專利名稱：：昆蟲幾丁質(zhì)酶基因及其dsRNA的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及昆蟲幾丁質(zhì)酶基因序列及其dsRNA的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：農(nóng)業(yè)害蟲為害是我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的主要制約因素，長期施用化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致一系列問題1)昆蟲出現(xiàn)抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重；3)對非靶標(biāo)生物有較大的影響。現(xiàn)有的生物殺蟲劑在害蟲防治中應(yīng)用也較廣，但殺蟲時(shí)間較長，效果緩慢。RNA干擾(RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，于2006年獲得諾貝爾獎。這一發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時(shí)也為人類的疾病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年的“NatureBiotechnology”雜志先后兩篇論文報(bào)道了施用表達(dá)靶向害蟲重要致死基因V-ATPaseA,CYP6AE14andGST1的dsRNA轉(zhuǎn)基因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baumetal，2007；Maoetal，2007)。2008年，PriceandGatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略?；赗NA干擾技術(shù)的害蟲防治具有如下優(yōu)勢1)選擇對害蟲專一的基因進(jìn)行干擾，對高等動物和和人類是安全的；2)抗蟲具有專一性，對非靶標(biāo)生物無殺傷作用；3)對環(huán)境無毒無害。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提供一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因及其dsRNA的在致死害蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:1，是通過對東亞飛蝗EST數(shù)據(jù)庫的搜索，鑒別出7條東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因片段，檢測了這7個(gè)幾丁質(zhì)酶基因在東亞飛蝗不同組織部位的表達(dá)，篩選出在組織表皮特異表達(dá)的與東亞飛蝗蛻皮相關(guān)幾丁質(zhì)酶基因LmCHTIO，通過RACE-PCR擴(kuò)增并進(jìn)一步克隆獲得958bp的東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因。本發(fā)明提供的一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:2，是根據(jù)SEQIDNO:1設(shè)計(jì)上游引物SEQIDNO:4和下游引物SEQIDNO:5，通過PCR擴(kuò)增獲得SEQIDNO:2，其含有T7啟動子。進(jìn)一步利用試劑盒合成dsRNA。本發(fā)明提供的一種合成dsRNA的昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO3，是根據(jù)SEQIDNO1設(shè)計(jì)上游引物SEQIDNO6和下游引物SEQIDNO:7，通過PCR擴(kuò)增獲得SEQIDN0:3，其含有T7啟動子。進(jìn)一步利用試劑盒合成dsRNA。SEQIDNO:2和SEQIDNO:3合成的dsRNA的在致死害蟲中的應(yīng)用注射上述dsRNA到昆蟲體腔，結(jié)果表明SEQIDNO2和SEQIDNO3合成的dsRNA均可以特異性地沉默幾丁質(zhì)酶基因LmCHTIO的mRNA表達(dá)，并導(dǎo)致蝗蟲蛻皮困難而死亡。圖1東亞飛蝗注射SEQIDNO2或SEQIDNO3合成的dsRNA后出現(xiàn)蛻皮困難3而死亡的表型。A:2齡東亞飛蝗(左側(cè)為注射dsGFP的對照，右側(cè)為注射SEQIDNO:2合成的dsRNA)；B2齡東亞飛蝗(左側(cè)為注射dsGFP的對照，右側(cè)為注射SEQIDNO3合成的dsRNA)；C5齡東亞飛蝗(左側(cè)為注射dsGFP的對照，右側(cè)為注射SEQIDNO3合成的dsRNA)。圖2東亞飛蝗注射SEQIDNO2或SEQIDNO3合成的dsRNA后幾丁質(zhì)酶基因LmCHTIO的mRNA表達(dá)，3-actin做為內(nèi)參基因。A2齡東亞飛蝗(1為注射dsGFP的對照，2為注射SEQIDNO2合成的dsRNA)；B2齡東亞飛蝗(3為注射dsGFP的對照，4為注射SEQIDNO:3合成的dsRNA)；C:5齡東亞飛蝗(5為注射dsGFP的對照，6為注射SEQIDNO:3合成的dsRNA)。圖3中華稻蝗注射SEQIDNO3合成的dsRNA后出現(xiàn)蛻皮困難而死亡的表型左側(cè)為注射dsGFP的對照，右側(cè)為注射SEQIDNO3合成的dsRNA的中華稻蝗。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因片段及其dsRNA的獲得1、東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因片段的獲得1)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因在東亞飛蝗表達(dá)序列標(biāo)簽EST數(shù)據(jù)庫的搜索基于東亞飛蝗的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法對東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行搜索，經(jīng)過序列分析及比對后，共獲得7條幾丁質(zhì)酶基因片段。2)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因RACE引物的設(shè)計(jì)基于已獲得幾丁質(zhì)酶基因片段的堿基序列，采用primerpremierf.0軟件設(shè)計(jì)。所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。3)東亞飛蝗總RNA獲得選取大小一致雌雄各半東亞飛蝗5齡若蟲，四頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，具體操作步驟參照TaKaRaTrizol試劑盒。4)RACEcDNA合成RACEcDNA合成步驟參照SMARTRACEcDNAAmplification試劑盒。5)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因片段的獲得根據(jù)Advantage2Polymerase說明書進(jìn)行3，和5，RACE末端快速擴(kuò)增，進(jìn)一步克隆獲得的東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因序列。6)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因片段堿基序列的分析利用Expasy網(wǎng)站中相關(guān)在線軟件和GENED0C、基因探索者等軟件分析所得序列，之后在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比對。2、東亞飛蝗蛻皮相關(guān)幾丁質(zhì)酶基因的篩選1)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)引物的設(shè)計(jì)基于7條幾丁質(zhì)酶基因片段的堿基序列，采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)。所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。2)東亞飛蝗不同組織部位總RNA的提取及純化選取活力旺盛的5齡東亞飛蝗，6頭蟲子(雌雄各半)一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。解剖其11個(gè)組織部位前腸、中腸、后腸、胃盲囊、脂肪體、馬氏管、表皮、氣管、肌肉、精巢和卵巢。將解剖好的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)置于液氮中凍存。各個(gè)組織部位總RNA的提取及純化方法具體操作步驟參照TaKaRaTrizol試劑盒和RNA純化說明書3)第一鏈cDNA的合成參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄TaKaRa試劑說明書，進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。4)RT-PCR法檢測7個(gè)幾丁質(zhì)酶基因在11個(gè)組織部位的表達(dá)7個(gè)幾丁質(zhì)酶基因在不同組織部位的表達(dá)采用常規(guī)RT-PCR檢測，在凝膠成像儀上采集圖像并分析。5)東亞飛蝗蛻皮相關(guān)幾丁質(zhì)酶基因的篩選選取在表皮中高表達(dá)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因LmCHTl開展進(jìn)一步的研究。3、東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因dsRNA合成1)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因dsRNA引物的設(shè)計(jì)基于本研究所得到東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因的序列SEQIDNO:1，采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)。共設(shè)計(jì)2對dsRNA引物，其序列分別為SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。2)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因dsRNA的合成用上述2對dsRNA引物合成PCR產(chǎn)物，經(jīng)WizardSVGelandPCRClean-UpSystem(Promega)試劑盒純化后按照T7RiboMAXExpressRNAiSystem(Promega)試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。dsRNA濃度采用酶標(biāo)儀SpectraMax190測定，并濃縮至終濃度為3μg/μ1ο實(shí)施例2幾丁質(zhì)酶基因dsRNA致死東亞飛蝗1、東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因dsRNA注射將2μ1(約6μg)SEQIDNO:2或SEQIDNO3的dsRNA用25μ1規(guī)格微量注射器注射到東亞飛蝗任一齡若蟲二、三腹節(jié)之間，共注射3組生物學(xué)重復(fù)，每組10只，雌雄各半。注射相同體積濃度的dsGFP至對照組體內(nèi)。將注射后東亞飛蝗置于28°C恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。2、注入dsRNA后東亞飛蝗表型的觀察注射dsRNA東亞飛蝗實(shí)驗(yàn)組與對照組在取食量、體型變化及體重增長并無顯著差異。在蛻皮過程中，對照組飛蝗順利蛻皮，從脊線開裂至身體完全蛻出只需短短幾分鐘；而dsRNA注射組飛蝗，脊線可以開裂，但頭部及腹部新皮與舊皮無法分離，導(dǎo)致飛蝗無法移動，保持同一狀態(tài)長達(dá)數(shù)小時(shí)甚至兩天，直至死亡。表型見附圖1。死亡率統(tǒng)計(jì)見下表表1:5齡東亞飛蝗注射SEQIDNO3的dsRNA及dsGFP的死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>Ia^注射蟲數(shù)(只)ι死亡蟲數(shù)(只)ι死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>N5-1、N5-2、N5-3為注射SEQIDNO3的dsRNA實(shí)驗(yàn)組；N5dsGFP_l、N5dsGFP_2、N5dsGFP-3為注射dsGFP的對照組。3、東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因沉默檢測即將蛻皮死亡的東亞飛蝗置于液氮中凍存，每組收蟲4只，雌雄各半，采用Trizol法提取總RNA并純化，采用MLV反轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA。對照組東亞飛蝗蛻皮時(shí)收蟲，提取總RNA并純化，采用MLV反轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA，作為對照。東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因經(jīng)RNA干擾后其基因表達(dá)情況，采用常規(guī)RT-PCR檢測，在凝膠成像儀上采集圖像并分析。附圖2為檢測結(jié)果。實(shí)施例3幾丁質(zhì)酶基因dsRNA致死中華稻蝗1、中華稻幢SEQIDNO3的dsRNA注射將2μ1(約6μg)SEQIDNO3的dsRNA用25μ1規(guī)格微量注射器注射到中華稻蝗任一齡若蟲二、三腹節(jié)之間，共注射2組生物學(xué)重復(fù)，每組10只，雌雄各半。注射相同體積濃度的dsGFP至對照組體內(nèi)。將注射后中華稻蝗置于28°C恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。2、注入dsRNA后，中華稻蝗的觀察注射dsRNA組中華稻蝗在齡期中間與對照組在取食量、體型變化及體重增長并無顯著差異。在蛻皮過程中，對照組稻蝗順利蛻皮，從脊線開裂至身體完全蛻出只需短短幾分鐘；而dsRNA組稻蝗，脊線可以開裂，腹部可以抽出，但頭部新皮與舊皮無法分離，稻蝗無法行動，保持同一狀態(tài)長達(dá)數(shù)小時(shí)甚至一天，直至死亡。表型見附圖3。權(quán)利要求一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO1。2.一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:2。3.如權(quán)利要求2所述的昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，含有T7啟動子。4.如權(quán)利要求2所述的昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，其引物是上游引物SEQIDN0:4，下游引物SEQIDNO:5ο5.一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列是SEQIDNO:3。6.如權(quán)利要求5所述的昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，含有Τ7啟動子。7.如權(quán)利要求5所述的昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，其引物是上游引物SEQIDΝ0:6，下游引物SEQIDNO:7ο8.如權(quán)利要求2或5所述的昆蟲幾丁質(zhì)酶基因合成的dsRNA。9.如權(quán)利要求8所述的dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供幾丁質(zhì)酶基因序列及其dsRNA的應(yīng)用，可沉默特定的幾丁質(zhì)酶基因使昆蟲發(fā)育受阻死亡。通過對多個(gè)東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶基因克隆、測序及表達(dá)分析，得到序列為SEQIDNO1的幾丁質(zhì)酶基因，從中選出序列為SEQIDNO2和SEQIDNO3的幾丁質(zhì)酶基因，用于dsRNA的合成。將dsRNA注入昆蟲的體腔后，昆蟲在發(fā)育過程中表現(xiàn)為蛻皮困難而死亡。本發(fā)明為害蟲實(shí)現(xiàn)基于RNA干擾的有效防治提供依據(jù)，為安全無公害的害蟲防治方法研制提供新的途徑。文檔編號C12N15/56GK101805746SQ201010136330公開日2010年8月18日申請日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者張建珍,張建琴,李大琪,楊美玲,郭亞平,馬恩波申請人:山西大學(xué)