專利名稱：一株具有雙重噬菌體抗性的l-苯丙氨酸生產(chǎn)菌及其選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有雙重噬菌體抗性的微生物及其選育方法，屬于生物工程技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
噬菌體污染是影響氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。如果在生產(chǎn)中受到噬菌體 的污染，會影響生產(chǎn)率，從而影響企業(yè)效益。其來源很多，在相對較長的發(fā)酵周期中， 無論哪個環(huán)節(jié)發(fā)生污染，都會對整個過程造成影響。多年來，企業(yè)在噬菌體在生產(chǎn)過程 對噬菌體的防治上積累了大量的經(jīng)驗，但選育抗噬菌體的生產(chǎn)菌株才是最有效的方法。本實驗室前期開發(fā)了 一株L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-BR42 (CCTCC M 2010008)， 該菌株具有噬菌體BP-1(CCTCC M 2010054)抗性，但在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)該菌種又受到了 噬菌體 BP_2(CCTCC M 2010055)的污染。利用誘變手段篩選抗噬菌體的菌株是選育抗性菌株的方法之一。由于現(xiàn)在所知 的誘變方法已有很多，其對機理方面的要求也不高，人們在對誘變方法的選用上已有了 很多的經(jīng)驗。但往往用誘變手段選育菌種具有一定的盲目性，是一件耗時耗力的工作。 在篩選抗噬菌體抗性的大腸桿菌方面，本發(fā)明提出在誘變后培養(yǎng)階段利用噬菌體淘汰培 養(yǎng)的方法，就如何快速有效的獲得目的菌株而言提供了一條新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供一株重組大腸桿菌WSH-BR165 (pAP-B03)，該菌株具有對重組大腸桿菌易感染噬菌體BP-I (CCTCC M 2010054,
保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中國武漢，武 漢大學，分類學命名為大腸桿菌噬菌體QBacteiiopMge))和BP-2的(CCTCC M 2010055，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中國 武漢，武漢大學，分類學命名為大腸桿菌噬菌體(^ac—opMge))雙重抗性；含有 重組質(zhì)粒，質(zhì)粒上攜帶L-苯丙氨酸合成酶基因，現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏時間2010年1月18日，地址中國武漢，武漢大學，分類學命名為大腸桿菌 {Escherichia coli)，保藏編號為 CCTCC M 2010013。所述噬菌體BP-I來源于本實驗室前期開發(fā)的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH_ZH06(含 重組質(zhì)粒pAP_B03，CCTCC M 2010009)受到噬菌體污染的裂解液，噬菌體BP-I已 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間2010年3月15日，保藏編號為CCTCCM 2010054 ；噬菌體BP-2來源于本實驗室開發(fā)的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-BR42 (含重組 質(zhì)粒pAP_B03，CCTCCM 2010008)受到噬菌體污染的裂解液，WSH-BR42具有噬菌體 BP-I的抗性，但不具有噬菌體BP-2的抗性，噬菌體BP-2已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏時間2010年3月15日，保藏編號為CCTCC M 2010055。
所述重組質(zhì)粒為pAP_B03，其上攜帶L-苯丙氨酸合成的關(guān)鍵酶CM/PDT和 DS的基因PheAfbInaroF,其中pheA^基因來源于E.coli K12的突變株，aroF來源于 E.coli K12 (Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr and aroFwt. HaiyanZhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang, Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)。本發(fā)明所要解決的另外一個技術(shù)問題是提供了一種紫外線誘變育種、噬菌體淘 汰培養(yǎng)以及分子生物學改造相結(jié)合的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的選育方法。為解決上述技術(shù)問題，對容易受到噬菌體污染的WSH-Z06的宿主菌 (EnhancedL-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, XianyanLiao, Tianwen Wang, Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)分另ll進 亍 紫外線誘變處理、噬菌體淘汰培養(yǎng)，篩選到一株具有BP-I和ΒΡ-2雙重抗性的大腸桿菌 宿主菌，隨后用編碼L-苯丙氨酸合成酶基因的質(zhì)粒(ρΑΡ-Β03)轉(zhuǎn)化上述大腸桿菌宿主 菌，得到具有雙重噬菌體抗性的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-BR165 (ρΑΡ-Β03)。所述紫外線誘變處理，具體方法為培養(yǎng)WSH-Z06的宿主菌，離心、洗滌菌體后 在紫外照射10-60s進行誘變處理。所述噬菌體淘汰培養(yǎng)，具體方法為在紫外線誘變處理后，紅燈下在培養(yǎng)皿中分 別吸取一定含量菌液于裝有30mL LB培養(yǎng)基和各ImL效價為liTpfu/mL的噬菌體BP-I 和BP-2裂解液的三角瓶中培養(yǎng)6h，使得誘變后不具有噬菌體抗性的菌被淘汰，具有雙重 噬菌體抗性的菌得到富集。所述噬菌體抗性篩選，具體方法為離心、收集、培養(yǎng)誘變后的菌體，挑取形 態(tài)、大小、顏色各不相同的菌落逐一涂布單層平板，然后在平板的4個象限處分別各滴 加5 μ L噬菌體BP-I和ΒΡ-2的裂解液，做好標記，培養(yǎng)24h后，挑取在4處滴加噬菌體 的地方均沒有出現(xiàn)噬菌斑的菌株。所述噬菌體裂解液BP-1，取樣于受噬菌體污染的WSH-Z06(pAP_B03)發(fā)酵 液，經(jīng)過分離、培養(yǎng)后獲得，具體方法為發(fā)酵液離心后的上清液經(jīng)0.22μιη微孔濾 膜過濾除菌，取出一定上清液放入裝有肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，同時加入一定量的 WSH-Z06(pAP_B03)菌懸液，培養(yǎng)一段時間，待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑 取形態(tài)、大小不一的單個空斑分別接入含有敏感菌WSH-Z06的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩 培養(yǎng) 16-24h。所述噬菌體裂解液BP-2，取樣于受噬菌體污染的WSH-BR42(pAP_B03)發(fā)酵 液，經(jīng)過分離、培養(yǎng)后獲得，具體方法為發(fā)酵液離心后的上清液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜 過濾除菌，取出一定上清液放入裝有肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，同時加入一定量的 WSH-BR42 (pAP-B03)菌懸液，培養(yǎng)一段時間，待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法 挑取形態(tài)、大小不一的單個空斑分別接入含有敏感菌WSH-Z06的液體培養(yǎng)基中，37°C振 蕩培養(yǎng)16-24h。所述噬菌體抗性檢測培養(yǎng)基，采用肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5g/L，蛋白胨 10g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，瓊脂 2%。所述抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌，其優(yōu)選培養(yǎng)基組成為(1)種子培養(yǎng)基
使用LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0,固體培
養(yǎng)基加2%的瓊脂。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸鈣12.5，七水合硫酸鎂3.0，二水合氯化鈣 0.015，磷酸二氫鉀3.0，氯化鈉1.0，硫酸銨5.0，七水合硫酸亞鐵0.075，檸檬酸鈉1.0， 硫胺素(thiamine · HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0。TES 溶液(g/L) Al2 (SO4) 3 · 18H20 2.0, CoSO4 · 7H20 0.75, CuSO4 · 5H20 2.5，H3BO30.5，MnSO4 · H2O 24，Na2MoO4 · 2H20 3.0，NiSO4 · 6H20 2.5， ZnSO4 · 7H20 15，用 IN 的 HCl 溶解。所述抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌，其發(fā)酵罐培養(yǎng)方法為將37°C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以10%的接種量分別接入3L發(fā)酵罐中，發(fā) 酵培養(yǎng)基體積為1.5L，通氣量為lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，待DO降至20%，通過調(diào)節(jié) 攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持DO在20%以上；溫度設(shè)定在33°C，菌體濃度達到OD61tl = 3時， 升溫至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的葡萄糖溶液的方式維 持培養(yǎng)基中殘余葡萄糖濃度在5g/L左右。細胞干重(DCW)的測定方法為取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加去 離子水定容，搖勻，用722型可見分光光度計，于610nm處比色測OD值，利用細胞干重 標準曲線算得細胞干重，若測搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中的菌體濃度則在定容前加2mL 2N的鹽酸溶 解菌懸液中的碳酸鈣。L-苯丙氨酸濃度的測定方法采用氨基酸常用測定方法，高效液相色譜(HPLC) 柱前 行生化方法進行測定(Rapid, accurate, sensitive, and reproducible HPLC analysis of aminoacids.Henderson, J. W., Rieker, R.D., Bidlingmeyer, B.A., Woodward, C.， Agilent Technologies, USA, 2000)。有益效果本發(fā)明將傳統(tǒng)紫外誘變育種的優(yōu)點與分子生物學改造的優(yōu)點相結(jié)合，通過噬菌 體淘汰培養(yǎng)的方法，高效率地篩選并構(gòu)建出一株具有噬菌體BP-1、BP-2抗性的L-苯丙 氨酸生產(chǎn)菌；與之前的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株相比，可以抵抗兩種大腸桿菌噬菌體的感 染，且細胞生長速度和L-苯丙氨酸產(chǎn)量不受影響，并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性，提高了 L-苯丙氨酸生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益。
具體實施例方式實施例一噬菌體BP-I的分離純化菌株本實驗室前期開發(fā)的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌重組大腸桿菌WSH-Z06 (pAP_B03)， 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M 2010009。取某工廠受到噬菌體感染的重組大腸桿菌WSH-Z06(pAP_B03)發(fā)酵液4mL， 8000rpm離心IOmin后，上清液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，取出100 μ L到50 V 裝有6mL上層肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，同時加入WSH-Z06(pAP_B03)菌懸液100 UL,立即混勻，倒入已凝固的底層培養(yǎng)基上，鋪勻，置37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16-24h。 待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑取形態(tài)、大小不一的單個空斑分別接入含有 WSH-Z06(pAP_B03)的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16_24h。重復上述步驟進行噬菌斑 形態(tài)、大小的檢驗，直至得到純化的噬菌體。噬菌體分離純化培養(yǎng)基肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡 萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上層瓊脂 0.8%，下層瓊脂 2%)。噬菌體BP-I已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM
2010054。實施例二噬菌體BP-2的分離純化菌株本實驗室前期開發(fā)的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌重組大腸桿菌WSH-BR42 (pAP_B03)， 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M 2010008。取某工廠受到噬菌體感染的重組大腸桿菌WSH-BR42 (pAP"B03)發(fā)酵液4mL， 8000rpm離心IOmin后，上清液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，取出100 μ L到50 V 裝有6mL上層肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，同時加入WSH-BR42(pAP_B03)菌懸液 IOOuL,立即混勻，倒入已凝固的底層培養(yǎng)基上，鋪勻，置37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16-24h。 待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑取形態(tài)、大小不一的單個空斑分別接入含有 WSH-BR42(pAP_B03)的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16_24h。重復上述步驟進行噬菌 斑形態(tài)、大小的檢驗，直至得到純化的噬菌體。噬菌體分離純化培養(yǎng)基肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡 萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上層瓊脂 0.8%，下層瓊脂 2%)。噬菌體BP-2已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM
2010055。實施例三紫外線誘變育種、噬菌體淘汰培養(yǎng)以及雙抗性的篩選菌株大腸桿菌宿主菌WSH-ZHO6 (前期構(gòu)建，Enhanced L-phenylalanine biosynthesis byco-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, Xianyan Liao，Tianwen Wang, GuochengDu, Jian Chen.Bioresource Technology)從斜面上接一環(huán)大腸桿菌宿主菌WSH-ZH06菌種入LB種子培養(yǎng)基中 (25mL/250mL錐形瓶)，在37°C、200rpm的條件下培養(yǎng)12h后，離心收集菌體，用生 理鹽水洗滌三次。取適量菌懸液于六只內(nèi)置磁力攪拌子的培養(yǎng)皿中，放入紫外誘變箱 (紫外燈與菌液距離為30cm，紫外燈為15瓦特)，分別在紫外燈下照射10s，20s, 30s, 40s, 50s及60s。在紅燈下，在每只培養(yǎng)皿中分別吸取ImL菌液于裝有30mLLB和各 ImL效價為liTpfu/mL的兩種噬菌體裂解液的三角瓶中間培養(yǎng)6h，而后稀釋、涂布LB 平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑取形態(tài)、大小、顏色各不相同的菌落逐一涂布單 層平板，然后在平板的4個象限處分別各滴加5μ1噬菌體BP-I和BP-2裂解液，做好標 記，培養(yǎng)24h后，挑取在4處滴加噬菌體的地方均沒有出現(xiàn)噬菌斑的菌株6株，將每株菌 分別在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次，再分別檢測各菌株每一代的噬菌體抗性，結(jié)果選出 噬菌體抗性遺傳穩(wěn)定的菌株1株，命名為WSH-BR165。
實施例四將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入具有雙重噬菌體抗性的大腸桿菌菌株具有噬菌體BP-1、BP-2雙重抗性的大腸桿菌宿主菌WSH-BR165質(zhì)粒PAP-B03為本實驗室自行構(gòu)建(詳見參考文獻Enhanced L-phenylalanine biosynthesis byco-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, Xianyan Liao，Tianwen Wang, GuochengDu, Jian Chen.Bioresource Technology, 2010, 1)采用電轉(zhuǎn)化的方法對大腸桿菌突變株WSH-BR165進行轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pAP_B03。將 WSH-BR165的對數(shù)期培養(yǎng)液IOOmL先用等量的水洗滌三次，再用等量的10%甘油洗滌 三次，最后用ImL的10%甘油懸浮菌體。向電轉(zhuǎn)化杯中加入50μ1的菌懸液，再加入 5μ1的質(zhì)粒，向電轉(zhuǎn)杯提供2.5KV的電壓5ms，立刻在電轉(zhuǎn)杯中加入ImL的LB培養(yǎng)基， 混勻后轉(zhuǎn)入1.5mL的離心管里于37°C、200rpm條件下培養(yǎng)2h后，涂布含有硫酸卡那霉素 的LB平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待有單菌落長出，得到具有雙重噬菌體抗性 的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-BR165 (pAP03)，將其接入含有硫酸卡那霉素的LB斜面上保 藏備用。WSH_BR165(pAP03)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2010013。 實施例四在添加噬菌體BP-2裂解液的條件下，WSH-BR165 (pAP03)與 WSH-BR42 (pAP-B03)以及WSH-Z06 (pAP-B03)產(chǎn)L-苯丙氨酸能力的比較菌株WSH-BR165 (pAP03)、WSH-ZH06 (pAP03)、WSH-BR42 (pAP_B03)優(yōu)選培養(yǎng)基組成為(1)種子培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0,固體培
養(yǎng)基加2%的瓊脂。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸鈣12.5，七水合硫酸鎂3.0，二水合氯化鈣 0.015，磷酸二氫鉀3.0，氯化鈉1.0，硫酸銨5.0，七水合硫酸亞鐵0.075，檸檬酸鈉1.0， 硫胺素(thiamine · HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0。TES 溶液(g/L) Al2 (SO4) 3 · 18H20 2.0, CoSO4 · 7H20 0.75, CuSO4 · 5H20 2.5，H3BO30.5，MnSO4 · H2O 24，Na2MoO4 · 2H20 3.0，NiSO4 · 6H20 2.5， ZnSO4 · 7H20 15，用 IN 的 HCl 溶解。3L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為1.5L，通氣量為lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，待 DO降至20%，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持DO在20%以上；溫度設(shè)定為33°C，菌 體濃度達到OD61tl = 3時，升溫至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/ L的葡萄糖溶液的方式維持培養(yǎng)基中殘余葡萄糖濃度在5g/L左右，發(fā)酵至L-苯丙氨酸產(chǎn) 量達到最大，結(jié)果見表一。表一
菌種發(fā)酵時間(h)L-苯丙氨酸(g/L)生產(chǎn)強度(gh_VL)WSH-BR165 (pAP03)45491.09WSH-ZH06 (pAP03)48521.08WSH-BR42 (pAP-B03)47501.06表一數(shù)據(jù)表示，經(jīng)過誘變后，雖然重組大腸桿菌L-苯丙氨酸產(chǎn)量略微降低，但 發(fā)酵時間有所縮短，生產(chǎn)強度總體不變，并且具有了噬菌體BP-I和BP-2抗性。實施例五在添加噬菌體BP-I和BP-2裂解液的條件下，WSH_BR165 (pAP03) 產(chǎn)L-苯丙氨酸能力的驗證菌株噬菌體BP-I，保藏編號為CCTCC M 2010054 ；噬菌體BP-2，保藏編號為 CCTCC M2010055 ； WSH-BR165 (pAP03)保藏編號為 CCTCC M 2010013。3L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基(分別添加0.5% (ν/ν)的效價為IOuiPFUAnL的噬菌體 BP-I和ΒΡ-2的裂解液)體積為1.5L。通氣量為lwm，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，待DO降 至20%，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持DO在20%以上；溫度設(shè)定為33°C，菌體濃度 達到OD61tl = 3時，升溫至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的 葡萄糖溶液的方式維持培養(yǎng)基中殘余葡萄糖濃度在5g/L左右，發(fā)酵48小時，L-苯丙氨 酸產(chǎn)量達到48g/L。
權(quán)利要求
1.一種L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌，其特征在于該菌株具有對重組大腸桿菌易感染噬菌體 BP-I (CCTCC M 2010054)和 BP-2 的(CCTCC M 2010055)雙重抗性；含有重組質(zhì)粒，質(zhì) 粒上攜帶L-苯丙氨酸合成酶基因，現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間2010 年1月18日，保藏編號為CCTCC M2010013。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩種噬菌體BP-I和BP-2，其特征在于，噬菌體BP-I來源于 本實驗室前期開發(fā)的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-ZH06 (CCTCC M2010009)受到噬菌體污 染的裂解液，噬菌體BP-I已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間2010年3月15 日，保藏編號為CCTCC M 2010054 ；噬菌體BP_2來源于本實驗室開發(fā)的L-苯丙氨酸生 產(chǎn)菌WSH-BR42 (CCTCC M2010008)受到噬菌體污染的裂解液，WSH-BR42具有噬菌體 BP-I的抗性，但不具有噬菌體BP-2的抗性，噬菌體BP-2已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏時間2010年3月15日，保藏編號為CCTCC M 2010055。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組質(zhì)粒，其特征在于，其上攜帶L-苯丙氨酸合成的關(guān)鍵酶 CM/PDT 和 DS 的基因 pheAto 和 aroFwt。
4.一種選育噬菌體抗性L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的方法，其特征在于，對容易受到噬菌體 污染的大腸桿菌宿主菌分別進行紫外線誘變處理、噬菌體淘汰培養(yǎng)后，篩選到一株具有 BP-I和BP-2噬菌體雙重抗性的大腸桿菌宿主菌，隨后用編碼L-苯丙氨酸合成酶基因的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述大腸桿菌宿主菌，得到具有噬菌體雙重抗性的L-苯丙氨酸生產(chǎn)用重組大腸 桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述噬菌體淘汰培養(yǎng)方法，其特征在于，在紫外線誘變處理后，紅 燈下在培養(yǎng)皿中分別吸取一定含量菌液于裝有LB培養(yǎng)基和噬菌體BP-I以及BP-2裂解液 的三角瓶中培養(yǎng)一段時間，使得誘變后不具有噬菌體BP-I和BP-2抗性的菌被淘汰，具 有雙重噬菌體抗性的菌得到富集。
全文摘要
本發(fā)明對容易受到噬菌體污染的WSH-Z06的宿主菌分別進行紫外線誘變處理、噬菌體淘汰培養(yǎng)，篩選到一株具有BP-1和BP-2雙重抗性的大腸桿菌宿主菌，隨后用編碼L-苯丙氨酸合成酶基因的質(zhì)粒(pAP-B03)轉(zhuǎn)化宿主菌，得到抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-BR165(pAP-B03)；本發(fā)明將傳統(tǒng)紫外誘變育種的優(yōu)點與分子生物學改造的優(yōu)點相結(jié)合，通過噬菌體淘汰培養(yǎng)的方法，高效率地篩選并構(gòu)建出一株具有噬菌體BP-1、BP-2抗性的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌。
文檔編號C12P13/22GK102010848SQ20101013560
公開日2011年4月13日 申請日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者劉龍, 周海巖, 堵國成, 李江華, 王靜, 陳堅 申請人:江南大學