專(zhuān)利名稱(chēng)：一種牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞誘變技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
自從2006年(Takahashi K and Yamanaka S, 2006)第一次報(bào)道通過(guò)外源性導(dǎo)入四種限定因子(0Ct4、SOX2、C-MyC、Klf4)使小鼠皮膚成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS)后，到目前為止，已從包括人、猴、大鼠和豬等多個(gè)物種、多種類(lèi)型體細(xì)胞中成功誘導(dǎo)產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Yu J et al. ,2007 ；Liu H et al.，2008 ；Liao J et al.，2009 ；Esteban MA et al.，2009)。并且，隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，已嘗試運(yùn)用某些方法來(lái)解決最初誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠和人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞效率低下和安全性等問(wèn)題。并且最近我國(guó)兩個(gè)研究小組均報(bào)道他們誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞通過(guò)四倍體胚胎互補(bǔ)技術(shù)獲得了完全由誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞制備的活體小鼠，有力地證明了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞具有真正的全能性(Zhao XY et al.，2009 ；Kang L etal.，2009)。因此，應(yīng)用限定因子直接重編程體細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞是干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，在遺傳工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。與小鼠、大鼠、猴子等動(dòng)物來(lái)源的胚胎不同，從偶蹄類(lèi)大家畜胚胎中分離出的胚胎干細(xì)胞系在培養(yǎng)過(guò)程中很不穩(wěn)定，很快就會(huì)失去其特性。盡管各國(guó)科學(xué)家已有多年的嘗試， 但目前尚未有成功分離牛的多能性胚胎干細(xì)胞系的報(bào)道。因此如果通過(guò)限定因子成功誘導(dǎo)產(chǎn)生具有全能性的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，那么就能夠有效地利用其干細(xì)胞特征進(jìn)行相關(guān)的科學(xué)研究，以及利用其與胚胎干細(xì)胞相似的特性用于轉(zhuǎn)基因家畜動(dòng)物的生產(chǎn)應(yīng)用。然而目前關(guān)于牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)技術(shù)國(guó)內(nèi)外尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，利用外源限定因子與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)構(gòu)建融合蛋白慢病毒表達(dá)載體用于牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，對(duì)表達(dá)外源限定因子融合蛋白的牛胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，逐步分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆，細(xì)胞集落生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，核型正常，堿性磷酸酶檢測(cè)為陽(yáng)性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示0ct4、NanOg、SSEA-I蛋白表達(dá)為陽(yáng)性， 體內(nèi)能夠分化形成含有三個(gè)胚層的畸胎瘤，結(jié)果證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞克隆具有胚胎干細(xì)胞樣特征，成功分離培養(yǎng)得到牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)、限定因子慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)豬Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列和人0ct4的DNA序列，設(shè)計(jì)合成出 pSox2、pKlf4、pc-Myc、h0ct4 基因的上、下游引物；從豬囊胚中提取總RNA，利用設(shè)計(jì)合成出的pSox2、pKlf4和pc-Myc基因的上、下游引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出豬限定基因DNA，人0ct4的DNA序列經(jīng)h0ct4基因的上、下游引物直接從人0ct4基因中擴(kuò)增獲取，將豬限定基因DNA和人0ct4的DNA序列進(jìn)行酶切，然后與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-Nl連接，構(gòu)建出逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體，從逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出CMV啟動(dòng)子連同限定基因及EGFP基因，同時(shí)通過(guò)酶切從pLL3. 7質(zhì)粒中移除U6啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和GFP序列，最后把CMV啟動(dòng)子連同限定基因及EGFP基因與酶切后的PLL3. 7進(jìn)行重組，構(gòu)建出慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體；所述的pSox2、pKlf4、pc-Myc、h0ct4基因的上、下游引物序列為pSox2 上游5，-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3，；下游5，-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3，；pKlf4 上游5，-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3，；下游5，-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3，；pc-Myc 上游5，-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3，；下游5，-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3，；h0ct4 上游5，-AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3，；下游5，-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3，。(2)、牛胎兒成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)采用組織塊培養(yǎng)法建立牛胎兒成纖維細(xì)胞系，采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體的四因子質(zhì)粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同時(shí)將慢病毒包裝產(chǎn)生病毒需要的輔助質(zhì)粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包裝到細(xì)胞，12-16h后換細(xì)胞新鮮培養(yǎng)液，病毒包裝4 后收集含病毒培養(yǎng)液，經(jīng)超濾濃縮后添加到含有牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，感染18-20天后，細(xì)胞出現(xiàn)初步形態(tài)變化后將感染的細(xì)胞經(jīng)Dispase II消化，接種至絲裂霉素C處理過(guò)的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)，感染23-25天后， 牛胚胎干細(xì)胞樣克隆明顯可見(jiàn)。所述的慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體構(gòu)建的具體操作步驟包括首先將 PLL3. 7用Apa I進(jìn)行酶切，T4 DNA聚合酶將其末端平滑化，再用EcoR I進(jìn)行單酶切，即從 pLL3. 7質(zhì)粒中移除TO啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和GFP序列；設(shè)計(jì)載體改造引物，從構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中經(jīng)載體改造引物擴(kuò)增出CMV啟動(dòng)子連同限定基因和EGFP序列， 然后用Mim I進(jìn)行單酶切，純化后用T4連接酶將從逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出的CMV啟動(dòng)子連同限定基因及EGFP基因與酶切后的pLL3. 7連接進(jìn)行重組，構(gòu)建好慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體；所述的設(shè)計(jì)載體改造引物的DNA序列為上游5，-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3，；下游5，-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，。所述的病毒包裝前一天匯合細(xì)胞，293Τ細(xì)胞培養(yǎng)液為含8_12%的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM，細(xì)胞匯合50-60 %時(shí)進(jìn)行病毒包裝；所述的病毒包裝采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體的四因子質(zhì)粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同時(shí)將慢病毒包裝產(chǎn)生病毒需要的輔助質(zhì)粒pMDLg、 pRSV REV和pVSVg包裝到細(xì)胞，12-16h后換細(xì)胞新鮮培養(yǎng)液，48h后收集含病毒培養(yǎng)液經(jīng)0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到Millipore的100KD超濾管中，在3_5°C下4000rpm離心20-40min得濃縮病毒液。所述的病毒開(kāi)始感染牛胎兒成纖維細(xì)胞的前一天將牛胎兒成纖維細(xì)胞注入到牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為IXlO5/孔，牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液為含8-12% 的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM，M小時(shí)后換成添加有濃縮病毒液和濃度為10yg/mL Polybrene的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開(kāi)始感染 12小時(shí)后換無(wú)病毒液的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開(kāi)始感染的第二天換成添加有濃縮病毒液和濃度為10μ g/mLPolybrene的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液再感染一次，12小時(shí)后再換無(wú)病毒液的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)2次慢病毒感染后即病毒開(kāi)始感染的第三天將牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液更換為牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液， 18-20天后，用Dispase II消化接種到絲裂霉素C處理的12. 5天小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加新的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液在37. 5°C,5% CO2飽和濕度下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。所述的牛胎兒成纖維細(xì)胞系培養(yǎng)的具體步驟包括取2. 5月齡荷斯坦奶牛胎兒皮膚組織，采用組織塊培養(yǎng)法建立成纖維細(xì)胞系，培養(yǎng)液為含有8-12%胎牛血清，95-105U/ml 青霉素，0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM ；所述的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法為選擇鋪滿(mǎn)皿底的2-4代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)9-1 lug/ml的絲裂霉素C處理2_3h， 常規(guī)胰酶消化接種到鋪過(guò)濃度為0. 008-0. 012g/L明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度為2X IO5個(gè)/ml。所述的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液為含1.5_2.5mM谷氨酰胺、 1. 5-2. 5mM丙酮酸鈉、0. 8-1. 2%的非必須氨基酸、0. 08-0. 12mM β -巰基乙醇、990-1100U/ ml LIF、3. 5-4. 5ng/ml bFGF、13-17%的 FBS 和 0. 8-1. 2%青鏈霉素的高糖 DMEM。本發(fā)明所述的％均值占總體積的體積百分比。所述的豬Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列信息來(lái)自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)。所述的pSoX2、pKlf4、pC-MyC基因的上、下游引物是指能從物種豬的DNA片段中擴(kuò)增出相應(yīng)基因的特定DNA序列。h0ct4基因的上、下游引物是指從直接人0ct4基因中擴(kuò)增出h0ct4基因的特定DNA序列。所述的載體改造引物是指從構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLEGFP-hOCT4/ pS0X2/pMYC/pKLF4中擴(kuò)增出CMV啟動(dòng)子連同限定基因和EGFP序列的特定DNA序列，引物一般是自己設(shè)計(jì)，專(zhuān)門(mén)的生物公司合成。所述的更換細(xì)胞新鮮培養(yǎng)液的目的是是將多余的未進(jìn)入細(xì)胞的磷酸鈣沉淀和細(xì)胞代謝產(chǎn)物去除，換成正常細(xì)胞培養(yǎng)需要的培養(yǎng)液，這樣有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和在后續(xù)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞包裝產(chǎn)生的含病毒的培養(yǎng)液收集。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)、本發(fā)明利用外源限定因子與EGFP構(gòu)建融合蛋白慢病毒表達(dá)載體用于牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，對(duì)表達(dá)外源限定因子融合蛋白的牛胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代， 能夠逐步分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆，細(xì)胞集落生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，核型正常，堿性磷酸酶檢測(cè)為陽(yáng)性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示0ct4、Nanog, SSEA-I蛋白表達(dá)為陽(yáng)性，體內(nèi)能夠分化形成含有三個(gè)胚層的畸胎瘤，結(jié)果證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞克隆為多能性干細(xì)胞，可稱(chēng)之為牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；首次成功誘導(dǎo)產(chǎn)生牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；(2)與通常的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)相比，本發(fā)明采用的是限定因子和EGFP 組建的融合蛋白進(jìn)行牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，融合蛋白(fusionprotein)是采用DNA 重組技術(shù)在基因水平上將兩種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)依讀碼框架首尾連接，由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)產(chǎn)物；融合蛋白技術(shù)因其在目的蛋白的表達(dá)、構(gòu)建具有雙功能的目的蛋白等研究方面有具有不可替代的作用，在醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)，環(huán)境等的生產(chǎn)、研究中有著重要的用途；EGFP是熒光蛋白家族中常用的一種，熒光具有高度穩(wěn)定性，對(duì)于外源限定因子在細(xì)胞重編程過(guò)程中發(fā)揮作用的機(jī)制和特點(diǎn)，外源限定因子和EGFP組建的融合蛋白能夠有效地檢測(cè)、追蹤和掌握外源限定因子的特點(diǎn)，有助于將來(lái)進(jìn)行牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的機(jī)理研究；(3)本發(fā)明采用的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持其干細(xì)胞特征的培養(yǎng)液配方對(duì)將來(lái)分離培養(yǎng)建立真正的牛胚胎干細(xì)胞系具有一定的參考價(jià)值。利用外源限定因子與EGFP組建融合蛋白應(yīng)用于牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，可追蹤掌握外源限定因子在重編程過(guò)程中的發(fā)生機(jī)制和特點(diǎn)，從本發(fā)明可知，外源限定因子在牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞集落中大多數(shù)處于不表達(dá)或低水平表達(dá)，少數(shù)細(xì)胞則處于高表達(dá)狀態(tài)，說(shuō)明了體細(xì)胞完全重編程形成誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞后外源基因不表達(dá)，不完全重編程的體細(xì)胞外源基因仍處于高表達(dá)狀態(tài)。^iao等(Zhao Y et al.，2008)用EGFP作為熒光標(biāo)記誘導(dǎo)人的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，EGFP表達(dá)的沉寂預(yù)示著誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的完全重編程，EGFP的表達(dá)顯示誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的尚處于不完全重編程。Yu等(Yu J et al., 2009)通過(guò)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)完全重構(gòu)的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞與人ES細(xì)胞0ct4的表達(dá)水平一致。Maherali等(Maherali N et al.，2007)采用外源限定因子的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)證實(shí)了小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞形成后外源限定因子的表達(dá)不為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的生長(zhǎng)所必需。眾多的研究結(jié)果顯示了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞形成后激活的內(nèi)源性多能性基因足以維持干細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，外源性限定因子在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中處于沉寂狀態(tài)。利用限定因子與 EGFP組建融合蛋白此項(xiàng)發(fā)明技術(shù)用于牛體細(xì)胞的重編程，可成功誘導(dǎo)產(chǎn)生牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，而目前對(duì)于牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，因此本發(fā)明為國(guó)內(nèi)外首創(chuàng)，拉近了誘導(dǎo)性多能干走向畜牧業(yè)應(yīng)用的距離，具有深遠(yuǎn)意義。其次，利用EGFP帶有穩(wěn)定綠色熒光的特點(diǎn)，可追蹤掌握外源限定因子在細(xì)胞重編程過(guò)程中發(fā)揮作用的機(jī)制和特點(diǎn)，為將來(lái)深入研究利用牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞相關(guān)工作奠定基礎(chǔ)。再次，因目前國(guó)內(nèi)外尚未建立牛胚胎干細(xì)胞系，本發(fā)明技術(shù)中采用的誘導(dǎo)和維持牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞培養(yǎng)液配方為將來(lái)研究建立牛胚胎干細(xì)胞系可提供參考。


圖1是pLL3. 7質(zhì)粒圖譜示意圖。圖2是限定因子融合蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建圖譜示意圖。圖3是限定因子融合蛋白慢病毒載體質(zhì)粒pLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4-GFP構(gòu)建圖譜示意圖。圖4是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程示意圖。圖5是病毒感染前牛胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)圖。
圖6是病毒感染2次后在干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下第19天的牛胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)圖。圖7是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞克隆形態(tài)圖。圖8是第13代牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中期分裂相圖。圖9是RT-PCR檢測(cè)多能性基因圖，圖中1代表牛胎兒成纖維細(xì)胞，2_3代表牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，4代表小鼠ES細(xì)胞。圖10是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞AP染色的顯微鏡圖。圖11是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞0ct4蛋白的表達(dá)的顯微鏡圖。圖12是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞Nanog蛋白的表達(dá)的顯微鏡圖。圖13是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞SSEA-I蛋白的表達(dá)的顯微鏡圖。圖14是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的神經(jīng)樣組織(外胚層)的顯微鏡圖。圖15是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的肌肉樣組織(中胚層)的顯微鏡圖。圖16是牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的腺管樣樣組織(內(nèi)胚層)的顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施例荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞方法(1)、限定因子慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)NCBI 上豬 Sox2 (NM 001123197)、c_Myc (NM 001005154)、Klf4 (NM001031782) 基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)合成上、下游引物，引物序列如下pSox2 上游5，-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3，下游5，-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3，pKlf4 上游5，-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3，下游5，-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3，pc-Myc 上游5，-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3，下游5，-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3，h0ct4 上游5’ -AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’下游5，-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3，載體改造引物上游5，-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3，下游5，-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，從豬囊胚中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出豬限定基因DNA，人0ct4的DNA序列直接從人0ct4基因中擴(kuò)增獲取，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切，與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-m連接，構(gòu)建出逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體。從重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出CMV 啟動(dòng)子連同限定基因及EGFP基因，同時(shí)通過(guò)酶切從pLL3. 7質(zhì)粒中移除U6啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和GFP序列，最后把重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中擴(kuò)增的啟動(dòng)子和限定基因融合蛋白序列與酶切后的PLL3. 7進(jìn)行重組，構(gòu)建出慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體(圖3)。具體操作步驟如下首先將PLL3. 7用Apa I進(jìn)行酶切，T4 DNA聚合酶將其末端平滑化，再用EcoR I進(jìn)行單酶切，即從PLL3. 7質(zhì)粒中移除U6啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和GFP序列。設(shè)計(jì)載體改造引物從構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLEGFP—h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4中擴(kuò)增出CMV啟動(dòng)子、目的片段和EGFP序列，然后用Mim I進(jìn)行單酶切，純化后用T4連接酶將兩者連接即構(gòu)建好慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體。(2)、牛胎兒成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)材料和試劑胎牛成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法建立2. 5月齡荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞系，培養(yǎng)液為含有占體積百分比10%胎牛血清(Hyclone)，100U/ml青霉素， 0. lmg/ml 鏈霉素的高糖 DMEM(Hyclone)。胎鼠成纖維細(xì)胞(mouseembryo fibroblasts，MEFs)系的建立妊娠 12. 5dICR 品系胎鼠，去除頭、四肢和內(nèi)臟后采用胰酶消化法分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)液為含有占體積百分比10%新生牛血清(四季青)，100U/ml青霉素，0. lmg/ml鏈霉素的高糖 DMEM(Hyclone)。飼養(yǎng)層的制備選擇鋪滿(mǎn)皿底的2-4代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)lOug/ml的絲裂霉素C(Sigma)處理2. 5h，常規(guī)胰酶消化接種到鋪過(guò)0. 01g/L明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)，接種細(xì)胞密度為2X IO5個(gè)/ml。培養(yǎng)液同小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液。牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液(ES培養(yǎng)液)含有2mM谷氨酰胺 (Gibco)、2mM丙酮酸鈉(Gibco)、占體積百分比非必須氨基酸(Gibco)、0. ImM β-巰基乙醇(Sigma)、1000U/ml LIF(ESGR0, Chemicon International)、4ng/ml bFGF(Sigma)、 占體積百分比15 % FBS(Hyclone)、占體積百分比1 %青鏈霉素(Gibco)的高糖 DMEM(Hyclone)。293T細(xì)胞培養(yǎng)液同牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，所有細(xì)胞均在37. 5°C，5% CO2,飽和濕度下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過(guò)組織塊培養(yǎng)法從2. 5月齡荷斯坦奶牛胎兒皮膚分離培養(yǎng)建立牛胎兒成纖維細(xì)胞系，胎牛成纖維細(xì)胞從第7代開(kāi)始感染，具體的重編程方案見(jiàn)圖4。采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染四因子質(zhì)粒 PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4 和包裝組分 pMLg、pRSV REV 和 pVSVg 到 293T 細(xì)胞，12-16h后換新鮮培養(yǎng)液，病毒包裝4 后收集含病毒培養(yǎng)液，含病毒培養(yǎng)液經(jīng)0. 45 μ m 的濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到Mi 11 ipore的100KD超濾管中，在4°C下4000rpm離心20-40min得濃縮病毒液。病毒開(kāi)始感染牛胎兒成纖維細(xì)胞的前一天將牛胎兒成纖維細(xì)胞注入到6孔板內(nèi)， 細(xì)胞密度為IX IO5/孔，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，0. lmg/ml鏈霉素的高糖DMEM，第二天換成添加有濃縮病毒液和濃度為10 μ g/mL Polybrene的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，12小時(shí)后換新鮮牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，第三天換成添加有濃縮病毒液和濃度為10 μ g/mL Polybrene的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液再感染一次，12小時(shí)后再換新鮮牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開(kāi)始感染豬胎兒成纖維細(xì)胞的當(dāng)天記為O天，經(jīng)過(guò)2次慢病毒感染第3d更換牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液，大約19天以后，成纖維細(xì)胞的形態(tài)開(kāi)始發(fā)生改變，即少量胎牛成纖維細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變成圓球形，并且呈集落樣生長(zhǎng)，Dispase II(Roche)消化后接種到12. 5d小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液在37. 5°C,5% CO2飽和濕度下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在感染后第23天，圓形的邊界清楚的胚胎干細(xì)胞樣克隆明顯可見(jiàn)。用Dispase II消化克隆接種到新的飼養(yǎng)層上繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，剛開(kāi)始按1 1的比例傳代，隨后按1 4的比例傳代，每隔4d左右傳代一次。(3)、牛誘導(dǎo)細(xì)胞的鑒定RT-PCR檢測(cè)應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen)處理牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，然后提取細(xì)胞總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)(Takara公司)合成cDNA。用下述鑒定引物擴(kuò)增相應(yīng)基因，引物序列如下牛0ct4 上游5，-TTGAAGCTTGCCACCATGGCGGGACACCTCGCTT-3，下游5’ -GCAGGATCCTCAGTTTGCATGCATAGGGGAGCCC-3’
牛 Nanog 上游5，-ATTAAGCTTGCCACCATGAGTGTGGGCCCAGCTT-3，下游5，-CGCGGATCCTTACAAATCTTCAGGCTGTA-3，牛Klf4 上游5，-ATTAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCGC-3，下游5’ -GCGGGATCCTTAAAAGTGCCTCTTCATGTGTAAGGCG-3’牛c-Myc 上游5，-TATAAGCTTGCCACCATGCCCCTCAACGTCAGCT-3，下游5，-GCGGGATCCTTAGGCGCAAGAGTTCCGTA-3，GAPDH 上游5，-TTGGTATCGTGGAAGGACTCTA-3，下游5，-TGTCATATTTGGCAGGTT-3，核型分析0. 1 μ g/ml秋水仙素(Sigma)處理牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞2. 5 h，胰酶消化并重懸于0.075 mol/LKCL，37°C孵育25min，固定液(甲醇冰醋酸=3 1)固定lOmin， 離心固定重復(fù)3次。收獲細(xì)胞，滴片，Gimsa染色，空氣干燥，封片。顯微鏡下觀察及應(yīng)用相關(guān)軟件分析染色體配對(duì)。免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉 30min，添加一抗為兔抗 0ct4 (Abeam)、山羊抗 Nanog (R&D)、鼠抗 SSEA-1 (Chemicon)、鼠抗 SSEA-3 (R&D)、鼠抗 SSEA-4 (R&D)、鼠抗 TRA-1-60 (Chemicon)、鼠抗 TRA-1-81 (Chemicon)，按 1 200稀釋后4°C孵育過(guò)夜。PBS洗3次，CT3紅色熒光標(biāo)記的二抗按1 200稀釋后室溫避光孵育lh，PBS洗3次，用1 μ g/mL的DAPI (Roche)進(jìn)行細(xì)胞核染色I(xiàn)min后熒光鏡下觀察結(jié)果。AP染色用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，添加堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP) 染液進(jìn)行染色，以胞漿著色為紅棕色或咖啡色顆粒為陽(yáng)性。體內(nèi)分化檢測(cè)=Dispase II消化牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，無(wú)血清DMEM重懸細(xì)胞后注射到免疫缺陷鼠(BALB/C-nu)背側(cè)皮下，注射8w后處死裸鼠，取腫瘤組織4%多聚甲醛固定后進(jìn)行蘇木精伊紅染色。0)、結(jié)果磷酸鈣法包裝的限定因子慢病毒感染豬牛胎兒成纖維細(xì)胞，在干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下18-19天后，牛胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)開(kāi)始發(fā)生改變，少量牛胎兒成纖維細(xì)胞逐漸由長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變成圓球形，呈聚集性生長(zhǎng)。Dispase II消化的圓球形細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上，用含1000U/ml LIF和^g/ml bFGF的干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，在感染后第23_24d，邊界明顯的集落狀細(xì)胞克隆逐漸形成。高倍顯微鏡下集落中的單個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核較大，核質(zhì)比例較高。在1 4傳代的情況下細(xì)胞克隆大約每隔3-4天傳代一次，細(xì)胞集落生長(zhǎng)傳代穩(wěn)定(圖5，6，7)。對(duì)傳至第13代的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞進(jìn)行核型分析顯示豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞染色體數(shù)為60，XY正常核型(圖8)。RT-PCR檢測(cè)限定因子融合蛋白誘導(dǎo)的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞相關(guān)多能性基因的表達(dá)，牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)0ct4、c-Myc、Klf4和Nanog 基因，相同條件下牛胎兒成纖維細(xì)胞不表達(dá)NanOg、0Ct4、C-MyC、Klf4等相關(guān)基因(圖9)。 AP在早期胚胎的干細(xì)胞中有較高表達(dá)，而在已分化的細(xì)胞中活性明顯降低，甚至不表達(dá)，AP的表達(dá)是一種ES細(xì)胞及相關(guān)干細(xì)胞的重要特征之一。AP染色結(jié)果顯示限定因子融合蛋白誘導(dǎo)的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞AP表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性(圖10)。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)0ct4、NanOg、SSEA-l蛋白(圖11，12，13)，對(duì)于0ct4蛋白的表達(dá)檢測(cè)，攜帶外源限定因子的細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞克隆中呈現(xiàn)0ct4蛋白強(qiáng)表達(dá)，EGFP為強(qiáng)表達(dá)的細(xì)胞則0ct4蛋白檢測(cè)為強(qiáng)陽(yáng)性，EGFP表達(dá)較弱或沉寂的細(xì)胞則0ct4蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)一般陽(yáng)性(圖11)，在相同條件下，Nanog蛋白的表達(dá)水平在細(xì)胞集落中介于表達(dá)EGFP或不表達(dá)EGFP的細(xì)胞之間沒(méi)有差異。取限定因子融合蛋白誘導(dǎo)的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在BALB/C 裸鼠皮下8w后形成的畸胎瘤，HE染色結(jié)果顯示在畸胎瘤組織內(nèi)存在神經(jīng)、肌肉、腺體等三個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞和組織(圖14，15，16)。
權(quán)利要求
1.一種牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、限定因子慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)豬Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列和人0ct4的DNA序列，設(shè)計(jì)合成出pSox2、 pKlf4、pc-Myc、h0ct4基因的上、下游引物；從豬囊胚中提取總RNA，利用設(shè)計(jì)合成出的pSox2、pKlf4和pc-Myc基因的上、下游引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出豬限定基因DNA，人0ct4的DNA序列經(jīng)h0ct4基因的上、下游引物直接從人0ct4基因中擴(kuò)增獲取，將豬限定基因DNA和人0ct4的DNA序列進(jìn)行酶切，然后與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-Nl連接，構(gòu)建出逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體，從逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出CMV啟動(dòng)子連同限定基因及EGFP基因，同時(shí)通過(guò)酶切從pLL3. 7質(zhì)粒中移除U6啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和GFP序列，最后把CMV啟動(dòng)子連同限定基因及EGFP基因與酶切后的PLL3. 7進(jìn)行重組，構(gòu)建出慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體； 所述的pSox2、pKlf4、pc-Myc、h0ct4基因的上、下游引物序列為 pSox2 上游5’ -TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3，； 下游5’ -AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3’ ； pKlf4 上游5’ -TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3，； 下游5’ -GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3，； pc-Myc 上游5’ -GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3，； 下游5’ -AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3，； h0ct4 上游5’ -AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3，； 下游5’ -CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3，。 O)、牛胎兒成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)采用組織塊培養(yǎng)法建立牛胎兒成纖維細(xì)胞系，采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體的四因子質(zhì)粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同時(shí)將慢病毒包裝產(chǎn)生病毒需要的輔助質(zhì)粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包裝到細(xì)胞，12-16h后換細(xì)胞新鮮培養(yǎng)液，病毒包裝4 后收集含病毒培養(yǎng)液，經(jīng)超濾濃縮后添加到含有牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，感染18-20天后，細(xì)胞出現(xiàn)初步形態(tài)變化后將感染的細(xì)胞經(jīng)Dispase II消化， 接種至絲裂霉素C處理過(guò)的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)，感染23-25天后，牛胚胎干細(xì)胞樣克隆明顯可見(jiàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體構(gòu)建的具體操作步驟包括首先將PLL3. 7用Apa I進(jìn)行酶切，T4DNA聚合酶將其末端平滑化，再用EcoR I進(jìn)行單酶切，即從pLL3. 7質(zhì)粒中移除U6啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和GFP序列；設(shè)計(jì)載體改造引物，從構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中經(jīng)載體改造引物擴(kuò)增出CMV啟動(dòng)子連同限定基因和EGFP序列，然后用Mim I進(jìn)行單酶切，純化后用T4連接酶將從逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出的CMV啟動(dòng)子連同限定基因及EGFP基因與酶切后的pLL3. 7連接進(jìn)行重組，構(gòu)建好慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體；所述的設(shè)計(jì)載體改造引物的DNA序列為 上游5’ -AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3’ ； 下游5’ -GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于包括以下步驟所述的病毒包裝前一天匯合細(xì)胞，293Τ細(xì)胞培養(yǎng)液為含8-12 %的胎牛血清、 95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM，細(xì)胞匯合50-60%時(shí)進(jìn)行病毒包裝；所述的病毒包裝采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體的四因子質(zhì)粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同時(shí)將慢病毒包裝產(chǎn)生病毒需要的輔助質(zhì)粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包裝到細(xì)胞，12-16h后換細(xì)胞新鮮培養(yǎng)液，48h后收集含病毒培養(yǎng)液經(jīng)0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到Millipore的100KD超濾管中，在3_5°C下4000rpm離心 20-40min得濃縮病毒液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步驟 所述的病毒開(kāi)始感染牛胎兒成纖維細(xì)胞的前一天將牛胎兒成纖維細(xì)胞注入到牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為IXlO5/孔，牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液為含8-12%的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM，M小時(shí)后換成添加有濃縮病毒液和濃度為10μ g/mL Polybrene的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開(kāi)始感染12小時(shí)后換無(wú)病毒液的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開(kāi)始感染的第二天換成添加有濃縮病毒液和濃度為10μ g/mLPolybrene的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液再感染一次，12小時(shí)后再換無(wú)病毒液的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)2次慢病毒感染后即病毒開(kāi)始感染的第三天將牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液更換為牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液，18-20天后， 用Dispase II消化接種到絲裂霉素C處理的12. 5天小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加新的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液在37. 5°C,5% CO2飽和濕度下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的牛胎兒成纖維細(xì)胞系培養(yǎng)的具體步驟包括取2. 5月齡荷斯坦奶牛胎兒皮膚組織，采用組織塊培養(yǎng)法建立成纖維細(xì)胞系，培養(yǎng)液為含有8-12%胎牛血清，95-105U/ml青霉素， 0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM ；所述的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法為選擇鋪滿(mǎn)皿底的2-4代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)9-llug/ml的絲裂霉素C處理2_3h，常規(guī)胰酶消化接種到鋪過(guò)濃度為0. 008-0. 012g/L明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度為 2X IO5 個(gè)/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液為含1. 5-2. 5mM谷氨酰胺、1. 5-2. 5mM丙酮酸鈉、 0. 8-1. 2% 的非必須氨基酸、0. 08-0. 12mM β -巰基乙醇、990_1100U/ml LIF,3. 5-4. 5ng/ml bFGF、13-17%的FBS和0. 8-1. 2%青鏈霉素的高糖DMEM。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，利用外源限定因子與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)報(bào)告基因構(gòu)建融合蛋白慢病毒表達(dá)載體用于牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，對(duì)表達(dá)外源限定因子融合蛋白的牛胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，逐步分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆，細(xì)胞集落生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，核型正常，堿性磷酸酶檢測(cè)為陽(yáng)性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表達(dá)為陽(yáng)性，體內(nèi)能夠分化形成含有三個(gè)胚層的畸胎瘤，結(jié)果證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞克隆具有胚胎干細(xì)胞樣特征，得到牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/073GK102229909SQ20101013876
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者丁建平, 任春環(huán), 劉亞, 劉旭光, 劉洪瑜, 張子軍, 張運(yùn)海, 方富貴, 曹鴻國(guó), 李運(yùn)生, 殷慧群, 王力生, 章孝榮, 陶勇 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)