ Ct彡1 表示乳腺癌組織中HER2基因存在明顯擴增，且ACt值越大說明HER2基因擴增水平越高。 檢測過程由市售的熒光定量PCR儀自動完成，操作簡單，耗時少，且最大限度地減少了污染的發(fā)生。檢測結(jié)果可用于由于HER2基因擴增導(dǎo)致的乳腺癌的輔助診斷、藥物治療及預(yù)后等多個領(lǐng)域研究。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點為①可對HER2基因擴增水平進行檢測，真實反映出患者體內(nèi)HER2基因擴增的狀態(tài)，有助于疾病的早期診斷和治療，并可用于監(jiān)測治療效果和評估患者預(yù)后；②熒光PCR技術(shù)針對該基因特異性序列設(shè)計引物、探針，與免疫組化 (IHC)法相比具有更高的特異性，與FISH法相比具有操作簡便、價格低廉的優(yōu)點，更適用于大多數(shù)乳腺癌患者的檢測；③閉管檢測不需PCR后處理，避免了由于樣本間的交叉污染引起的假陽性和環(huán)境污染。


圖1顯示PCR擴增的條件的反應(yīng)條件。圖2顯示試劑盒陰性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中的擴增曲線為重疊較好的S型曲線， 且0《ACt < 0. 5，說明檢測樣本中沒有HER2基因的擴增。圖3顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴增曲線。圖中擴增曲線為S型曲線，且ACt值大于1，說明檢測體系可以有效地檢測到HER2基因的擴增。圖4顯示4例陰性樣本的擴增曲線。圖中同一樣本的擴增曲線為重疊的S型曲線， 且0《Δ Ct < 0. 5，說明4例陰性樣本中的HER2基因均無擴增。圖5顯示3例陽性樣本的擴增曲線。圖中擴增曲線均為S型曲線，且ACt值均大于0. 5，說明3例陽性樣本中HER2基因均存在擴增或明顯擴增。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1HER2基因擴增檢測試劑盒及其使用1、制備包括下列組成成分的試劑盒PCR反應(yīng)液(820μ 1/管)1管，Ta q酶系 (80 μ 1/管)1管，陽性質(zhì)控品(30 μ 1/管)1管，陰性質(zhì)控品(30 μ 1/管)1管。2、標(biāo)本的采集、保存和運輸2. 1適用標(biāo)本類型石蠟包埋組織，冰凍組織。2. 2標(biāo)本采集術(shù)后腫瘤組織立即冰凍并保存與-20°C或者按常規(guī)處理為石蠟包埋組織。
2. 3標(biāo)本的保存和運送石蠟包埋組織可長期保存于室溫；新鮮組織保存在-20°C 待測，保存期為6個月。標(biāo)本長途運送采用干冰。3、核酸提取建議使用Qiagen DNA提取試劑盒。按照QIAamp DNA Kit說明書進行，最后收集到50μ1 DNA溶液，直接進行檢測或保存于-20°C。4、實時熒光定量PCR擴增及檢測4. 1試劑準備按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液、Taq酶系(PCR反應(yīng)液43 μ 1/人份 +Taq酶系2 μ 1/人份)，充分混勻后按45 μ 1/管分裝成PCR反應(yīng)管，備用。4. 2加樣向PCR反應(yīng)管中，分別加入提取后的DNA溶液5 μ 1，或者陰、陽性質(zhì)控品 5μ 1，并蓋緊管蓋，放入儀器樣品槽。4. 3 編輯(ABI Prism 7500 熒光定量 PCR 儀)打開Setup窗口，按對應(yīng)順序設(shè)置陰、陽性質(zhì)控品和待測標(biāo)本，并在Name欄中設(shè)置樣品名稱。選中所有設(shè)置樣品孔，雙擊，選擇Add Detector，選擇R印orter為FAM和 Quencher 為 TAMRA，再選擇 R印orter 為 HEX 和 Quencher 為 TAMRA 后關(guān)閉窗口。在 Passive Reference中選擇(none)。打開instrument窗口設(shè)置循環(huán)條件94°C 4分鐘；4°C 30秒， 580C 45秒；10個循環(huán)；94°C 15秒，58°C 1分鐘；30個循環(huán)(見附圖1)。所有設(shè)置完成后保存文件,運行。4. 4結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。在Results下打開Amp plot窗口。選擇分析的目的樣品所在位置。將Baseline數(shù)值改為start :3，stop 10，并打開manual設(shè)定Threshold 1.5 士 100000。雙擊 Rn 坐標(biāo)上數(shù)值打開 Graph settings 窗口，將 Post Run Settings 中 Log 改為 Linear, OK 后打開 Analysis preferences 窗□,在 Analysis 菜單下選擇 Analyze 自動分析結(jié)果。實施例2應(yīng)用HER2基因擴增檢測試劑盒檢測臨床樣品選取4例經(jīng)過FISH方法檢測為HER基因擴增陰性，3例經(jīng)過FISH方法檢測為HER2 基因擴增陽性的標(biāo)本，標(biāo)本核酸提取、PCR擴增及結(jié)果分析參照實施例1進行，同時進行陰、 陽性質(zhì)控品的檢測。檢測結(jié)果解釋陰性質(zhì)控品的擴增曲線為重疊較好的S型曲線，且0《ACt < 0. 5， 說明陰性質(zhì)控品中沒有HER2基因的擴增(見附圖2)。陽性質(zhì)控品的擴增曲線為S型曲線， 且ACt值太于1，在試劑盒質(zhì)控范圍內(nèi)，說明檢測體系可以有效地檢測到HER2基因的擴增 (見附圖3)。陰陽性質(zhì)控品在同一實驗中均符合試劑盒的質(zhì)控要求。4例經(jīng)過FISH方法檢測為HER2基因擴增陰性的標(biāo)本經(jīng)檢測，擴增曲線為重疊的S 型曲線，且0《ACt<0.5，說明4例陰性樣本中的HER2基因均無擴增(見附圖4)。3例經(jīng)過FISH方法檢測為HER2基因擴增陽性的標(biāo)本經(jīng)檢測，擴增曲線均為S型曲線，且ACt值均大于0. 5，說明3例陽性樣本中HER2基因均存在擴增或明顯擴增(見附圖5)。本次實驗中7例標(biāo)本的檢測結(jié)果與FISH方法的檢測結(jié)果完全吻合，說明利用本試劑盒檢測標(biāo)本中的HER2基因擴增水平是可行的。與FISH檢測方法對比，本試劑盒操作簡便、檢測時間短，可實現(xiàn)大通量檢測，加之其價格低廉，能夠被大多數(shù)乳腺癌患者所承受。
權(quán)利要求
1.一種乳腺癌HER2基因擴增檢測試劑盒，由1)PCR反應(yīng)液、Taq酶系、HER2陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒組成，其中PCR反應(yīng)液由 PCR反應(yīng)緩沖液、一對HER2特異性的正、反向引物、一條HER2特異性的探針、一對APP特異性的正、反向引物、一條APP特異性的探針組成，其特征在于HER2特異性的正、反向引物的序列分別是 5，-CTGGAGGACGATGACATGTG-3，和 5，-CTGGACAGAAGAAGCCCTGC-3，，HER2 特異性探針的序列是5，-TGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCC-3，，APP特異性的正、反向引物的序列分別是 5，-AGGTTGACGCCGCTGTTC-3，和 5，-CGTAGCCGTTCTGCTGCTT-3，，APP 特異性探針的序列是 5，-CCCAGAGGAGCGCCACCTGAC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)緩沖液由Tris-HCl(50mmol/L， ρΗ8· 0)、MgCl2 (8mmol/L)、KCl (250mmol/L)、甲酰胺(5% )和 dNTP (25mmol/L)組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于所用引物探針的濃度均為Ιθμπιο /L，每人份試劑Taq酶的用量為3U。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴增的條件為94°C3分鐘；94°C 30 秒，580C 45秒，10個循環(huán)；94°C 15秒，58°C，1分鐘，35個循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于陰性質(zhì)控品為經(jīng)免疫組化方法和PCR方法證明為HER2擴增陰性的乳腺癌組織DNA，HER2陽性質(zhì)控品為經(jīng)免疫組化方法和PCR方法證明為HER2擴增陽性的乳腺癌組織DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于試劑盒在擴增待檢標(biāo)本時，通過計算ACt 值對乳腺癌組織標(biāo)本中的HER2基因擴增水平進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳腺癌HER2基因擴增檢測試劑盒，特別是涉及HER2基因?qū)崟r熒光聚合酶鏈式反應(yīng)檢測試劑盒，該試劑盒利用實時熒光PCR技術(shù)，通過計算ΔCt值對乳腺癌組織標(biāo)本中的HER2基因擴增水平進行檢測，可用于乳腺癌的輔助診斷，臨床以及預(yù)后等多個研究領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK102199659SQ201010133919
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者李明, 鄧艷華, 陳華云 申請人:中山大學(xué)達安基因股份有限公司