專利名稱：造血祖細胞的制備方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種造血祖細胞的制備方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術：
人胚胎干細胞有自我更新和分化為所有體細胞的能力(Thomson，J. Α., Itskovitz-Eldor, J. , Shapiro, S. S. , Waknitz, Μ. Α. , Swiergiel, J. J. , Marshall, V. S., and Jones, J. Μ. (1998). Embryonic Stem Cell Lines Derived from HumanBlastocysts. Science觀2，1145-1147)。這些能力意味著人胚胎干細胞可以作為人類中胚層和造血系統(tǒng)發(fā)育的研究平臺。進而，還可以為人類造血細胞的臨床移植提供穩(wěn)定的供體細胞。目前已有多個實驗室報道了人胚胎干細胞定向分化為造血細胞的方法(Murry，C. Ε.，and Keller, G. (2008). Differentiation of Embryonic Stem Cellsto Clinically Relevant Populations :Lessons from Embryonic Development. Celll32,661-680)。這些方法雖然都由人胚胎干細胞分化產生了造血干/祖細胞，但是它們的分化過程都是不確定的。這種不確定主要表現(xiàn)在采用了基質細胞共培養(yǎng)和血清培養(yǎng)基的分化體系，如滋養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)，或含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)；沒有完全模擬體內造血系統(tǒng)的發(fā)育過程。造血-內皮前體細胞(hemangioblast)是指在造血發(fā)育過程中產生的一類同時具有向造血細胞和內皮細胞兩個方向分化能力的前體細胞(Xiong，J.-W. (2008). Molecular and developmental biology of the hemangioblast. DevelopmentalDynamics 237，1218-1231.)。鑒于目前的研究均沒有完全模擬體內造血系統(tǒng)的發(fā)育過程，因此，人胚胎干細胞的體外分化仍是研究的熱點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于誘導人胚胎干細胞分化為造血祖細胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的誘導人胚胎干細胞分化為造血祖細胞的培養(yǎng)基，由分化培養(yǎng)基I，分化培養(yǎng)基II和分化培養(yǎng)基III組成；分化培養(yǎng)基I為分化培養(yǎng)基I-I或分化培養(yǎng)基1-2 ；分化培養(yǎng)基II為分化培養(yǎng)基II-I或分化培養(yǎng)基II-2 ；分化培養(yǎng)基III為分化培養(yǎng)基III-I 或分化培養(yǎng)基II1-2;所述分化培養(yǎng)基I-I為在第一階段分化培養(yǎng)基中添加骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4(BMP4)得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基I-I中的所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4的終濃度為 10-100ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基1-2為在第一階段分化培養(yǎng)基中添加骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4和 Wnt3a得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基1-2中的所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4的終濃度為 10-100ng/ml，所述 Wnt3a 的終濃度為 50_150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基II-I為在第二階段分化培養(yǎng)基中添加血管內皮細胞生長因子得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基II-I中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度為50-150ng/ ml ；所述分化培養(yǎng)基II-2為在第二階段分化培養(yǎng)基中添加血管內皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基II-2中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度為50-150ng/ml，所述堿性成纖維細胞生長因子的終濃度為50-150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基III-I為第三階段分化培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基III-2為在第三階段分化培養(yǎng)基中添加全反式視黃酸(RA)得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基III-2中的所述全反式視黃酸的終濃度為1-5 μ M ；所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4(ΒΜΡ4)可以為人骨形態(tài)發(fā)生原蛋白_4，也可以為鼠骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4;所述Wnt3a可以為人Wnt3a，也可以為鼠Wnt3a;所述血管內皮細胞生長因子(VEGF)可以為人血管內皮細胞生長因子或者鼠血管內皮細胞生長因子；所述堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)可以為人堿性成纖維細胞生長因子或者鼠堿性成纖維細胞生長因子；所述第一階段分化培養(yǎng)基為在用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎細胞培養(yǎng)基上添加牛血清白蛋白(BSA)得到的培養(yǎng)基；所述第一階段分化培養(yǎng)基中的所述牛血清白蛋白的終濃度為 0. 1-lmg/ml ；所述第二階段分化培養(yǎng)基為在所述第一階段分化培養(yǎng)基上添加胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽(ITS)、維生素C酸和硫代甘油得到的培養(yǎng)基；所述第二階段分化培養(yǎng)基中的所述胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽的終濃度為0. 5-1. 5% (體積百分含量)，所述維生素C酸的終濃度為0. 1-lmmol/l，所述硫代甘油的終濃度為0. 1-lmmol/l ；所述第三階段分化培養(yǎng)基為將所述第二階段分化培養(yǎng)基中的胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽替換成B27添加劑(B27)得到的培養(yǎng)基；所述第三階段分化培養(yǎng)基中的所述B27 添加劑的終濃度為0. 5-1. 5% (體積百分含量)。所述分化培養(yǎng)基I-I和1-2中的所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4的終濃度均可為10、 20、40、50、60、80或100ng/ml，所述分化培養(yǎng)基1_2中的所述Wnt3a的終濃度可為50、60、 80、100、120 或 150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基II-I和II-2中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度均可為 50、60、80、100、120或150ng/ml，所述分化培養(yǎng)基II-2中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度可為 50、60、80、100、120 或 150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基III-2中的所述全反式視黃酸的終濃度可為1、1. 2,1. 5、2、2. 5、 3、4 或 5μΜ;所述第一階段分化培養(yǎng)基中的牛血清白蛋白的終濃度可為0. 1、0.2、0.4、0.5、 0. 6、0· 8 或 lmg/ml ；所述第二分化培養(yǎng)基中的所述維生素C酸的終濃度可為0. 1、0.2、0.4、0.5、0.6、 0. 8或lmmol/1，所述硫代甘油的終濃度可為0. 1,0. 2,0. 4,0. 5,0. 6、0. 8或lmmol/1，所述胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽的終濃度可為0. 5%,0. 7%,0.9%U%>1. 2%、1.4%或1. 50% ；所述第三階段分化培養(yǎng)基中的所述B27添加劑的終濃度可為0.5 %、0. 7 %、 0. 9%Λ%Λ. 2%Λ. 4%或 1. 50%。所述分化培養(yǎng)基I-I和1-2中的所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4的終濃度均優(yōu)選為20-80ng/ml,尤其優(yōu)選為50ng/ml，所述分化培養(yǎng)基1_2中所述Wnt3a的終濃度優(yōu)選為 80-120ng/ml，尤其優(yōu)選為lOOng/ml ；所述分化培養(yǎng)基II-1和II-2中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度均優(yōu)選為80-120ng/ml，尤其優(yōu)選為lOOng/ml，所述分化培養(yǎng)基II-2中所述堿性成纖維細胞生長因子的終濃度優(yōu)選為80-120ng/ml，尤其優(yōu)選為lOOng/ml ；所述分化培養(yǎng)基III-2中的所述全反式視黃酸的濃度優(yōu)選為1. 2-3μΜ，尤其優(yōu)選為2μΜ ；所述第一階段分化培養(yǎng)基中牛血清白蛋白的終濃度優(yōu)選為0.4-0. 6mg/ml，尤其優(yōu)選為0. 5mg/ml ；所述第二階段分化培養(yǎng)基中的所述維生素C酸的終濃度優(yōu)選為 0. 2-0. 8mmol/l，尤其優(yōu)選為0. 5mmol/l，所述硫代甘油的終濃度均優(yōu)選為0. 2-0. 8mmol/l, 尤其優(yōu)選為0. 45mmol/l，所述胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽的終濃度優(yōu)選為0. 7-1. 2%，尤其優(yōu)選為；所述第三階段分化培養(yǎng)基中的所述B27添加劑的終濃度優(yōu)選為0. 7-1.2%，尤其優(yōu)選為；。上述基礎細胞培養(yǎng)基可選自下述至少一種培養(yǎng)基α -MEM、DMEM、DMEM/F12、 RPMI1640、F12 或 IMDM，可為 IMDM、α -MEM、DMEM、DMEM/F12、F12、RPMI1640 或其組合，優(yōu)選為IMDM和F12的組合。本發(fā)明的第二個目的是提供一種采用誘導人胚胎干細胞分化為造血祖細胞的培養(yǎng)基誘導人胚胎干細胞分化成造血祖細胞的方法，它包括以下步驟1)是將人胚胎干細胞在任一的所述分化培養(yǎng)基I-I或所述分化培養(yǎng)基1-2中培養(yǎng)；2)將由步驟1)獲得的細胞轉入任一所述的分化培養(yǎng)基II-I或所述的分化培養(yǎng)基 II-2中培養(yǎng)；3)將經步驟2)獲得的細胞轉入任一所述的分化培養(yǎng)基III-I或所述的分化培養(yǎng)基III-2中培養(yǎng)，獲得造血祖細胞。所述人胚胎干細胞具體可為表1所示的可從商業(yè)途徑得到的人胚胎干細胞系，如表1。表1.人胚胎干細胞系
權利要求
1.誘導人胚胎干細胞分化為造血祖細胞的培養(yǎng)基，由分化培養(yǎng)基I，分化培養(yǎng)基II和分化培養(yǎng)基III組成；分化培養(yǎng)基I為分化培養(yǎng)基I-I或分化培養(yǎng)基1-2 ；分化培養(yǎng)基II 為分化培養(yǎng)基II-I或分化培養(yǎng)基II-2 ；分化培養(yǎng)基III為分化培養(yǎng)基III-I或分化培養(yǎng)基 III-2 ；所述分化培養(yǎng)基I-I為在第一階段分化培養(yǎng)基中添加骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基I-I中的所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4終濃度為lO-lOOng/ml ；所述分化培養(yǎng)基1-2為在第一階段分化培養(yǎng)基中添加骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4和Wnt3a 得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基1-2中的所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4的終濃度為IO-IOOng/ ml，所述Wnt3a的終濃度為50_150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基II-I為在第二階段分化培養(yǎng)基中添加血管內皮細胞生長因子得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基II-I中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度為50-150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基II-2為在第二階段分化培養(yǎng)基中添加血管內皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基II-2中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度為50-150ng/ml，所述堿性成纖維細胞生長因子的終濃度為50-150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基III-I為第三階段分化培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基III-2為在第三階段分化培養(yǎng)基中添加全反式視黃酸得到的培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基III-2中的所述全反式視黃酸的終濃度為1_5μΜ;所述第一階段分化培養(yǎng)基為在用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎細胞培養(yǎng)基上添加牛血清白蛋白得到的培養(yǎng)基；所述第一階段分化培養(yǎng)基中的所述牛血清白蛋白的終濃度為 0. 1-lmg/ml ；所述第二階段分化培養(yǎng)基為在所述第一階段分化培養(yǎng)基上添加胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽、維生素C酸和硫代甘油得到的培養(yǎng)基；所述第二階段分化培養(yǎng)基中的所述胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽的終濃度為0. 5-1. 5 % (體積百分含量)，所述維生素C酸的終濃度為 0. 1-lmmol/l，所述硫代甘油的終濃度為0. 1-lmmol/l ；所述第三階段分化培養(yǎng)基為將所述第二階段分化培養(yǎng)基中的胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽替換成B27得到的培養(yǎng)基，所述第三階段分化培養(yǎng)基中的所述B27的終濃度為0. 5-1. 5% (體積百分含量)。
2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述分化培養(yǎng)基I-I和1-2中的所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4的終濃度均為10、20、40、 50、60、80或100叫/1111，所述分化培養(yǎng)基1-2中的所述1壯33的終濃度為50、60、80、100、120 或 150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基II-I和II-2中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度均為50、60、 80,100,120或150ng/ml，所述分化培養(yǎng)基II-2中的所述堿性成纖維細胞生長因子的終濃度為 50、60、80、100、120 或 150ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基III-2中的所述全反式視黃酸的終濃度為1、1. 2,1. 5、2、2. 5、3、4或 5μΜ ；所述第一階段分化培養(yǎng)基中的牛血清白蛋白的終濃度為0. 1,0. 2,0. 4,0. 5,0. 6,0. 8 或 lmg/ml ；所述第二分化培養(yǎng)基中的所述維生素C酸的終濃度為0. 1,0. 2,0. 4,0. 5,0. 6,0. 8或lmmol/1，所述硫代甘油的終濃度為0. 1、0. 2、0. 4、0. 5、0. 6、0. 8或lmmol/1，所述胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽的終濃度為0. 5%,0. 7%,0. 9%A%A. 2%U. 4%或1. 5% ；所述第三階段分化培養(yǎng)基中的所述B27的終濃度為0. 5%、0. 7%、0. 9%、1%、1. 2%、 1. 4%或 1. 5%。
3.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述分化培養(yǎng)基I-I和1-2中的所述骨形態(tài)發(fā)生原蛋白-4的終濃度均為20-80ng/ml， 所述分化培養(yǎng)基1-2中所述Wnt3a的終濃度為80-120ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基11_1和11_2 中的所述血管內皮細胞生長因子的終濃度均為80-120ng/ml，所述分化培養(yǎng)基II-2中所述堿性成纖維細胞生長因子的終濃度為80-120ng/ml ；所述分化培養(yǎng)基III-2中的所述全反式視黃酸的終濃度為1. 2-3 μ M ；所述第一階段分化培養(yǎng)基中牛血清白蛋白的終濃度為0. 4-0. 6mg/ml ；所述第二階段分化培養(yǎng)基中的所述維生素C酸的終濃度為0. 2-0. 8mmol/l，所述硫代甘油的終濃度為 0. 2-0. 8mmol/l，所述胰島素-轉鐵蛋白-硒鹽的終濃度為0. 7-1. 2% ；所述第三階段分化培養(yǎng)基中的所述B27的終濃度為0. 7-1. 2%。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的，其特征在于所述基礎細胞培養(yǎng)基選自下述6種培養(yǎng)基中至少一種α -MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI1640、F12 和 IMDM。
5.采用權利要求1-4中任一誘導人胚胎干細胞分化為造血祖細胞的培養(yǎng)基誘導人胚胎干細胞分化成造血祖細胞的方法，它包括以下步驟1)是將人胚胎干細胞在權利要求1-4中任一的所述分化培養(yǎng)基I-I或所述分化培養(yǎng)基 1-2中培養(yǎng)；2)將由步驟1)獲得的細胞轉入權利要求1-4中任一所述的分化培養(yǎng)基II-I或所述的分化培養(yǎng)基II-2中培養(yǎng)；3)將經步驟2、獲得的細胞轉入權利要求1-4中任一所述的分化培養(yǎng)基III-I或所述的分化培養(yǎng)基III-2中培養(yǎng)，獲得造血祖細胞。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述人胚胎干細胞為商業(yè)途徑獲得的細胞系。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述人胚胎干細胞為下述任一種細胞系BG01，BG02，BGO3, BG04, SAOl，SA02, SA03, ES01，ES02，ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04, TE06, TE62, TE07, TE72, UCOl，UC06, WAOl，WA07, WA09, WA13 和 WA14 ；所述編號為NIH的編號。
8.根據(jù)權利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)的培養(yǎng)條件為37°C培養(yǎng)1-2天，優(yōu)選為1. 5天；所述步驟2、的培養(yǎng)條件為37°C培養(yǎng)2-3天，優(yōu)選為2. 5天；所述步驟幻的培養(yǎng)條件為37°C培養(yǎng)2-4天，優(yōu)選為3天。
9.權利要求5至8中任一所述的方法獲得的造血祖細胞在制備血細胞中的應用。
10.權利要求5至8中任一所述的方法獲得的造血祖細胞在藥物毒性檢測中的應用，所述藥物毒性檢測采用的毒性藥物優(yōu)選為亞德里亞霉素或泰克索。
全文摘要
本發(fā)明提供一種造血祖細胞的制備方法及其專用培養(yǎng)基，所述專用培養(yǎng)基由分化培養(yǎng)基I-1或分化培養(yǎng)基I-2，分化培養(yǎng)基II-1或分化培養(yǎng)基II-2和分化培養(yǎng)基III-1或分化培養(yǎng)基III-2組成；所述分化培養(yǎng)基I-2為在第一階段分化培養(yǎng)基中添加人BMP4和人Wnt3a得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基II-2為在第二階段分化培養(yǎng)基中添加人血管內皮細胞生長因子和人堿性成纖維細胞生長因子得到的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基III-1為第三階段分化培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基III-2為在第三階段分化培養(yǎng)基中添加全反式視黃酸(RA)得到的培養(yǎng)基；本發(fā)明提供的方法產生的造血祖細胞適合作為人原代造血祖細胞的替代品。
文檔編號C12N5/0735GK102206610SQ201010135099
公開日2011年10月5日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權日2010年3月26日
發(fā)明者于晨, 鄧宏魁 申請人:北京華源博創(chuàng)科技有限公司, 北京大學