專利名稱：超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株及標記方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞標記領域，特別涉及超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株及其 標記方法與應用。
背景技術：
細胞影像學作為分子影像學的一個分支發(fā)展迅速，目前用于磁共振成像(簡稱 MRI)研究的細胞標記物主要有順磁性釓螯合物、超順磁性氧化鐵納米顆粒以及過氟化碳 等。常用順磁性釓離子造影劑如馬根維顯，此類造影劑本身不能穿透細胞膜進入細胞內， 使用釓離子造影劑標記細胞需要陽離子脂質體介導，并且需要與細胞進行很長的共同孵育 時間，因此較少用于細胞的標記。過氟化碳是通過19F的磁共振信號改變而成像，可以避免 1H造影劑在顯像過程中水分子信號的干擾，從而實現(xiàn)無背景干擾的顯像，但是由于常規(guī)MRI 很少使用19F的磁共振成像，此方法難以推廣。超順磁性氧化鐵(簡稱SPI0，在本專利申請 的說明書中，“SPI0”即為超順磁性氧化鐵)納米顆粒在磁場中可以產(chǎn)生瞬時的較大磁場， 對周圍分子的磁化產(chǎn)生干擾，造成質子的快速去相位，對外加磁場具有高敏感性，同時氧化 鐵微粒具有良好的生物相容性，從而以其獨特的優(yōu)勢廣泛用于磁共振分子顯像。使用SPIO標記細胞的方法主要有機械法和細胞吞噬法。細胞吞噬法是最常用的 標記方法，主要是利用細胞的胞吞作用將大分子和顆粒包裹成小囊泡吞入細胞質內。SPIO 的細胞吞噬主要通過三種方式實現(xiàn)。一種方式是將SPIO涂被在病毒外殼或脂質體表面，通 過病毒感染細胞或脂質體轉染進入細胞內。再一種方式是使用單克隆抗體、HIV病毒反作用 因子轉錄蛋白類、肽類、多聚陽離子大分子轉染因子等對SPIO進行表面修飾，使SPIO顆粒 與細胞膜貼近，從而增加細胞吞噬的幾率。又一種方式是通過改變氧化鐵納米顆粒晶體的 表面包被物使氧化鐵顆粒與細胞的親和力增加，從而使細胞能夠吞噬更多的氧化鐵顆粒。目前，最常見的是SPIO用于干細胞的標記，但尚未見到使用SPIO標記人胰腺癌細 胞的報道。然而，胰腺癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，早期診斷困難，死亡率高，迫 切需要建立早期診斷、治療以及監(jiān)測治療效果的有效方法。因此用SPIO標記胰腺癌細胞 株，建立胰腺癌動物模型，并運用MRI技術早期觀察胰腺癌細胞在活體動物模型體內的分 裂增殖情況，對了解胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程及早期診斷和開辟新的治療途徑、改善胰腺癌 的治療效果、改變其預后、提高病人的生存時間和生活質量具有重大意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株，以便通過磁共 振成像(MRI)研究人胰腺癌細胞在體外的生長增殖特性，及構建胰腺癌動物模型通過磁共 振成像(MRI)觀察腫瘤細胞在體內的生長、增殖及浸潤等生物學行為，為胰腺癌的早期診 斷和開辟新的治療途徑提供支持；本發(fā)明的再一目的是提供用超順磁性氧化鐵標記人胰腺 癌細胞株的方法和優(yōu)化標記條件。本發(fā)明所述超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株，其細胞內含有超順磁性氧化鐵。此種人胰腺癌細胞株仍具有普通人胰腺癌細胞株的生物學特性，增殖速度快，細胞多次 傳代后其性狀、形態(tài)保持不變，能夠長期冷凍保存。實驗表明，將SPIO標記的人胰腺癌細胞消化離心并重懸后置于離心管或EP管內 行磁共振掃描，能夠在細胞水平實現(xiàn)磁共振成像，因此可在磁共振成像中應用。3D-FIESTA 序列能夠更敏感的反應鐵離子的濃度變化，可以作為檢測SPIO的最佳掃描序列。實驗表明，將SPIO標記的人胰腺癌細胞消化離心后用磷酸鹽緩沖液(PBS液)重 懸，使每毫升細胞懸液含人胰腺癌細胞數(shù)約1XIO5,將所述SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液 按每只裸鼠0. 3ml的劑量注射于裸鼠腋下的皮下(注射一次)，SPF級條件下繼續(xù)飼養(yǎng)，注 射后一周(七天)即可見皮下有瘤塊形成，因此可在構建胰腺癌動物模型中應用。實驗表明，所構建胰腺癌動物模型的磁共振圖像能清楚顯示腫瘤中央部鐵離子聚 集較多，周圍部分腫瘤組織含有鐵離子但濃度明顯降低。提示細胞內的鐵離子隨著細胞的 分裂分散到子代細胞內，使其濃度大大降低，但腫瘤中央的腫瘤細胞分裂緩慢或處于靜止 狀態(tài)。這為胰腺癌生長發(fā)展的研究及腫瘤治療研究提供了一個活體觀察的客觀依據(jù)。
本發(fā)明所述用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，采用多聚賴氨酸 (PLL)作為轉染介質，通過含超順磁性氧化鐵、多聚賴氨酸的標記液與細胞共同孵育，步驟 如下(1)標記液的配制以超順磁性氧化鐵納米離子、質量濃度0. 多聚賴氨酸儲備液、含新生牛血清的 1640培養(yǎng)液為原料，將所述原料在常壓、室溫下混合均勻即形成標記液，所述標記液中，超 順磁性氧化鐵納米離子與0.1%多聚賴氨酸儲備液的體積比為3 1，鐵離子的濃度至少為 168 μ g/ml ；(2)人胰腺癌細胞株的培養(yǎng)將細胞濃度0. 5XlOVml IX 106/ml的人胰腺癌細胞懸液種植于培養(yǎng)瓶中，并加 入含新生牛血清的1640培養(yǎng)液，然后將所述培養(yǎng)瓶放入CO2孵箱中，于37°C進行培養(yǎng)，當人 胰腺癌細胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底的80%后換液；(3)人胰腺癌細胞株的標記將步驟(1)配制的標記液加入步驟(2)培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液中形成標記體系，所述 標記液的加入量以標記體系中鐵離子的濃度達到4. 2 84μ g/ml為限，將標記體系放入 CO2孵箱中，于37°C培養(yǎng)20 24小時，培養(yǎng)時間屆滿后將標記體系從CO2孵箱中取出，依 次進行棄培養(yǎng)液、用PBS液沖洗、用胰酶消化離心、用含新生牛血清的1640培養(yǎng)液重懸的操 作，即獲得超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株。磁共振成像和細胞生物活性檢測實驗表明，所述標記液的加入量使標記體系中鐵 離子的濃度在21 42 μ g/ml時所形成的SPIO標記的人胰腺癌細胞的生物活性好，且成像
效果最佳。上述方法中，所述超順磁性氧化鐵納米粒子是以Fe3O4和Fe2O3納米結晶(單晶) 為磁性核心，外面包被了碳氧葡聚糖的納米粒子，所述超順磁性氧化鐵納米粒子的粒徑為 45nm 60nm(包括其包被物)。本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞株，能夠在細胞水平實現(xiàn)MR成像，能夠靈敏且較清晰的顯示磁共振(MR)信號的改變，因而可通過磁共振成像(MRI)研究人胰腺癌細 胞在體外的生長增殖特性。2、本發(fā)明所述超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株所構建的胰腺癌動物模型， 可以通過磁共振成像(MRI)觀察腫瘤細胞在體內的生長、增殖及浸潤等生物學行為，探討 胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵潤機制，為胰腺癌生長發(fā)展的研究及腫瘤治療研究提供活體觀察的 客觀依據(jù)，為胰腺癌的早期診斷和開辟新的治療途徑提供支持。3、本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞株，具有增殖能力強，成瘤率高，成瘤時 間短等特點，因而通過該SPIO標記的人胰腺癌細胞株可簡便、快速地構建胰腺癌動物模 型。4、本發(fā)明提供了 SPIO標記的人胰腺癌細胞生物活性好、成像效果最佳的標記體 系中鐵離子的濃度范圍，提供了檢測SPIO的最佳掃描序列。5、本發(fā)明所述用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，由于采用多聚賴氨 酸(PLL)作為轉染介質，通過含超順磁性氧化鐵、多聚賴氨酸的標記液與細胞共同孵育，因 而能夠高效地將氧化鐵顆粒轉移進細胞內，從而使細胞標記率大大增加。6、本發(fā)明所述用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，由于所使用的SPIO 納米粒子是以Fe3O4和Fe2O3為磁性核心、外面包被了碳氧葡聚糖的納米粒子(葡聚糖包被 后的氧化鐵顆粒呈電中性)，因而SPIO納米粒子與細胞膜的結合率大大增加，細胞的吞噬 作用大大增加，同時葡聚糖提供了良好的化學平臺利于進一步的生化調控。


圖1是本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞株用普魯士藍染色后的光學顯微照 片(IOOx物鏡觀察)，可見大量鐵顆粒位于細胞質內(彩色照片中鐵顆粒呈藍色)。圖2是本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞株的體外磁共振Tl-SE序列MR圖 像；圖3是本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞株的體外磁共振T2-FRFSE序列MR 圖像；圖4是本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞株的體外磁共振Tl-SPGR序列MR圖 像；圖5是本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞株的體外磁共振3D-FIESTA序列MR 圖像；圖6是用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞構建的裸鼠種植性胰腺癌模型照 片，照片中的裸鼠為注射SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液一周后的狀況；圖7是用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞構建的裸鼠種植性胰腺癌模型照 片，照片中的裸鼠為注射SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液兩周后的狀況；圖8是用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞構建的裸鼠種植性胰腺癌模型照 片，照片中的裸鼠為注射SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液三周后的狀況；圖9是裸鼠種植性胰腺癌模型的磁共振成像圖像，各圖像中，白色細箭頭所指為 瘤塊，白色粗箭頭所指為瘤塊中心的鐵離子濃聚區(qū)；其中圖像A為無標記的裸鼠移植瘤 模型的自旋回波Tl加權圖像，種植瘤塊顯示為等信號；圖像B為無標記的裸鼠移植瘤模型的梯度回波Tl加權圖像，種植瘤塊顯示為等信號；圖像C為無標記的裸鼠移植瘤模型的自旋回波T2加權圖像，種植瘤塊顯示為高信號；圖像D為無標記的裸鼠移植瘤模型的 3D-FIESTA圖像，種植瘤塊顯示為稍高信號；圖像E為用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌 細胞懸液注射一周后的裸鼠移植瘤模型的自旋回波Tl加權圖像，種植瘤塊顯示為低信號； 圖像F為用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液注射一周后的裸鼠移植瘤模型的梯 度回波Tl加權圖像，種植瘤塊顯示為低信號；圖像G為用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺 癌細胞懸液注射一周后的自旋回波T2加權圖像，種植瘤塊顯示為低信號；圖像H為用本發(fā) 明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液注射一周后的3D-FIESTA圖像，種植瘤塊顯示為低 信號；圖像I為用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液注射兩周后的自旋回波Tl加 權圖像，種植瘤塊顯示為等信號，其內可見低信號的鐵離子濃聚區(qū)；圖像J為用本發(fā)明所述 SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液注射兩周后的梯度回波Tl加權圖像，種植瘤塊顯示為等信 號，其內可見低信號的鐵離子濃聚區(qū)；圖像K為用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞懸 液注射兩周后的自旋回波T2加權圖像，種植瘤塊顯示為高信號，其內可見低信號的鐵離子 濃聚區(qū)；圖像L為用本發(fā)明所述SPIO標記的人胰腺癌細胞懸液注射兩周后的3D-FIESTA圖 像，種植瘤塊顯示為稍高信號，其內可見低信號的鐵離子濃聚區(qū)。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明所述超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株及其制備方 法與應用作進一步說明。實施例1 :SPI0標記的人胰腺癌細胞體外磁共振成像1、材料和設備人胰腺癌PANC-I細胞株購于四川大學；SPIO 商品名Resovist (SHU555A)，以Fe3O4和Fe2O3納米結晶為磁性核心，外面包 被了碳氧葡聚糖，粒徑(包括其包被物)45nm-60nm，購于德國SCHERING(先靈)公司；質量濃度0. 的多聚賴氨酸儲備液購于博瑞克生物有限公司；新生牛血清購于北京元亨圣馬生物技術研究所；1640培養(yǎng)液購于GIBICO公司；胰酶購于北京元亨圣馬生物技術研究所磷酸鹽緩沖液(PBS) :pH值7. 4，自行配制；六孔板購于CORNING公司CO2孵箱購于Healforce公司型號HF90漩渦振蕩器購于金壇市城西天竟實驗儀器廠型號XH-C超導MR成像儀型號1. 5T，美國GE公司生產(chǎn)。2、實驗方法(1)標記液的配制SPI030y 1 (每微升含鐵離子28yg)、質量濃度0. 1 %的多聚賴氨酸儲備液10 μ 1、 含新生牛血清的1640培養(yǎng)液960 μ 1，所述含新生牛血清的1640培養(yǎng)液中，新生牛血清與 1640培養(yǎng)液的體積比為1 4;將SPIO和質量濃度0.1%的多聚賴氨酸儲備液加入含新生 牛血清的1640培養(yǎng)液中，在常壓、室溫(25°C )下通過漩渦振蕩器持續(xù)振蕩將它們混合均勻(約60分鐘)即形成標記液，所述標記液中，鐵粒子濃度為840ug/ml ；(2)體外磁共振掃描樣品的制備將未標記的人胰腺癌PANC-I細胞株用質量濃度0. 25 %的胰酶消化離心并用含 新生牛血清的1640培養(yǎng)液(新生牛血清與1640培養(yǎng)液的體積比為1 4)重懸后，以約 1. OXlOVml細胞濃度、每孔2ml細胞懸液接種于六孔板中，然后將所述六孔板放入CO2孵 箱(濕度為飽和濕度，CO2的體積濃度為5%)中于37°C進行培養(yǎng)，24小時后換液，換液時所 述含新生牛血清的 1640 培養(yǎng)液按 2000 μ 1，1990 μ 1，1980 μ 1，1950 μ 1，1900 μ 1，1800 μ 1 分別加入六孔板的六個孔中，然后量按上述順序分別向六孔板的六個孔中加入步驟(1) 配制的標記液0 μ 1，10 μ 1，20 μ 1，50 μ 1，100 μ 1，200 μ 1，使六孔板各孔中的總液量均為 2000 μ 1 (六孔板各孔中鐵離子濃度分別為0 μ g/ml，4. 2 μ g/ml，8. 4 μ g/ml，21 μ g/ml， 42 μ g/ml，84 μ g/ml)，輕輕搖勻后將六孔板放入CO2孵箱(濕度為飽和濕度，CO2的體積濃 度為5%)中于37°C孵育(培養(yǎng))24小時，孵育(培養(yǎng))時間屆滿后取出六孔板，用移液器 吸出培養(yǎng)液，用PBS液反復沖洗各孔以去除游離的SPI0，然后將六孔板各孔中的液體吸出， 將貼壁的細胞用質量濃度0. 25%的胰酶消化離心后，每孔2ml 1640培養(yǎng)液重懸細胞，并分 別將各孔中的細胞懸液裝入六只凍存管中。6只凍存管用封口膜封口，振蕩器上混勻。(3)磁共振掃描對步驟(2)中的6只凍存管分別進行Tl-SE、T2-FRFSE、T1_SPGR、3D_FIESTA序 列磁共振掃描。成像條件采用八通道頭顱線圈，視野(FOV) 12X12，層厚2-3mm，層間距 0-0. 5mm，重建矩陣 256X192。Tl-SE序列磁共振掃描的圖像見圖2，T2-FRFSE序列磁共振掃描的圖像見圖3， Tl-SPGR序列磁共振掃描的圖像見圖4，3D-FIESTA序列磁共振掃描的圖像見圖5，各圖中， PANC-I細胞中鐵離子濃度自左向右逐漸增加，各圖中的第一個圖，PANC-I細胞中鐵離子濃 度為0，為空白對照圖像。從圖2、圖3、圖4、圖5可以看出用SPIO標記的人胰腺癌細胞，隨著標記液中鐵 離子濃度的增大，磁共振信號呈降低趨勢，其中標記液中鐵離子濃度為21Ug/ml、42Ug/ml， 84ug/ml的圖像與空白對照圖像之間的信號差別明顯，可以作為優(yōu)選標記濃度，以利于MRI 觀察。在各MR序列中，3D-FIESTA序列能夠更敏感的反應鐵離子的濃度變化，可以作為檢測 SPIO的最佳掃描序列。實施例2 =SPIO標記的人胰腺癌細胞的生長活性檢測1、材料和設備人胰腺癌PANC-I細胞株購于四川大學；SPIO 商品名Resovist (SHU555A)，以Fe3O4和Fe2O3納米結晶為磁性核心，外面包 被了碳氧葡聚糖，粒徑(包括其包被物)45nm-60nm，購于德國SCHERING(先靈)公司；質量濃度0. 的多聚賴氨酸儲備液購于博瑞克生物有限公司；新生牛血清購于北京元亨圣馬生物技術研究所；1640培養(yǎng)液購于GIBICO公司；胰酶購于北京元亨圣馬生物技術研究所；磷酸鹽緩沖液(PBS) :pH值7. 4，自行配制；96孔板購于CORNING公司；
CO2孵箱購于Healforce公司型號HF90 ；漩渦振蕩器購于金壇市城西天竟實驗儀器廠型號XH-CMTT液購于博瑞克生物有限公司二甲基亞砜(DMSO)購于博瑞克生物有限公司酶標儀Bio-Rad680 型2、實驗方法(1)標記液的配制SPI030y 1 (每微升含鐵離子28yg)、質量濃度0. 1 %的多聚賴氨酸儲備液10 μ 1、 含新生牛血清的1640培養(yǎng)液960 μ 1，所述含新生牛血清的1640培養(yǎng)液中，新生牛血清與 1640培養(yǎng)液的體積比為1 4;將SPIO和質量濃度0.1%的多聚賴氨酸儲備液加入含新生 牛血清的1640培養(yǎng)液中，在常壓、室溫(25°C )下通過漩渦振蕩器持續(xù)振蕩將它們混合均勻 (約60分鐘)即形成標記液，所述標記液中，鐵粒子濃度為840ug/ml ；(2)細胞活性檢測樣品的制備及活性檢測將未標記的人胰腺癌PANC-I細胞株用質量濃度0. 25%的胰酶消化離心并用含新 生牛血清的1640培養(yǎng)液(新生牛血清與1640培養(yǎng)液的體積比為1 4)重懸后，將細胞懸 液每孔200ul (約2. 0 X IO4細胞數(shù))接種于96孔板中，共24孔，置于CO2孵箱(濕度為飽和 濕度，CO2的體積濃度為5% )于37°C孵育(培養(yǎng))24小時取出并換液，換液時每孔加入所 述標記液及含新生牛血清的1640培養(yǎng)液共200ul，使每4孔鐵離子濃度分別為0、4. 2、8. 4、 21、42、84ug/ml，輕輕搖勻后將96孔板放入CO2孵箱(濕度為飽和濕度，CO2的體積濃度為 5%)中于37°C孵育(培養(yǎng))24小時，孵育完成后倒掉標記液及培養(yǎng)液，并用PBS沖洗3次 后每孔加入200ul含新生牛血清的1640培養(yǎng)液和20ulMTT液放入培養(yǎng)箱中孵育，4h后倒掉 含MTT的培養(yǎng)液，然后每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 200ul，室溫下輕輕振蕩96孔板，20min 后于酶標儀上采用570nm波長測量每孔吸光度值D(570)。測量數(shù)據(jù)見下表
Fe 離子濃度 04. 2 8. 4214284
(ug/ml)
D(570)值 079 080 080 082 076 063從上表可見，標記體系中鐵離子濃度在84ug/ml時，SPIO標記的人胰腺癌細胞 PANC-I的生長活性受抑制。實施例3 用SPIO標記人胰腺癌細胞株1、材料和設備人胰腺癌PANC-I細胞株購于四川大學；SPIO 商品名Resovist (SHU555A)，以Fe3O4和Fe2O3納米結晶為磁性核心，外面包 被了碳氧葡聚糖，粒徑(包括其包被物)45nm-60nm，購于德國SCHERING(先靈)公司；質量濃度0. 的多聚賴氨酸儲備液購于博瑞克生物有限公司；新生牛血清購于北京元亨圣馬生物技術研究所；1640培養(yǎng)液購于GIBICO公司；胰酶購于北京元亨圣馬生物技術研究所；
磷酸鹽緩沖液(PBS) :pH值7. 4，自行配制；CO2孵箱購于Healforce公司型號HF90 ；漩渦振蕩器購于金壇市城西天竟實驗儀器廠型號XH-C。2、實驗方法(1)標記液的配制SPI030y 1 (每微升含鐵離子28yg)、質量濃度0. 1 %的多聚賴氨酸儲備液10 μ 1、 含新生牛血清的1640培養(yǎng)液960 μ 1，所述含新生牛血清的1640培養(yǎng)液中，新生牛血清與 1640培養(yǎng)液的體積比為1 4;將SPIO和質量濃度0.1%的多聚賴氨酸儲備液加入含新生 牛血清的1640培養(yǎng)液中，在常壓、室溫(25°C )下通過漩渦振蕩器持續(xù)振蕩將它們混合均勻 (約60分鐘)即形成標記液，所述標記液中，鐵粒子濃度為840ug/ml ；(2)人胰腺癌細胞株的培養(yǎng)將約1 XlO6Ail人胰腺癌PANC-I細胞懸液種植于培養(yǎng)瓶中并加入含新生牛血清 的1640培養(yǎng)液，然后將所述培養(yǎng)瓶放入CO2孵箱中，于37°C進行培養(yǎng)，當人胰腺癌細胞鋪滿 培養(yǎng)瓶瓶底的80%后換液，所述含新生牛血清的1640培養(yǎng)液中，新生牛血清與1640培養(yǎng)液 的體積比為1 4;所述CO2孵箱內的濕度為飽和濕度，CO2的體積濃度為5%。(3)人胰腺癌細胞株的標記將步驟(1)配制的標記液加入步驟(2)培養(yǎng)獲得的含人胰腺癌細胞的培養(yǎng)液中形 成標記體系，所述標記液的加入量以標記液中鐵離子的濃度達到42μ g/ml為限，將標記體 系放入CO2孵箱中，于37°C培養(yǎng)20小時，培養(yǎng)時間屆滿后將標記體系從CO2孵箱中取出，棄 培養(yǎng)液、用PBS液反復沖洗3次以去除游離的SPI0，然后用質量濃度0. 25%的胰酶消化離 心、再用1640培養(yǎng)液重懸，即獲得超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株。將所制備的SPIO標記的人胰腺癌細胞株用普魯士藍染色后，其光學顯微照片 (IOOx物鏡觀察)見圖1，從圖1中可見，大量鐵顆粒位于細胞質內(彩色照片中鐵顆粒呈
.監(jiān)) ο實施例4 構建裸鼠種植性腫瘤模型1、實驗動物與材料實驗動物裸鼠，雄性，4-5周齡，購于四川大學動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級動物實 驗室(川北醫(yī)學院自建)；實施例3制備的SPIO標記的人胰腺癌PANC-I細胞株；磷酸鹽緩沖液(PBS) :pH值7. 4，自行配制。2、實驗方法裸鼠30只，每只原始體重20g左右(用電子秤稱量)，將其分為實驗組和對照組， 實驗組為22只裸鼠，對照組為8只裸鼠。將實施例3制備的SPIO標記的人胰腺癌PANC-I細胞株用磷酸鹽緩沖液(PBS)重 懸，使每毫升細胞懸液含PANC-I細胞數(shù)約1 X IO5,實驗組每只裸鼠注射一次SPIO標記的人 胰腺癌PANC-I細胞懸液，注射劑量為0. 3ml。將無標記的人胰腺癌PANC-I細胞株用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，使每毫升細胞懸 液含PANC-I細胞數(shù)約1X105，對照組每只裸鼠注射一次無標記的人胰腺癌PANC-I細胞懸 液，注射劑量為0. 3ml。
將實驗組的裸鼠左側腋下部位皮膚用質量濃度75%的酒精消毒，用Iml無菌注射器吸取SPIO標記的人胰腺癌PANC-I細胞懸液0. 3ml，于裸鼠左側腋下皮下注射(術者戴無 菌手套)，注射操作后正常飼養(yǎng)。將對照組的裸鼠左側腋下部位皮膚用質量濃度75%的酒精消毒，用Iml無菌注射 器吸取無標記的人胰腺癌PANC-I細胞懸液0. 3ml，于裸鼠左側腋下皮下注射(術者戴無菌 手套)，注射操作后正常飼養(yǎng)。經(jīng)觀察，注射SPIO標記的人胰腺癌PANC-I細胞懸液一周后即可見裸鼠皮下有瘤 塊形成(見圖6)，且腫瘤生長迅速(見圖7、圖8)。注射無標記的人胰腺癌PANC-I細胞懸 液一周后也可見裸鼠皮下有瘤塊形成，且腫瘤生長迅速。實施例5 荷瘤裸鼠的磁共振成像1、實驗動物與材料、設備實驗動物實施例4構建的裸鼠種植性腫瘤模型；水合氯醛購自湖南科倫藥業(yè)股份有限公司；超導MR成像儀型號1.5T，美國GE公司生產(chǎn)；動物實驗線圈小動物專用MRI線圈。2、實驗方法(1)術者帶無菌手套，用Iml無菌注射器吸取麻醉用藥物水合氯醛0. 03ml (一只模 型鼠的劑量)，對實驗組和對照組的模型鼠行腹腔注射。(2)將麻醉效果良好的模型鼠放入小鼠專用動物實驗線圈，取仰臥位，頭先進。(3)用超導MR成像儀對模型鼠進行磁共振掃描，視野爾0力6\6011，層厚2-3111111， 層間距 0-0. 5mm，重建矩陣 256 X 192 或 256 X 160，成像序列為 Tl-SE、Tl-SPGR、T2-FRFSE、 3D-FIESTA。(4)掃描結束后，將磁共振圖像傳至工作站。所獲磁共振圖像見圖9。從圖9可以看出SPI0標記后的人胰腺癌細胞種植生長 1周的瘤塊在各序列圖像中均呈低信號。隨著腫瘤的繼續(xù)生長，各序列圖像中腫瘤中央?yún)^(qū)仍 為低信號，而腫塊外圍部分在TlWI及3D-FIESTA序列呈等信號，在T2WI序列呈稍高信號， 但其信號仍然較對照組信號低，表明腫瘤中央?yún)^(qū)鐵離子聚集較多，周圍部分腫瘤組織含有 鐵離子但濃度明顯降低。綜合各序列圖像提示，隨著腫瘤的生長，細胞內的鐵離子也會隨著 細胞的分裂分散到子代細胞內，使其濃度大大降低，但腫瘤中央?yún)^(qū)仍然可見較多的鐵離子 聚集，提示此處的腫瘤細胞分裂緩慢或處于靜止狀態(tài)。因此可為胰腺癌生長發(fā)展的研究及 腫瘤治療研究提供活體觀察的客觀依據(jù)。
權利要求
一種超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株，其特征在于所述人胰腺癌細胞內含有超順磁性氧化鐵。
2.一種用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，其特征在于步驟如下(1)標記液的配制以超順磁性氧化鐵納米離子、質量濃度0. 多聚賴氨酸儲備液、含新生牛血清的 1640培養(yǎng)液為原料，將所述原料在常壓、室溫下混合均勻即形成標記液，所述標記液中，超 順磁性氧化鐵納米離子與0.1%多聚賴氨酸儲備液的體積比為3 1，鐵離子的濃度至少為 168 μ g/ml ；(2)人胰腺癌細胞株的培養(yǎng)將細胞濃度0. 5 X 106/ml 1 X 106/ml的人胰腺癌細胞懸液種植于培養(yǎng)瓶中，并加入含 新生牛血清的1640培養(yǎng)液，然后將所述培養(yǎng)瓶放入CO2孵箱中，于37°C進行培養(yǎng)，當人胰腺 癌細胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底的80%后換液；(3)人胰腺癌細胞株的標記將步驟(1)配制的標記液加入步驟(2)培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液中形成標記體系，所述標記 液的加入量以標記體系中鐵離子的濃度達到4. 2 μ g/ml 84 μ g/ml為限，將標記體系放入 CO2孵箱中，于37°C培養(yǎng)20小時 24小時，培養(yǎng)時間屆滿后將標記體系從CO2孵箱中取出， 依次進行棄培養(yǎng)液、用PBS液沖洗、用胰酶消化離心、用含新生牛血清的1640培養(yǎng)液重懸的 操作，即獲得超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株。
3.根據(jù)權利要求2所述的用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，其特征在 于人胰腺癌細胞株的標記時，所述標記液的加入量以標記體系中鐵離子的濃度達到21 μ g/ ml 42 μ g/ml 為限。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，其特征 在于所述超順磁性氧化鐵納米粒子是以Fe3O4和Fe2O3納米結晶為磁性核心，外面包被了碳 氧葡聚糖的納米粒子。
5.根據(jù)權利要求2或3所述的用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，其特征 在于所述超順磁性氧化鐵納米粒子的粒徑為45nm 60nm。
6.根據(jù)權利要求4所述的用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，其特征在于 所述超順磁性氧化鐵納米粒子的粒徑為45nm 60nm。
7.權利要求1所述超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株在構建胰腺癌動物模型中 的應用。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于將超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞懸 液注射于裸鼠腋下的皮下，SPF級條件下繼續(xù)飼養(yǎng)，注射后一周即有瘤塊形成。
9.權利要求1所述超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株在磁共振成像中的應用。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于包括細胞水平的磁共振成像和動物模型 的磁共振成像。
全文摘要
一種超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株，其細胞內含有超順磁性氧化鐵。一種用超順磁性氧化鐵標記人胰腺癌細胞株的方法，采用多聚賴氨酸作為轉染介質，通過含超順磁性氧化鐵-多聚賴氨酸的標記液與細胞共同孵育，步驟如下(1)標記液的配制；(2)人胰腺癌細胞株的培養(yǎng)；(3)人胰腺癌細胞株的標記。所述超順磁性氧化鐵標記的人胰腺癌細胞株可在磁共振成像中應用，在構建胰腺癌動物模型中應用。
文檔編號C12R1/91GK101818128SQ20101013842
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月2日 優(yōu)先權日2010年4月2日
發(fā)明者張小明, 武超穎, 蒲宇, 邵陽 申請人:川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院