專利名稱：：一種大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及動物病毒培養(yǎng)技術(shù)，更具體涉及生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法。
背景技術(shù)：
：豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征，是一種危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病。2006年夏秋季，我國南方部分省份發(fā)生豬“高熱病”疫情，農(nóng)業(yè)部積極組織科研人員聯(lián)合攻關(guān)，確定豬藍(lán)耳病變異病毒為主要病原，定名為“高致病性豬藍(lán)耳病”。直至今日，疫病形勢依然嚴(yán)峻，同其他病毒性疾病一樣，目前尚無有效的治療性藥物用于藍(lán)耳病的治療，免疫接種是防制該病的最有效方法，目前商品化的藍(lán)耳病疫苗主要是由經(jīng)典株制備的弱毒苗和由變異株制備的滅活苗。而這兩種疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵點(diǎn)就是作為抗原的病毒的生產(chǎn)。病毒株生長的培養(yǎng)條件對于獲得該株系的所希望的高產(chǎn)量來說具有重大意義。為了最大化所想要的病毒的產(chǎn)量，系統(tǒng)和培養(yǎng)條件都必須特定地適合于提供對于產(chǎn)生所想要的病毒來說有利的環(huán)境。現(xiàn)有的藍(lán)耳病病毒大規(guī)模生產(chǎn)多采用轉(zhuǎn)瓶工藝，但是生產(chǎn)過程中手工操作密集，病毒株受限，細(xì)胞維持時(shí)間短，密度及活性低等問題，限制了產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量的提高和生產(chǎn)成本的降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種大規(guī)模生產(chǎn)藍(lán)耳病病毒的方法。該方法具有生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定、易操作的特點(diǎn)，病毒產(chǎn)量高，批間差異小，質(zhì)量易控制等特點(diǎn)，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明利用生物反應(yīng)器，以細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒，包括下列技術(shù)步驟(1)培養(yǎng)制備病毒用細(xì)胞將制備病毒用宿主細(xì)胞接種到含有培養(yǎng)液與微載體的載體罐，并將上述細(xì)胞與微載體混合均勻，啟動貼附程序，使細(xì)胞貼附在微載體上；切換細(xì)胞培養(yǎng)程序，在適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境下，提供上述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分和適宜的氣體環(huán)境，使細(xì)胞在上述微載體上生長至接種濃度的540倍。(2)毒液的接種與繁殖換用細(xì)胞維持培養(yǎng)液，將藍(lán)耳病病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細(xì)胞上；在適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)病毒；連續(xù)培養(yǎng)23日后，收獲病毒液，(3)經(jīng)檢驗(yàn)合格后，將收獲的病毒液于-20°C凍融兩次，滅活純化得到藍(lán)耳病病毒液。病毒液檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，完全符合，安全無副作用，無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。通過接種細(xì)胞，觀察致細(xì)胞病變作用，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒含量，每1.Oml病毒含量彡IO8-5TCID50；上述技術(shù)方案中，所述的宿主細(xì)胞為可增殖藍(lán)耳病病毒的細(xì)胞系，如猴腎細(xì)胞系(Marc-145)等。本發(fā)明方法中所述的培養(yǎng)液最好是90%99%MEM與10%牛血清的混合液，PH值為6.58.0較好，加適量抗生素。上述技術(shù)方案中，所述的適宜本發(fā)明的微載體可以為具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維，如聚酯纖維等。本發(fā)明方法中細(xì)胞獲得氣體交換的方式可以通過培養(yǎng)液液面升降的方式實(shí)現(xiàn)。上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，一般啟動貼附程序后4h換成細(xì)胞培養(yǎng)程序。所述細(xì)胞貼附程序最佳參數(shù)為up:2500mL/minholdlmin、Down:2500mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量17500mL；細(xì)胞培養(yǎng)程序最佳參數(shù)為up:1900mL/minholdlmin、Down1900mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量17500mL。上述技術(shù)方案中，步驟(1)中所述微載體用量為每500ml培養(yǎng)液添加5.5g微載體較好，細(xì)胞的初始接種量為3.04.OX107cellS/g微載體較好。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中所述接種病毒時(shí)細(xì)胞密度一般為1.5X1082.0X108cells/g微載體。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中所述接種病毒時(shí)按病毒感染復(fù)數(shù)(M.0.I.)為0.0011.5的比例。上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，一般啟動吸附程序后4h換成病毒培養(yǎng)程序，所述病毒吸附程序最佳參數(shù)為up:1700mL/minholdlmin、Down:1700mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量17500mL；病毒培養(yǎng)程序最佳參數(shù)為up:1200mL/minholdlmin、Down1200mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量17500mL。上述技術(shù)方案中，細(xì)胞與病毒培養(yǎng)溫度36.5°C37.5°C，培養(yǎng)環(huán)境中含有2.5%5%的C02。本發(fā)明方法中，潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)采用的生物反應(yīng)器主要由載體罐、儲液罐、PH控制器、DO監(jiān)測器、輸入和輸出系統(tǒng)組成。工作過程如下細(xì)胞貼附在載體罐中的載體上生長，當(dāng)儲液罐的培養(yǎng)液被泵入載體罐時(shí)，培養(yǎng)液液面上升向細(xì)胞供給養(yǎng)分并促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物的去除；當(dāng)載體罐的培養(yǎng)液泵入儲液罐時(shí)，培養(yǎng)液面隨之下降，使細(xì)胞進(jìn)行通風(fēng)，促進(jìn)呼吸，減小細(xì)胞切向壓力，無O2供應(yīng)限制，無泡沫煩惱。這個(gè)重復(fù)的運(yùn)動使載體上的細(xì)胞能夠得到足夠的營養(yǎng)和02，同時(shí)產(chǎn)生的代謝廢物如CO2能夠有效的被排出去，從而能夠大量的擴(kuò)增細(xì)胞并增值病毒，此種技術(shù)稱之為潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)。本發(fā)明所提供的一種以潮汐式細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)動物用狂犬病毒抗原的方法，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶傳代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，更具有以下優(yōu)點(diǎn)1.采用本發(fā)明方法，解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)時(shí)單批產(chǎn)量不高、批間差異大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、勞動強(qiáng)度大、生產(chǎn)成本高等問題。2.本發(fā)明方法中采用的載體為網(wǎng)狀的聚酯纖維，具有親水性和生物無害性，Ig載體約占15ml的空間，可提供2400cm2的貼壁面積，在同樣的空間內(nèi)極大的增大了細(xì)胞的貼壁面積，增加了細(xì)胞生長的密度，細(xì)胞數(shù)可達(dá)到1.0X109以上，其效能為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)的數(shù)十倍，可以節(jié)省許多成本及人力。3.本發(fā)明方法制備的細(xì)胞接種量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。4.制備的病毒毒價(jià)高傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)的藍(lán)耳病病毒效價(jià)僅為IO65TCID5tl/ml，而本發(fā)明采用新的技術(shù)參數(shù)，運(yùn)用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)高密度培養(yǎng)生產(chǎn)的病毒效價(jià)可以達(dá)到1085TCID5Q/ml，其毒價(jià)要高出100倍。具體實(shí)施方式實(shí)施例中所使用的生物反應(yīng)器為美國CESCO公司的TideCell-020型，所使用的載體為美國CESCO公司的BioNocII聚酯纖維，寬5mm，長10mm，Ig載體約占15ml的空間，提供2400cm2的貼壁面積，可提供1.0X109以上數(shù)量的細(xì)胞生長。實(shí)施例11.病毒與細(xì)胞株用于制備藍(lán)耳病病毒抗原的病毒株為NVDC-JXAl毒株，經(jīng)過致病性測試，該毒株病毒不具有致病性。以對該病毒株具有良好敏感性的細(xì)胞系猴腎細(xì)胞(Marc-145)，作為制苗用細(xì)胞系，藉以感染并大量繁殖藍(lán)耳病病毒。2.制備方法(1)將制備抗原用細(xì)胞系猴腎細(xì)胞(Marc-145)接種到加有MEM液體培養(yǎng)基(包括10%牛血清、0.01mol/LNaHC03>0.lmg/ml硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate)、100，000IU青霉素G鈉鹽(PenicillinGSodium)、pH值為7.2)與BioNocII聚酯纖維的載體罐內(nèi)；微載體用量為每500ml培養(yǎng)液添加5.5g微載體，細(xì)胞初始接種量為8.0X109cells/g微載體。(2)于37°C、5%CO2培養(yǎng)環(huán)境下，細(xì)胞貼附4h，使上述制備抗原用細(xì)胞與微載體混合均勻，并使細(xì)胞貼附在微載體上。貼附程序參數(shù)為up:2500mL/minholdlmin.Down2500mL/minhold30s、設(shè)定最大換液量17500mL;4h后切換為細(xì)胞培養(yǎng)程序，細(xì)胞培養(yǎng)程序參數(shù)為up:1900mL/minholdlmin、Down:1900mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量17500mL。(3)于37°C、5%CO2培養(yǎng)環(huán)境下，使細(xì)胞在上述微載體上生長，待細(xì)胞達(dá)到4.OXIO10Cell時(shí)，換用添加1%牛血清的MEM細(xì)胞維持培養(yǎng)液，按病毒感染復(fù)數(shù)(M.0.1.)為0.001的比例接種藍(lán)耳病病毒NVDC-JXAl毒株，并使之感染細(xì)胞，使病毒增值，病毒吸附程序?yàn)閡p:1700mL/minholdlmin、Down:1700mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量17500mL；病毒培養(yǎng)程序up:1200mL/minholdlmin,Down1200mL/minholdlmin、設(shè)定最大換液量17500mL；(4)于37°C、5%C02培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)2日后收獲病毒液，于_20°C凍融兩次并進(jìn)行以下檢驗(yàn)；(a)純凈性檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄15、19、20頁相關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染；(b)病毒含量測定將病毒用含牛血清細(xì)胞維持液作10倍梯度系列稀釋，從IO-1到10_9。每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，同時(shí)設(shè)立陰性不接毒對照，放入5%CO2溫箱中37°C培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下逐孔觀察致細(xì)胞病變作用(CPE)，每天觀察一次，并將觀察結(jié)果記入專用登記表內(nèi)。觀察天數(shù)為直至出現(xiàn)CPE終點(diǎn)，即看到能夠引起病毒增殖的病毒最高稀釋度。對照細(xì)胞應(yīng)始終保持良好形態(tài)和特征。并根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒含量，每1.0ml病毒含量彡IO85LD50;(c)特異性用間接免疫熒光抗體(IFA)方法測定。將病毒接種于96孔細(xì)胞板Marc-145細(xì)胞，每個(gè)樣品4孔，每孔200μL，同時(shí)設(shè)立陰性對照，放入5%CO2溫箱中37°C培養(yǎng)6068h；棄去培養(yǎng)液，用0.01mol/L的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌細(xì)胞4次，然后加入100μL預(yù)冷的80%丙酮水溶液，4°C固定30min；然后用PBS洗滌4次，每次3min，然后每孔加入100μL工作濃度的豬抗藍(lán)耳病病毒血清，置于37°C恒溫箱中感作45min；用PBS洗滌4次，每次3min后；加入工作濃度的兔抗豬FITC結(jié)合物100μL，37°C作用45min；用PBS洗滌4次，每次3min，在熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞對照孔無特異性黃綠色熒光出現(xiàn)，而病毒接種細(xì)胞孔有大量特異性黃綠色熒光出現(xiàn)。對比例懸浮培養(yǎng)工藝與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)比較通過對大規(guī)模潮汐式細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)與常用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)相關(guān)生產(chǎn)性能指標(biāo)進(jìn)行對比，結(jié)果如表1所示。表1不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖藍(lán)耳病病毒的相關(guān)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>風(fēng)險(xiǎn)暴露點(diǎn)<20個(gè)423個(gè)耗材成本低高清洗成本低高收獲病毒500L423x300ml=126.9L病毒毒價(jià)IO85LDWml1065LD50/ml操作工藝_全自動微電腦控制_程序繁瑣_備注BioN0CII載體貼壁面積Ig=2400cm2,1個(gè)TideCell-020微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)需要加入BioNOCII載體220g。結(jié)論上列詳細(xì)說明系針對本發(fā)明之一可行實(shí)施例之具體說明，惟該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明之專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為之等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本案之專利范圍中。權(quán)利要求一種大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法，利用生物反應(yīng)器，以細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒，包括下列技術(shù)步驟(1)培養(yǎng)制備病毒用細(xì)胞將可增殖藍(lán)耳病病毒的細(xì)胞系接種到含有培養(yǎng)液與微載體的載體罐，并將上述細(xì)胞與微載體混合均勻，啟動貼附程序，使細(xì)胞貼附在微載體上；切換細(xì)胞培養(yǎng)程序，在適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境下，提供上述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分和適宜的氣體環(huán)境，使細(xì)胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；(2)毒液的接種與繁殖待細(xì)胞達(dá)到一定密度時(shí)，換用細(xì)胞維持培養(yǎng)液，將藍(lán)耳病病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細(xì)胞上；在適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)病毒；連續(xù)培養(yǎng)2～3日后，收獲病毒液；(3)經(jīng)檢驗(yàn)合格后，將收獲的病毒液于-20℃凍融兩次，滅活純化得到藍(lán)耳病病毒液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法，其特征在于，所述細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)為潮汐式。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法，其特征在于步驟(1)中啟動貼附程序4h后切換培養(yǎng)程序；所述的細(xì)胞貼附程序參數(shù)為up23002700mL/minhold40120s、Down:23002700mL/minhold4090s、設(shè)定最大換液量17500mL；細(xì)胞培養(yǎng)程序參數(shù)為up17002100mL/minhold40120s、Down17002100mL/minhold40120s、設(shè)定最大換液量17500mL。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法，其特征在于步驟(2)中啟動吸附程序后4h換成病毒培養(yǎng)程序，所述病毒吸附程序參數(shù)為up15001900mL/minhold40120s、Down:15001900mL/minhold4090s、設(shè)定最大換液量17500mL；病毒培養(yǎng)程序參數(shù)為:up10001400mL/minhold40120s、Down10001400mL/minhold40120s、設(shè)定最大換液量17500mL。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法，其特征在于所述可增殖藍(lán)耳病病毒的細(xì)胞系為猴腎細(xì)胞系；培養(yǎng)液為90%99%MEM，加10%牛血清，加適量抗菌素，PH值為6.58.0；所述微載體為聚酯纖維。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法，其特征在于細(xì)胞培養(yǎng)溫度36.537.5°C，培養(yǎng)環(huán)境中含有2.5%5%二氧化碳。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法，其特征在于微載體用量為每500ml培養(yǎng)液添加5.5g微載體，細(xì)胞初始接種量為3.04.0X107cellS/g微載體。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的接種藍(lán)耳病病毒時(shí)的細(xì)胞密度為1.5\1082.0\10806118/8微載體。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)按病毒感染復(fù)數(shù)(M.0.I.)為0.0011.5的比例接種病毒。全文摘要本發(fā)明公開了一種大規(guī)模生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒的方法，利用生物反應(yīng)器，以細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)豬藍(lán)耳病病毒，將制備病毒用宿主細(xì)胞接種到含有培養(yǎng)液與微載體的載體罐，并將上述細(xì)胞與微載體混合均勻，使細(xì)胞貼附在微載體上；在適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境下，提供上述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分和適宜的氣體環(huán)境，使細(xì)胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；換用細(xì)胞維持培養(yǎng)液，將藍(lán)耳病病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細(xì)胞上；在適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)病毒；連續(xù)培養(yǎng)2～3日后，收獲病毒液；經(jīng)檢驗(yàn)合格后，將收獲的病毒液于-20℃凍融兩次，滅活純化得到藍(lán)耳病病毒液。該方法生產(chǎn)規(guī)模大、單批次產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本相對較低。文檔編號C12N7/02GK101831412SQ201010135139公開日2010年9月15日申請日期2010年3月30日優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日發(fā)明者喬榮岑,習(xí)向鋒,孫進(jìn)忠,張海洋,張?jiān)S科,李三,陶家權(quán),駱愛芳申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司