專利名稱：一種微流控樣品進(jìn)樣方法、裝置及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微流控樣品進(jìn)樣方法、裝置及其應(yīng)用，本方法是一種微流控芯片
上皮升級(jí)至納升級(jí)的液體樣品進(jìn)樣方法，可應(yīng)用于微流控芯片上的樣品分離、細(xì)胞剌激等 生化分析。
背景技術(shù)：
近年來，微全分析系統(tǒng)(Micro-total analysis system, ii-TAS)或者芯片實(shí)驗(yàn)室 (Lab on a chip)在化學(xué)、物理、生物以及生物工程等領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響。微全分析系統(tǒng)以 微流體和納流體控制技術(shù)為基礎(chǔ)，引導(dǎo)分析儀器向小型化、集成化、自動(dòng)化、高通量快速定 量分析方向發(fā)展。微全分析系統(tǒng)為生化環(huán)境樣品的實(shí)時(shí)檢測、現(xiàn)場分析提供了一種可能的 策略，其在醫(yī)療診斷市場(Point-of-Care Testing)也有著巨大的商業(yè)前景。
皮升級(jí)到納升級(jí)的樣品進(jìn)樣是微全分析系統(tǒng)進(jìn)行樣品分析中一個(gè)必不可少的步 驟。進(jìn)樣的重現(xiàn)性、線性度等參數(shù)極大地影響了分析儀器的性能。目前，微全分析系統(tǒng)中普 遍采用的進(jìn)樣方式為電動(dòng)(電滲流或/和電泳驅(qū)動(dòng))進(jìn)樣，其主要模式有夾流進(jìn)樣、門控 進(jìn)樣、雙"T"進(jìn)樣、雙"L"進(jìn)樣等。電動(dòng)進(jìn)樣易于實(shí)現(xiàn)儀器的小型化和集成化，在短時(shí)間內(nèi) 的運(yùn)行有著較好的重現(xiàn)性。但是電動(dòng)進(jìn)樣具有樣品歧視效應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致進(jìn)樣的樣品組分和原 始樣品的組分不同。另外，電動(dòng)驅(qū)動(dòng)流體在應(yīng)用于活的生物樣品時(shí)有著一個(gè)無法解決的矛 盾，即如果電場強(qiáng)度過小則無法驅(qū)動(dòng)體積較大的細(xì)胞或者微生物(大于10微米)，如果電場 強(qiáng)度過大則細(xì)胞或微生物會(huì)因?yàn)殡妱?dòng)驅(qū)動(dòng)的電場效應(yīng)和熱效應(yīng)受到不可逆的損傷。因此， 電動(dòng)進(jìn)樣只適合應(yīng)用于分子樣品和較小體積的細(xì)胞樣品(小于5微米)。壓力進(jìn)樣也被應(yīng) 用于微全分析系統(tǒng)的樣品進(jìn)樣，其能解決電動(dòng)進(jìn)樣方法中存在的一些問題。Landers研究 組(Analytical Chemistry 2005,77,3637-3643)禾口 Quake研究組(NatureBiotechnology 2004,22,435-439)在聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性體芯片上集成微閥和微泵，利用壓力驅(qū) 動(dòng)流體，微閥控制樣品進(jìn)樣。這類方法能夠驅(qū)動(dòng)較大的生物樣品，沒有樣品歧視效應(yīng)。但這 類方法使用的微流控芯片加工復(fù)雜，方法實(shí)施依賴于復(fù)雜的儀器，并不適合于大規(guī)模的商 業(yè)化使用。此外，殷學(xué)鋒研究組(Lab on a Chip 2006， 6， 258-264)開發(fā)出一種在"十"字型 微流控芯片上的進(jìn)樣技術(shù)。該技術(shù)通過施加負(fù)壓到微流控芯片的一個(gè)端口 ，形成緩沖液對(duì) 樣品的水力聚焦，然后撤銷負(fù)壓同時(shí)在分離通道兩邊施加一個(gè)電場，從而實(shí)現(xiàn)樣品的電動(dòng) 進(jìn)樣。該方法無樣品歧視效應(yīng)，進(jìn)樣重現(xiàn)性好，但是其調(diào)節(jié)進(jìn)樣樣品體積的能力十分有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有微全分析系統(tǒng)樣品進(jìn)樣的缺點(diǎn)(如進(jìn)樣方法存在歧視 性、對(duì)活的生物樣品有損傷、進(jìn)樣體積不可調(diào)節(jié))，提供一種皮升級(jí)到納升級(jí)的微流控樣品 進(jìn)樣方法、裝置、及該方法在液相色譜分離和細(xì)胞剌激試驗(yàn)中的應(yīng)用。
采用的具體技術(shù)方案如下 —種基于壓力驅(qū)動(dòng)的微流控水力門控樣品進(jìn)樣方法，包括如下步驟
第一步，將"十"字型微流控芯片的通道即"十"字通道的四個(gè)末端分別定義為樣
品端s，樣品廢液端sw、緩沖液端b和緩沖液廢液端bw，所述"十"字通道的交叉點(diǎn)中心o與
緩沖液廢液端bw之間的通道o-bw定義為樣品分析通道，對(duì)樣品廢液端sw和緩沖液廢液端
bw施加負(fù)壓，在中心o處形成水力門控，此時(shí)樣品端s的樣品流入樣品廢液端sw，緩沖液端
b的緩沖液流入緩沖液廢液端bw和樣品廢液端sw。施加到所述樣品廢液端sw和緩沖液廢
液端bw的負(fù)壓力和水力門控的緊密程度可以由以下公式確定
P g P ^丄A +^丄丄A
-—-
Aw + Aw4丄w +丄 ^ + A Aw^w+A AvA 其中Psw和Pbw分別為施加于sw和bw端口的負(fù)壓；LS、 Lsw、 Lb、 Lbw分別為通道s_o、
SW-O、 b-O、 bw-0端的長度；g為微通道O-SW內(nèi)樣品流占總量的比率，g越小門控越緊密，g
=1時(shí)為臨界門控，即s中樣品全部流入sw， b中緩沖液全部流入bw。 第二步，改變施加在"十"字通道的樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw上的負(fù)壓值， 或者保持施加在緩沖液廢液端bw上的負(fù)壓值不變而撤銷施加在樣品廢液端sw上的負(fù)壓， 以使樣品端s的樣品流入樣品分析通道o-bw，實(shí)現(xiàn)樣品進(jìn)樣。施加到所述樣品廢液端sw和 緩沖液廢液端bw的負(fù)壓力和進(jìn)樣量的關(guān)系可以通過以下公式確定
丄& 丄& ， ， — ，^ ， ^
A^4W+M,vA +丄wA Av^^w + A AAW+A Av^w + 4 AvA 其中Psw、Pbw分別為施加于sw、bw端口的壓力；Ls、Lsw、Lb、Lbw分別為通道s-o、sw-o、
b_0、 bw-0端的長度；k為進(jìn)樣時(shí)微通道O-bw內(nèi)樣品流占總量的比例，k越大單位時(shí)間內(nèi)的
進(jìn)樣量越大。 第三步，重新使得施加在樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw上的負(fù)壓值恢復(fù)到與
第一步相同，在所述"十"字通道中心重新形成水力門控； 至此，一次樣品進(jìn)樣完成，重復(fù)上述步驟，即可實(shí)現(xiàn)多次連續(xù)進(jìn)樣。 本發(fā)明在上述第二步中，可通過控制樣品進(jìn)樣的時(shí)間，從而控制進(jìn)樣的樣品量。 本發(fā)明所述的樣品為液體樣品。 —種實(shí)現(xiàn)上述方法的裝置，該裝置包括"十"字型微流控芯片、多個(gè)儲(chǔ)液池、連接 管、三通電磁閥、壓力發(fā)生單元和主機(jī)，所述"十"字型微流控芯片上的"十"字通道的四個(gè) 末端都安裝有儲(chǔ)液池，所述三通電磁閥用于控制壓力發(fā)生單元輸出壓力的切換，以選擇產(chǎn) 生門控負(fù)壓或進(jìn)樣負(fù)壓。 將本方法應(yīng)用于液相色譜分離和細(xì)胞剌激，實(shí)施裝置還包括信號(hào)檢測單元，用于
將收集的信號(hào)傳輸給主機(jī)，以對(duì)所收集的信號(hào)進(jìn)行分析處理。 所述的裝置在對(duì)細(xì)胞的藥物剌激中的應(yīng)用，具體過程如下 將細(xì)胞引入"十"字型微流控芯片的o-bw端，并培養(yǎng)至貼壁，啟動(dòng)主機(jī)后，所述負(fù)
壓同時(shí)施加到bw和sw，形成樣品門控，藥物的水溶液作為樣品加入s端的儲(chǔ)液池中，sw、 b
和bw端的儲(chǔ)液池中加緩沖液，設(shè)置進(jìn)樣程序參數(shù)后進(jìn)行多次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣后細(xì)胞被藥物
剌激，每次進(jìn)樣完畢后恢復(fù)到門控，藥物被緩沖液帶走，細(xì)胞剌激被中止； 所述信號(hào)檢測單元記錄下細(xì)胞的熒光變化，通過分析細(xì)胞剌激和響應(yīng)時(shí)間圖對(duì)獲
得細(xì)胞生理信息。 本發(fā)明所述的信號(hào)檢測單元為配備有CCD相機(jī)和光電倍增管的倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，沒有樣品歧視效應(yīng)、具有較強(qiáng)流體驅(qū)動(dòng)能力、進(jìn)樣重現(xiàn)性好、線 性度高、進(jìn)樣體積可控、系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、成本低、操作方便，對(duì)活的生物樣品沒有傷害。


圖1是本發(fā)明的原理示意圖。其中(A)和(B)為樣品門控，其中(A)為緊密門控 g〈l的情況，(B)為樣品臨界門控g二 l情況。(C)改變施加在"十"字通道的樣品廢液 端sw和緩沖液廢液端bw負(fù)壓值，樣品進(jìn)樣。(D)撤銷在樣品廢液端sw所加的負(fù)壓，樣品進(jìn) 樣。s、 sw、b和bw分別為指示樣品端，樣品廢液端、緩沖液端和緩沖液廢液端。o指示"十" 字通道的交叉點(diǎn)。黑色箭頭指示液體在通道中流動(dòng)方向。 圖2是本發(fā)明的系統(tǒng)示意圖。其中1為"十"字型微流控芯片，2為"十"字型微流 控芯片的通道，3為儲(chǔ)液池，5和6為三通電磁閥，c、d和e為三通電磁閥的三個(gè)端口 ， c至d 氣路為常開連接，c至e氣路為常閉連接；7為壓力發(fā)生單元，f 、 g、 h、 j分別為壓力發(fā)生單 元的四個(gè)不同的壓力輸出端口 ；8為信號(hào)檢測單元；9為主機(jī)。 圖3是CCD相機(jī)拍攝樣品門控圖(顯微鏡放大100倍)。圖中黑色為樣品流，黑 色虛線為通道邊緣。s、sw、b和bw分別為指示樣品端，樣品廢液端、緩沖液端和緩沖液廢液 端。o指示"十"字通道的交叉點(diǎn)。 圖4是熒光素連續(xù)進(jìn)樣檢測圖。熒光素連續(xù)進(jìn)樣20次，每次進(jìn)樣100毫秒，間隔 500毫秒。倒置熒光激發(fā)，光子計(jì)數(shù)器柱上熒光檢測。 圖5是進(jìn)樣體積和時(shí)間線性度圖。進(jìn)樣時(shí)間分別為5、10、20、50、100、200、500和 1000毫秒。 一次線性擬合，R2 = 0. 9992。 圖6是將本方法應(yīng)用于細(xì)胞剌激的示意圖，其中(A)為樣品門控，定位于分析通道 o-bw的細(xì)胞被緩沖液沖洗。(B)為樣品進(jìn)樣，細(xì)胞被樣品(如毒素、興奮劑等)剌激。(C) 為重新門控，剌激樣品被緩沖液帶走，細(xì)胞脫離被剌激的狀態(tài)。 圖7是細(xì)胞剌激響應(yīng)圖，貼壁生長在"十"字型微流控芯片o-bw通道的單個(gè)HeLa 細(xì)胞在ATP多次進(jìn)樣剌激下，熒光探針Fluo-3/AM指示細(xì)胞內(nèi)鈣變化圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 —種基于壓力驅(qū)動(dòng)的微流控水力門控樣品進(jìn)樣方法，包括如下步驟 第一步，如圖1(A)所示，將"十"字型微流控芯片的通道(S卩"十"字通道)的四個(gè)
末端分別定義為樣品端s，樣品廢液端sw、緩沖液端b和緩沖液廢液端bw，將"十"字通道的
交叉點(diǎn)定義為中心o，中心o與緩沖液廢液端bw之間的通道o-bw定義為樣品分析通道。對(duì)
樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw施加負(fù)壓，在中心o處形成樣品門控，即此時(shí)樣品端s的
樣品流入樣品廢液端sw，緩沖液端b的緩沖液流入緩沖液廢液端bw和樣品廢液端sw。施
加到所述樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw的負(fù)壓力和水力門控的緊密程度可以由以下公
式確定
P<formula>formula see original document page 6</formula>
丄Aw 其中Psw和Pbw分別為施加于sw和bw端口的負(fù)壓；LS、 Lsw、 Lb、 Lbw分別為通道s_o、
SW-O、 b-0和bw-0的長度；g為通道O-SW內(nèi)樣品流占總量的比例，g越小門控越緊密，g =
1時(shí)為臨界門控(如圖1 (B)所示)，即s中樣品全部流入sw， b中緩沖液全部流入bw。
第二步，改變施加在"十"字通道的樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw負(fù)壓值，如 圖l(C)，或者撤銷在樣品廢液端sw所加的負(fù)壓，如圖l(D)，使樣品端s的樣品流入樣品分 析通道o-bw，實(shí)現(xiàn)樣品進(jìn)樣。施加到所述樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw的負(fù)壓力和進(jìn) 樣量的關(guān)系可以通過以下公式確定
仏丄^
o《h 其中k為進(jìn)樣時(shí)通道o-bw內(nèi)樣品流占總量的比例，k越大單位時(shí)間內(nèi)的進(jìn)樣量越 大。負(fù)壓力一定時(shí)，通過控制樣品進(jìn)樣的時(shí)間，可以控制進(jìn)樣的樣品量。
第三步，重新使得施加在樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw上的負(fù)壓值恢復(fù)到與 第一步相同，在所述"十"字通道中心重新形成水力門控；
至此，一次樣品進(jìn)樣完成，重復(fù)上述步驟，即可實(shí)現(xiàn)多次連續(xù)進(jìn)樣。
本實(shí)施例還提供了一種實(shí)現(xiàn)上述方法的裝置(見圖2)，該裝置包括"十"字型微賴
'右
'右
控芯片1、儲(chǔ)液池3、連接管4、三通電磁閥5和6、壓力發(fā)生單元7和主機(jī)9，"十"字型微^ 控芯片1上的"十"字通道的四個(gè)末端都安裝有儲(chǔ)液池3，樣品端s上安裝有樣品儲(chǔ)液池，樣 品廢液端sw上安裝有樣品廢液池、緩沖液端b上安裝有緩沖液儲(chǔ)液池緩沖液廢液端bw上 安裝有緩沖液廢液池。 樣品加入樣品儲(chǔ)液池，同等體積的緩沖液分別加入緩沖儲(chǔ)液池、緩沖液廢液池和 樣品廢液池sw。由于液面相等，此時(shí)樣品不會(huì)流入樣品分析通道o-bw。壓力發(fā)生單元7的 兩個(gè)壓力輸出端口 g禾P j用于輸出產(chǎn)生門控所需的負(fù)壓，另兩個(gè)壓力輸出端口 f和h用于 輸出使樣品進(jìn)樣的負(fù)壓。三通電磁閥5和6分別用于控制壓力發(fā)生單元7的壓力輸出端口 之間的切換，以選擇產(chǎn)生門控負(fù)壓或進(jìn)樣負(fù)壓。本實(shí)施例中的三通電磁閥的c端和d端之 間形成常開連接；c端和e端之間為常閉連接，即通電后連通。通過連接管4分別連接三通 電磁閥5、6的c端和儲(chǔ)液池bw和sw。連接管有很好的彈性，能夠和儲(chǔ)液池形成緊密的連 接。啟動(dòng)主機(jī)9后，電磁閥5、6的c端連通e端，g、 j端的負(fù)壓同時(shí)施加到bw和sw。樣品 溶液在負(fù)壓驅(qū)動(dòng)下在"十"字型微流控芯片的中心o形成門控，即樣品由s端全部流入sw 端。電磁閥5、6切換c端和d、e之間的連接，改變bw和sw上的壓力比值，使樣品進(jìn)入樣品 分析通道o-bw，每次進(jìn)樣時(shí)間結(jié)束后，系統(tǒng)自動(dòng)切換三通電磁閥5、6回到門控狀態(tài)。
通過控制樣品進(jìn)樣的時(shí)間，可以控制進(jìn)樣的樣品量，通過多次切換電磁閥，即可實(shí) 現(xiàn)多次連續(xù)進(jìn)樣。 進(jìn)樣結(jié)束后，設(shè)置壓力發(fā)生單元7的f、 h端口為大氣壓，主機(jī)9給電磁閥5、6斷 電，c端連通到f、h端口。 另外，如果在通道o-bw填充有色譜分離的固定相，可以實(shí)現(xiàn)多組分樣品的分離。
7如將細(xì)胞定位在分析通道o-bw，選擇細(xì)胞剌激物作為樣品可以實(shí)現(xiàn)時(shí)間可控的細(xì)胞剌激， 用于研究細(xì)胞信號(hào)通路、毒理學(xué)等。 另外，該裝置還可以包括信號(hào)檢測單元8，用于將收集的信號(hào)傳輸給主機(jī)9，主機(jī)9 對(duì)信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控、分析、存儲(chǔ)。 下面以熒光素樣品進(jìn)樣為例，具體說明本方法的特點(diǎn)和性能。 實(shí)驗(yàn)中使用的微流控芯片1的微通道2的幾何尺寸為高60 ii m、寬80 ii m，o-bw通 道長18. 5mm，其他通道長6. 5mm。 信號(hào)檢測單元8為倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)。該系統(tǒng)配備CCD相機(jī)和光子計(jì)數(shù)器作為 檢測器。CCD相機(jī)用于觀察微通道2上o處，流體門控和進(jìn)樣的情況。光子計(jì)數(shù)器用于檢測 分析通道o-bw上某一點(diǎn)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。汞燈作為激發(fā)光源，激發(fā)光通過激發(fā)濾光 片，被60X物鏡聚焦到離中心o點(diǎn)200 i！ m處。發(fā)射光經(jīng)過物鏡、發(fā)射濾光片被光子計(jì)數(shù)器 收集。 50yL的1X10—SM熒光素的水溶液作為樣品加入s端的儲(chǔ)液池中，將相同體積 的超純水加入其他儲(chǔ)液池。設(shè)置壓力發(fā)生單元7的壓力輸出端口 g、 j分別為_3600Pa 和-2400Pa，連接三通電磁閥5、6的c端和儲(chǔ)液池bw和sw。啟動(dòng)主機(jī)9后，電磁閥5、6的c 端連通e端，g、j端的負(fù)壓同時(shí)施加到bw和sw，形成樣品緊密門控(見圖3)。設(shè)置壓力發(fā) 生單元7的壓力輸出端口 f、h壓力分別為-3600Pa和0Pa。設(shè)置進(jìn)樣程序參數(shù)，進(jìn)樣為20 次，每次進(jìn)樣時(shí)間為100ms，進(jìn)樣之間的時(shí)間間隔為500ms。啟動(dòng)進(jìn)樣程序，熒光檢測結(jié)果如 圖4所示。使用相同的進(jìn)樣程序，采用六組不同的進(jìn)樣壓力(bw端進(jìn)樣的壓力分別為-120 0、-2400、-3600、-4800、-6000、-7200Pa， sw的進(jìn)樣壓力不變)，得到熒光峰高的最大RSD為 1.6X，熒光峰面積的最大RSD為2. 1%。結(jié)果說明該方法具有很好的重現(xiàn)性。設(shè)置壓力發(fā) 生單元7的壓力輸出端口 f、 h壓力分別為_3600Pa和OPa。設(shè)置進(jìn)樣程序參數(shù)，進(jìn)樣時(shí)間 為5ms、10ms、20ms、50ms、100ms、200ms、500ms、1000ms，每個(gè)進(jìn)樣時(shí)間分別進(jìn)樣20次，每次 進(jìn)樣間的間隔為500ms。計(jì)算所得熒光峰面積的平均值和方差，然后做直線擬合得到，過零 點(diǎn)直線的1 2 = 0.9992(見圖5)。說明該方法有著很好的進(jìn)樣時(shí)間線性度。通過理論計(jì)算 得到在該壓力下進(jìn)樣時(shí)間為100ms時(shí)，進(jìn)樣體積為130pL。說明該方法可以實(shí)現(xiàn)皮升至納升 級(jí)的進(jìn)樣。 下面以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)作為剌激物，利用本發(fā)明剌激海拉(HeLa)細(xì)胞， 具體說明本方法在細(xì)胞剌激方面的應(yīng)用。 本實(shí)驗(yàn)中使用的微流控芯片1的微通道2的幾何尺寸為高36 ii m、寬60 ii m， o-b、 o_s、 o_bw、 o_sw 長度均為7mm。 將培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的HeLa細(xì)胞用胰酶消化、吹打、懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)液中。將 懸浮的HeLa細(xì)胞引入芯片的o-bw端，隔夜貼壁培養(yǎng)。將Fluo-3/AM灌入"十"字通道內(nèi)孵 育HeLa細(xì)胞30分鐘，然后用緩沖液沖洗通道將通道中的Fluo-3/AM洗去。Fluo-3/AM是一 種鈣離子探針，可以反應(yīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的變化。 信號(hào)檢測單元8為倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)。該系統(tǒng)配備CCD相機(jī)和光子計(jì)數(shù)器作為 檢測器。將"十"字型微流控芯片固定在倒置熒光顯微鏡的載物臺(tái)上。CCD相機(jī)用于觀察和 對(duì)焦微通道中的HeLa細(xì)胞。光子計(jì)數(shù)器用于檢測通道o_bw中單個(gè)HeLa細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨 時(shí)間的變化。汞燈作為激發(fā)光源，激發(fā)光通過激發(fā)濾光片，被60X物鏡聚焦到離中心o點(diǎn)較近處的單個(gè)HeLa細(xì)胞上。發(fā)射光經(jīng)過物鏡、發(fā)射濾光片被光子計(jì)數(shù)器收集。
設(shè)置壓力發(fā)生單元7的壓力輸出端口 g、 j分別為_2300Pa和_2900Pa，連接三通電磁閥5、6的c端和儲(chǔ)液池bw和sw。啟動(dòng)主機(jī)9后，電磁閥5、6的c端連通e端，g、 j端的負(fù)壓同時(shí)施加到bw和sw，形成樣品緊密門控(如圖6(A)所示)。50iiL的2X10—5mol/L ATP的水溶液作為樣品加入s端的儲(chǔ)液池中，替代s端的儲(chǔ)液池中的緩沖液。設(shè)置壓力發(fā)生單元7的壓力輸出端口 f、 h壓力分別為-2300 &和OPa。設(shè)置進(jìn)樣程序參數(shù)，進(jìn)樣為14次，每次進(jìn)樣之間的時(shí)間間隔為500ms，進(jìn)樣時(shí)間依次為30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、110ms、120ms、240ms、960ms、10s禾P 200s。每次進(jìn)樣后HeLa細(xì)胞被ATP剌激(如圖6(B))所示，每次進(jìn)樣完后恢復(fù)到門控，ATP被緩沖液沖走，細(xì)胞剌激被停止(如圖6(C))。信號(hào)檢測單元記錄下的單個(gè)HeLa細(xì)胞的熒光變化如圖7所示，通過分析細(xì)胞剌激和響應(yīng)圖，可以得到細(xì)胞信號(hào)通路、細(xì)胞表面受體動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞毒理學(xué)等相關(guān)信息。
權(quán)利要求
一種基于壓力驅(qū)動(dòng)的微流控水力門控樣品進(jìn)樣方法，包括如下步驟第一步，將“十”字型微流控芯片的通道即“十”字通道的四個(gè)末端分別定義為樣品端s，樣品廢液端sw、緩沖液端b和緩沖液廢液端bw，所述“十”字通道的交叉點(diǎn)中心o與緩沖液廢液端bw之間的通道o-bw定義為樣品分析通道，對(duì)樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw施加負(fù)壓，使得在中心o處形成水力門控，此時(shí)樣品端s的樣品流入樣品廢液端sw，緩沖液端b的緩沖液流入緩沖液廢液端bw和樣品廢液端sw；第二步，改變施加在“十”字通道的樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw上的負(fù)壓值，或者保持施加在緩沖液廢液端bw上的負(fù)壓值不變而撤銷施加在樣品廢液端sw上的負(fù)壓，使樣品端s的樣品流入樣品分析通道o-bw，實(shí)現(xiàn)樣品進(jìn)樣；第三步，重新使得施加在樣品廢液端sw和緩沖液廢液端bw上的負(fù)壓值恢復(fù)到與第一步相同，在所述“十”字通道中心重新形成水力門控；至此，一次樣品進(jìn)樣完成，重復(fù)上述步驟，即可實(shí)現(xiàn)多次連續(xù)進(jìn)樣。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述門控狀態(tài)下，施加到所述樣品廢液 端sw和緩沖液廢液端bw的負(fù)壓與門控緊密程度的關(guān)系可以通過以下公式確定<formula>formula see original document page 2</formula>其中Psw和Pbw分別為施加于sw和bw端的負(fù)壓；LS、 Lsw、 Lb、 Lbw分別為通道s-o、 sw-o、b-0、bw-0的長度；g為通道O-SW內(nèi)樣品流占總量的比例。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，樣品進(jìn)樣狀態(tài)下，施加到所述樣品廢 液端sw和緩沖液廢液端bw的負(fù)壓與進(jìn)樣量的關(guān)系可以通過以下公式確定<formula>formula see original document page 2</formula>其中Psw、 Pbw分別為施加于sw、 bw端口的壓力；LS、 Lsw、 Lb、 Lbw分別為通道s-o、 sw-o、b-0、bw-0端的長度；k為進(jìn)樣時(shí)通道O-bw內(nèi)樣品流占總量的比例。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l-3之一所述的方法，其特征在于，在上述第二步中，可通過控制樣品進(jìn)樣的時(shí)間，來控制進(jìn)樣的樣品量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4之一所述的方法，其特征在于，所述的樣品為液體樣品。
6. —種實(shí)現(xiàn)上述權(quán)利要求1-5之一所述方法的裝置，該裝置包括"十"字型微流控芯 片(1)、多個(gè)儲(chǔ)液池(3)、連接管(4)、三通電磁閥(5，6)、壓力發(fā)生單元(7)和主機(jī)(9)，所述 "十"字型微流控芯片(1)上的"十"字通道的四個(gè)末端都安裝有儲(chǔ)液池(3)，所述三通電磁 閥(5，6)用于控制壓力發(fā)生單元(7)輸出壓力的切換，以選擇產(chǎn)生門控負(fù)壓和進(jìn)樣負(fù)壓。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于，該裝置還包括信號(hào)檢測單元(8)，用于將 收集的信號(hào)傳輸給主機(jī)(9)，以對(duì)所收集的信號(hào)進(jìn)行分析處理。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的裝置，其特征在于，所述的信號(hào)檢測單元(8)為倒置熒光 顯微鏡系統(tǒng)。
9. 權(quán)利要求6-8之一所述的裝置在對(duì)細(xì)胞的藥物剌激中的應(yīng)用，具體過程如下 將細(xì)胞引入"十"字型微流控芯片的o-bw端，并培養(yǎng)至貼壁，啟動(dòng)主機(jī)(9)后，所述負(fù)壓同時(shí)施加到bw和sw，形成樣品門控，藥物的水溶液作為樣品加入s端的儲(chǔ)液池中，sw、 b 和bw端的儲(chǔ)液池中加緩沖液，設(shè)置進(jìn)樣程序參數(shù)后進(jìn)行多次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣后細(xì)胞被藥物剌激，每次進(jìn)樣完畢后恢復(fù)到門控，藥物被緩沖液帶走，細(xì)胞剌激被中止；所述信號(hào)檢測單元記錄下細(xì)胞的熒光變化，通過分析細(xì)胞剌激和響應(yīng)時(shí)間圖對(duì)獲得細(xì) 胞生理信息。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微流控樣品進(jìn)樣方法、裝置及其應(yīng)用。該裝置主要包括結(jié)構(gòu)為“十”字型微通道的微流控芯片、儲(chǔ)液池、連接管、三通電磁閥、壓力發(fā)生單元、信號(hào)檢測單元、主機(jī)。其特征是門控狀態(tài)施加負(fù)壓到bw和sw端驅(qū)動(dòng)微流體，在“十”字通道中心形成水力門控，即s端的樣品全部流入sw端，b端的緩沖液流入bw和sw端。b端緩沖液在bw和sw端的分流比通過加壓端的壓力比控制。通過瞬時(shí)增大bw和sw端的壓力比值，s端的樣品流入通道o-bw。進(jìn)樣的體積可以通過調(diào)節(jié)壓力比值和進(jìn)樣時(shí)間控制。每次進(jìn)樣完畢后，儀器自動(dòng)恢復(fù)水力門控狀態(tài)，進(jìn)樣的樣品在o-bw端可以被分離、檢測和分析，應(yīng)用本方法、儀器還可以進(jìn)行細(xì)胞的藥物刺激試驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12M1/00GK101773861SQ201010138140
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者馮曉均, 劉筆鋒, 孫建, 陳璞 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)