專利名稱：以Alu間聚合酶鏈式反應為基礎的檢測基因區(qū)特征的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及集中檢測基因區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)、點突變，插入/缺失及雙脫氧 核苷酸分子(DNA)甲基化CpG位點的方法?？傮w上說，該方法是通過inter-Alu PCR，使新 一代測序技術(shù)可集中檢測基因組中基因區(qū)序列特征的方法。 依據(jù)Alu重復序列集中于基因區(qū)這一特點，通過多引物inter-Alu PCR擴增基因 組中多個兩Alu序列間區(qū)域，所得純化PCR產(chǎn)物的質(zhì)量為模板基因組DNA質(zhì)量的6倍；并 且，該PCR產(chǎn)物為涵蓋基因組中多個基因區(qū)域的DNA復制子。此方法可保證新一代測序技 術(shù)僅使用納克級基因組DNA，便可以集中檢測基因區(qū)的SNP、點突變，序列插入/缺失及DNA 甲基化CpG位點。 在本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)AluY亞家族的特征，即多種遺傳疾病經(jīng)研究與 AluY亞家族插入基因組中造成基因組不穩(wěn)定有關(guān)，另外，該亞家族作為重組熱點區(qū)，其結(jié)構(gòu) 內(nèi)部及周圍區(qū)域的SNP可能為疾病相關(guān)SNP ;因而寡核苷酸引物設計依據(jù)上述AluY的特 征，選取以AluY亞家族共同序列中的片段作為寡核苷酸引物。在Alu間聚合酶鏈式反應 (inter-Alu PCR)中，通過熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用，AluY共同序列小片段寡核苷酸引物 便可以與被檢測的模板DNA在適當?shù)男蛄形恢没パa，形成雜交的核酸結(jié)構(gòu)。然后，在此聚合 條件下，以四種核苷酸(A、G、T、C)延伸寡核苷酸引物，以堿基互補原則，在熱穩(wěn)定DNA聚合 酶的催化下與需要擴增的模板鏈進行連接，從而達到復制模板鏈的目的。根據(jù)PCR的擴增 特點，即DNA的復制呈指數(shù)級擴增，也就是說PCR產(chǎn)物的質(zhì)量要多于原模板DNA的質(zhì)量。在 本發(fā)明中，純化后的PCR產(chǎn)物質(zhì)量為原模板質(zhì)量的6倍。同時，因為Alu重復序列的結(jié)構(gòu) 相似，且在基因組中的數(shù)量超過10X，所以單一AluY共同序 列小片段寡核苷酸引物可通過 inter-Alu PCR擴增基因組中多個區(qū)域，得到多個大小不等的DNA復制子。經(jīng)過DNA瓊脂 糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈下觀察擴增產(chǎn)物形態(tài)為白色階梯狀影。如PCR反應 中的小片段寡核苷酸引物為多個，則紫外燈下擴增產(chǎn)物形態(tài)為白色斑片狀影。在本發(fā)明中， 因為Alu重復序列多出現(xiàn)在基因組中的基因區(qū)，所以以AluY共同序列小片段寡核苷酸引物 inter-Alu PCR擴增的DNA復制子在基因區(qū)的比率要占到40% ;而整個基因區(qū)在整個基因 組中的比率只有25% 。這樣便可僅用3 ii g納克級的DNA模板擴增的inter-Alu PCR產(chǎn)物 放入高通量測序儀器中進行測序，所得的多位點SNP主要集中于基因區(qū)的Alu片段及Alu 周圍片段中。因為約50X的SNP分布于重復序列區(qū)，其余則分布于重復序列以外的非編碼 序列區(qū)和編碼基因區(qū)。因此，該方法可用于檢測基因組中，特別是基因區(qū)的多個SNP及發(fā)現(xiàn) 新SNP。 本發(fā)明的另一個實施方案是利用上述方法檢測不同疾病，特別是癌癥基因組中基 因區(qū)內(nèi)含子及外顯子的點突變，插入/缺失。在整個基因組中基因數(shù)量約為25， 000個，而 現(xiàn)已知腫瘤相關(guān)基因數(shù)量為6522個，占整個基因總數(shù)的26%。在本發(fā)明中，通過以AluY共 同序列小片段為寡核苷酸引物的inter-Alu PCR，擴增腫瘤基因組DNA，所得的基因區(qū)序列 所在的基因有58%為腫瘤相關(guān)基因。因此，可采用包括不同擴增方向的AluY共同序列為 寡核苷酸引物及"尾對尾"擴增方向的Alu共同序列寡核苷酸引物(R12A/267)作為混合引 物，在inter-Alu PCR中，通過熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用，多寡核苷酸引物與被檢測的模板 DNA在適當?shù)男蛄形恢没パa，形成雜交的核酸結(jié)構(gòu)。然后，在此聚合條件下，以四種核苷酸(A、G、T、C)延伸寡核苷酸引物，以堿基互補原則，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下與需要擴增 的模板鏈進行連接，從而達到復制模板鏈的目的。因為多個引物共同作用于同一 PCR反應 體系中，所以所得DNA產(chǎn)物經(jīng)過DNA瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈觀察下擴 增產(chǎn)物形態(tài)為白色斑片狀影。按照如前所述技術(shù)，可檢測inter-Alu PCR擴增區(qū)域中包含 的SNP是否為腫瘤相關(guān)性SNP，同時可將DNA復制子做進一步打斷處理，結(jié)合外顯子捕獲技 術(shù)，著重分析擴增區(qū)域外顯子中的SNP與腫瘤的相關(guān)性。 本發(fā)明的另一個實施方案是利用上述方法進行基因區(qū)DNA甲基化水平的檢測。 DNA中的胞嘧啶(C)甲基化修飾多發(fā)生于5' -CpG-3'的"C"上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。 絕大多數(shù)的5mC主要集中于富含CpG位點的重復序列Alu家族中，并且據(jù)估計，在整個人類 基因組，Alu家族可包含多達33 %的CpG位點。所以，以AluY共同序列中不含CpG位點的序 列設計2個不同擴增方向的寡核苷酸引物，將引物中的"C"全部轉(zhuǎn)換成"T"。通過inter-Alu PCR擴增經(jīng)亞硫酸氫鹽預處理的腫瘤及正常對照組織(外周血)基因組DNA，可獲得基因組 中富含CpG位點的Alu及其周圍區(qū)域的PCR產(chǎn)物。2個不同擴增方向的寡核苷酸引物共同 作用于同一 inter-Alu PCR擴增反應體系，可獲得包括了"尾對尾"、"頭對頭"、"頭對尾"及 "尾對頭"4個方向的DNA復制子，進一步增加了涵蓋CpG位點區(qū)域的數(shù)量，可使經(jīng)新一代測 序技術(shù)測序所獲得的序列盡量多地提供腫瘤基因組CpG位點甲基化水平改變程度的信息。
在不背離本發(fā)明公開精神的前提下，對本發(fā)明所做的各種替換和修飾，都將落入 本發(fā)明范圍內(nèi)。 本說明書中使用的術(shù)語"基因區(qū)"是指基因組序列中基因所在的區(qū)域?；?遺 傳因子)是遺傳的物質(zhì)基礎，是DNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，是具有 遺傳效應的DNA分子片段。 本說明書中使用的術(shù)語"純化后PCR產(chǎn)物"是指在經(jīng)過inter-Alu PCR反應后，將 PCR產(chǎn)物通過乙醇或純化試劑盒去掉多余的引物、酶、礦物油、甘油，鹽等雜質(zhì)后所得的純化 物。 本說明書中使用的術(shù)語"兩個Alu序列間的區(qū)域"是指在inter-Alu PCR擴增產(chǎn) 物所位于的區(qū)域。由于Alu序列在基因組中分布較為廣泛，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶可以擴增 的DNA長度容許下，擴增所包括的相鄰兩個Alu序列之間的DNA序列。 本說明書中使用的術(shù)語"質(zhì)量"是含有兩個方面的意思。第一，指在inter-AluPCR 擴增產(chǎn)物的多少。第二，指測序數(shù)據(jù)滿足研究要求的程度。 本說明書中使用的術(shù)語"DNA復制子"是指inter-Alu PCR擴增產(chǎn)物，這里是以Alu 寡核苷酸引物擴增基因組DNA所得的PCR產(chǎn)物。 本說明書中使用的術(shù)語"新一代測序技術(shù)"是指比第一代測序技術(shù)(熒光標記的 Sanger法)更為先進的循環(huán)陣列合成測序法。該技術(shù)可以在單次測序中獲得數(shù)百萬堿基的 序列。 本說明書中使用的術(shù)語"納克級基因組DNA"是指實驗中常用，漢語翻譯出的DNA 質(zhì)量的單位。其英語拼寫為"ng"。 本說明書中使用的術(shù)語"AluY共同序列小片段寡核苷酸引物"是指選取AluY亞家 族共同序列中的10-20個堿基作為引物，并應用于inter-Alu PCR反應中。這些引物的片 段可以按照不同實驗的要求，從AluY共同序列中的任意位置選取。
本說明書中使用的術(shù)語"白色階梯狀影"是指單個或多個寡核苷酸引物的 inter-Alu PCR反應所產(chǎn)生的DNA復制子，經(jīng)過DNA瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫 外燈下所顯示的形態(tài)。其顏色為白色，形狀如階梯。 本說明書中使用的術(shù)語"白色斑片狀影"是指多個寡核苷酸引物的inter-AluPCR 反應所產(chǎn)生的DNA復制子，經(jīng)過DNA瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈下所顯示 的形態(tài)。其顏色為白色，形狀云翳或斑片。 本說明書中使用的術(shù)語"熱穩(wěn)定DNA聚合酶"是指用于inter-PCR反應的DNA聚 合酶。該熱穩(wěn)定DNA聚合酶可以是Taq酶，K0D酶及其他各種可以用于各種PCR反應的DNA 聚合酶。 本說明書中使用的術(shù)語"不同擴增方向"是指按照Alu具有"5'"端頭部及"3'"端 尾部，inter-Alu PCR的擴增方向可以是朝向"5'"端，也可以朝向"3'"端。因此inter-Alu PCR擴增可以出現(xiàn)不同方向。 本說明書中使用的術(shù)語"'尾對尾'"是指按照Alu具有"5'"端頭部及"3'"端尾 部，inter-Alu PCR擴增一個Alu "3'"端尾部與一個Alu "3'"端尾部間的DNA區(qū)域。
本說明書中使用的術(shù)語"'頭對頭'"是指按照Alu具有"5'"端頭部及"3'"端尾 部，inter-Alu PCR擴增一個Alu "5'"端頭部與一個Alu "5'"端頭部間的DNA區(qū)域。
本說明書中使用的術(shù)語"'頭對尾'"是指按照Alu具有"5'"端頭部及"3'"端尾 部，inter-Alu PCR擴增一個Alu "5'"端頭部與一個Alu "3'"端尾部間的DNA區(qū)域。
本說明書中使用的術(shù)語"'尾對頭'"是指按照Alu具有"5'"端頭部及"3'"端尾 部，inter-Alu PCR擴增一個Alu "3'"端尾部與一個Alu "5'"端頭部間的DNA區(qū)域。
本說明書中使用的術(shù)語"外顯子捕獲"是指構(gòu)建一種載體，從其插入片段中識別和 回收外顯子序列，從而克隆目的基因。在本發(fā)明中，主要將inter-Alu PCR產(chǎn)物作為外顯子 捕獲的模板。 本說明書中使用的術(shù)語"CpG位點"是指DNA中的胞嘧啶(C)通過磷酸二酯鍵與鳥 嘌呤(G)形成線性連接。在哺乳動物中CpG位點中的"C"甲基化水平為70%到80%。
本發(fā)明涉及集中檢測基因區(qū)特征的方法。該方法是通過inter-Alu PCR，使測序集 中于檢測基因組中基因區(qū)序列的方法。依據(jù)以AluY共同序列為寡核苷酸引物的inter-Alu PCR擴增基因組中多個兩Alu序列間區(qū)域，可獲得高質(zhì)量的純化PCR產(chǎn)物；并且，該PCR產(chǎn) 物為涵蓋基因組中多個基因區(qū)域的DNA復制子。此方法可保證新一代測序技術(shù)僅使用納克 級基因組DNA，達到集中檢測基因區(qū)特征的目的。 在本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)AluY亞家族的特征，即AluY亞家族插入基因組 中造成基因組不穩(wěn)定，另外，該亞家族作為重組熱點區(qū)，其結(jié)構(gòu)內(nèi)部及周圍區(qū)域的SNP可能 為疾病相關(guān)SNP ;因而寡核苷酸引物的設計需依據(jù)上述AluY的特征，選取以AluY亞家族共 同序列中的片段作為寡核苷酸引物。在inter-Alu PCR中，通過熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用， AluY共同序列小片段寡核苷酸引物便可以與被檢測的模板DNA在適當?shù)男蛄形恢没パa，形 成雜交的核酸結(jié)構(gòu)。然后，在此聚合條件下，以四種核苷酸(A、G、T、C)延伸寡核苷酸引物， 以堿基互補原則，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下與需要擴增的模板鏈進行連接，從而達到 復制模板鏈的目的。根據(jù)PCR的擴增特點，即DNA的復制呈指數(shù)級擴增，也就是說PCR產(chǎn) 物的質(zhì)量要多于原模板DNA的質(zhì)量。在本發(fā)明中，純化后的PCR產(chǎn)物質(zhì)量為原模板質(zhì)量的6倍。同時，因為Alu重復序列的結(jié)構(gòu)相似，且在基因組中的數(shù)量超過10X，所以單一AluY 共同序列小片段寡核苷酸引物可通過inter-Alu PCR擴增基因組中多個區(qū)域，得到多個大 小不同的DNA復制子。經(jīng)過DNA瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈觀察擴增產(chǎn)物 形態(tài)為白色階梯狀影。如PCR反應中的小片段寡核苷酸引物為多個，則紫外燈下擴增產(chǎn)物 形態(tài)為白色斑片狀影。在本發(fā)明中，因為Alu重復序列多出現(xiàn)在基因組中的基因區(qū)，所以以 AluY共同序列小片段寡核苷酸引物inter-Alu PCR擴增的DNA復制子在基因區(qū)的比率要 占到40% ;而整個基因區(qū)在整個基因組中的比率只有25%。這樣的擴增結(jié)果，可以僅用3 納克級DNA，便可以進行高通量測序，所檢測到的SNP主要集中于基因區(qū)中。因為SNP集中 分布于重復序列區(qū)，因此，該方法可用于檢測基因組中，特別是基因區(qū)的多個SNP及發(fā)現(xiàn)新 SNP。 本發(fā)明的另一個實施方案是利用上述方法檢測不同疾病，特別是腫瘤基因組中基 因區(qū)內(nèi)含子及外顯子的點突變，插入/缺失。在整個基因組中基因數(shù)量約為25， 000個，而 現(xiàn)已知腫瘤相關(guān)基因數(shù)量為6522個，占整個基因總數(shù)的26%。在本發(fā)明中，通過以AluY共 同序列小片段為寡核苷酸引物的inter-Alu PCR，擴增腫瘤基因組DNA，所得的基因區(qū)序列 所在的基因有58%為腫瘤相關(guān)基因。因此，可采用包括不同擴增方向的AluY共同序列或 Alu共同序列作為寡核苷酸引物，在inter-Alu PCR中，利用多個寡核苷酸引物混合物，通 過熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用，多寡核苷酸引物與被檢測的模板DNA在適當?shù)男蛄形恢没パa， 形成雜交的核酸結(jié)構(gòu)。然后，在此聚合條件下，以四種核苷酸(A、 G、 T、 C)延伸寡核苷酸引 物，以堿基互補原則，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下與需要擴增的模板鏈進行連接，從而達 到復制模板鏈的目的。所得DNA產(chǎn)物經(jīng)過DNA瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈 觀察擴增產(chǎn)物形態(tài)為白色斑片狀影。按照如前所述技術(shù)，可檢測inter-Alu PCR擴增區(qū)域 中與疾病相關(guān)的SNP，插入/缺失。同時可將DNA復制子做進一步打斷處理，結(jié)合外顯子捕 獲技術(shù)，著重分析擴增區(qū)域外顯子中的SNP與腫瘤的相關(guān)性。 本發(fā)明的另一個實施方案是利用上述方法進行基因區(qū)DNA甲基化水平的檢測。利 用重復序列Alu家族中富含CpG位點的特點，以AluY共同序列中不含CpG位點的序列設計 不同擴增方向的2個擴增寡核苷酸引物，將引物中的"C"全部轉(zhuǎn)換成"T"。通過inter-Alu PCR擴增經(jīng)亞硫酸氫鹽預處理的基因組DNA，可獲得基因組中多位點，富含CpG的Alu及其 周圍區(qū)域的PCR產(chǎn)物。2個不同方向的擴增引物共同作用于同一 inter-Alu PCR擴增反應 體系，可獲得包括了 "尾對尾"、"頭對頭"、"頭對尾"及"尾對頭"4個方向的DNA復制子，可 使經(jīng)新一代測序技術(shù)測序所獲得的序列盡量多地提供基因組CpG位點甲基化程度的信息。 這一方法可用于正常人基因組甲基化水平的檢測，或?qū)Ω鞣N不同疾病狀態(tài)下DNA甲基化水 平改變程度進行分析。 以下，結(jié)合附圖和下列實施例對本發(fā)明作進一步描述。


圖1是實施例1中在基因區(qū)內(nèi)SNP的示意圖。顯示本發(fā)明實施例1中，通過 inter-Alu PCR反應，使得寡核苷酸引物與基因組DNA在適當位置結(jié)合后，所擴增出來的片 段，該片段主要位于基因區(qū)，并且一個SNP包含在該基因區(qū)中。 圖2是實施例1中的inter-Alu PCR以AluY共同序列中的小片段設計的兩個寡
7核苷酸引物在AluY結(jié)構(gòu)中的位置，及這兩個引物在基因組DNA中的擴增方向的示意圖。因 為AluY具有"5'"端的頭部，及"3'"端的尾部，并且它們的分布在基因組中并不均勻，所以 適當距離的兩個相鄰Alu之間可以通過inter-Alu PCR反應擴增出來。也就產(chǎn)生了如圖2 所示的，朝向"5'"方向擴增及朝向"3'"方向擴增。 圖3是實施例1中兩個AluY共同序列寡核苷酸引物在AluY中的具體位置 和序列的示意圖。其中，"尾對尾"方向擴增的寡核苷酸引物(AluT-T)位于AluY共 同序列的第182位到第200位，堿基為"5' -AGGCTGAGGCAGGAGAATG-3';"頭對頭"方 向擴增的寡核苷酸引物(AluH-H)位于AluY共同序列的第66位到第86位，堿基為 "5， -TGGTCTCGATCTCCTGACCTC-3，"。 圖4是實施例1經(jīng)紫外燈所觀察到的擴增后DNA復制子在瓊脂糖凝膠中的影像 (反色顯示)圖。左側(cè)為"尾對尾"AluY寡核苷酸引物inter-Alu PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖 凝膠中的影像，如階梯狀；中間為DNA分子標記(lkb) (Fermentas公司生產(chǎn))；右側(cè)為"頭對 頭"AluY寡核苷酸引物inter-Alu PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中的影像，如階梯狀。兩種 寡核苷酸引物的inter-Alu PCR所擴增出的條帶主要在300bp到2kb之間。箭頭所指的是 切膠測序的條帶位置。 圖5是實施例2中，靠近AluY結(jié)構(gòu)示意圖尾部的寡核苷酸引物(AluYTl)的序列 及所在AluY中的位置的示意圖。寡核苷酸引物的位置在AluY共同序列中的第278位到第 295位。堿基為"5'-GAGCGAGACTCCGTCTCA-3'"。它可以用來顯示腫瘤基因組DNA復制錯誤 表型。 圖6是3個寡核苷酸引物的擴增方向示意圖。依據(jù)Alu的方向性，其中AluY共同 序列的一條寡核苷酸引物和Alu共同序列寡核苷酸引物R12A/267可以擴增一個Alu "3'" 端與另一個Alu "3'"端之間的DNA序列("尾對尾"方向)，而另一條AluY共同序列的寡 核苷酸引物可以擴增一個Alu "5'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA序列("頭對頭"方 向)。混合寡核苷酸引物還可以擴增一個Alu "5'"端與另一個Alu "3'"端之間的DNA序 列("頭對尾"方向)，以及一個Alu "3'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA序列("尾 對頭"方向)。 圖7是實施例2中，經(jīng)紫外燈所觀察到的位于AluY尾部的單一寡核苷酸引物 inter-Alu PCR擴增后，腫瘤組織DNA復制子與對照外周血DNA復制子在瓊脂糖凝膠中的影 像(反色顯示)圖。標記為F的2個樣本為一名原發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者的腫瘤組織DNA與 外周血DNA擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中的影像。標記為L的2個樣本為另一名原發(fā)膠質(zhì)母細 胞瘤患者的腫瘤組織DNA與外周血DNA擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中的影像。標記為G的2個 樣本為繼發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者的腫瘤組織DNA與外周血DNA擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中的影 像。標記為W的2個樣本為間變少枝膠質(zhì)細胞瘤患者的腫瘤組織DNA與外周血DNA擴增產(chǎn) 物在瓊脂糖凝膠中的影像。最后的條帶為DNA分子標記(lkb)(Fermentas公司生產(chǎn))。箭 頭指出，復制錯誤表型出現(xiàn)在膠質(zhì)細胞瘤各亞型中。 圖8是實施例2中，經(jīng)紫外燈所觀察到的3個Alu混合寡核苷酸引物inter-AluPCR 擴增后，間變少枝膠質(zhì)細胞瘤腫瘤組織DNA復制子與對照外周血DNA復制子在瓊脂糖凝膠 中的影像圖(均為白色斑片狀影)。左側(cè)為腫瘤組織DNA擴增復制子在瓊脂凝膠中的影 像，中間為對照外周血DNA擴增復制子在瓊脂凝膠中的影像；右側(cè)為DNA分子標記(lkb)(Fermentas公司生產(chǎn))。 圖9是實施例3中，選取AluY共同序列中靠近中間區(qū)域的兩段不含CpG位點的 序列作為引物在AluY結(jié)構(gòu)中的位置及擴增方向的示意圖。命名其中一條寡核苷酸引物為 CH11，其擴增方向朝向"5'"，長度為llbp。該寡核苷酸引物可以進行"頭對頭"方向擴增，即 得到一個Alu "5'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA序列。命名另一條寡核苷酸引物為 CT11，其擴增方向朝向"3'"，長度為llbp。該寡核苷酸引物可以進行"尾對尾"方向擴增， 即得到一個Alu "3'"端與另一個Alu "3'"端之間的DNA序列。CH11和CT11兩個寡核苷 酸引物作用于同一個inter-Alu PCR反應，可以擴增一個Alu "5'"端與另一個Alu "3'" 端之間的DNA序列("頭對尾"方向)，以及一個Alu "3'"端與另一個Alu "5'"端之間的 DNA序列("尾對頭"方向)。 圖10顯示的是實施例3中，2個AluY共同序列寡核苷酸引物的序列中"C"變"T" 的具體位置及序列。2個AluY共同序列寡核苷酸引物經(jīng)過將"C"轉(zhuǎn)換成"T"后，它們的序 列分別是CH1 "5' TTTAATAAAAA 3'"，CT11 "5' AACATCAAAAT 3'"。 圖11顯示的是實施例3中，2個經(jīng)過"C"轉(zhuǎn)換成"T"后的Alu寡核苷酸引物擴 增基因組DNA的方向性。其與圖6顯示的3個寡核苷酸引物的inter-AluPCR擴增方向相 同?？砂ㄒ粋€Alu "3'"端與另一個Alu "3'"端之間的DNA序列("尾對尾"方向)，一 個Alu "5'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA序列("頭對頭"方向)；一個Alu "5'"端 與另一個Alu "3'"端之間的DNA序列("頭對尾"方向)以及一個Alu "3'"端與另一個 Alu "5'"端之間的DNA序列("尾對頭"方向)。所示實施例中，2個不同方向的AluY共同
序列寡核苷酸引物擴增經(jīng)亞硫酸氫鹽預處理后的腫瘤組織和對照組織(包括外周血)基因 組DNA，可產(chǎn)生上述4種不同的擴增產(chǎn)物。 圖12顯示的是實施例3中，經(jīng)亞硫酸氫鹽預處理后的DNA測序結(jié)果示意圖。以新 一代測序技術(shù)為基礎的高通量測序儀器僅需要3 ii gPCR產(chǎn)物，就可以檢測到經(jīng)亞硫酸氫鹽 預處理后的DNA序列，甲基化的"C"不會產(chǎn)生變化，而非甲基化的"C"會轉(zhuǎn)變成T。
具體實施例
實施例1 所檢測的SNP為單倍體或純合子二倍體或雜合子二倍體人類基因組DNA中集中于 基因區(qū)的SNP。圖1顯示了這樣一個在基因區(qū)內(nèi)SNP的例子。為獲得基因區(qū)序列，需要通過 inter-Alu PCR反應集中擴增基因區(qū)，而后以新一代測序技術(shù)檢測擴增后基因區(qū)中的SNP。 圖2顯示的是本發(fā)明中的inter-Alu PCR以AluY共同序列中的小片段設計的兩個寡核苷 酸引物在Alu結(jié)構(gòu)中的位置，及這兩個引物在基因組DNA中的擴增方向；而圖3顯示的是這 兩個引物的具體位置和序列。在inter-Alu PCR中，通過熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用，單一寡 核苷酸引物便可以與被檢測的模板DNA在適當?shù)男蛄形恢没パa，形成雜交的核酸結(jié)構(gòu)。然 后，在此聚合條件下，以四種核苷酸(A、 G、 T、 C)延伸寡核苷酸引物，以堿基互補原則，在熱 穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下與需要擴增的模板鏈進行連接，從而達到復制模板鏈的目的。依 據(jù)Alu的方向性，其中一條寡核苷酸引物可以擴增Alu "3'"端與Alu "3'"端之間的DNA 序列("尾對尾"方向)，而另一條寡核苷酸引物可以擴增Alu "5'"端與Alu "5'"端之間 的DNA序列("頭對頭"方向)。這些DNA復制子經(jīng)過高通量測序儀器檢測，達到集中檢測基因組中基因區(qū)SNP及發(fā)現(xiàn)基因組中基因區(qū)新SNP的目的。下面描述用本發(fā)明的方法可以 集中檢測基因區(qū)SNP的實例。 方法的第一步是用苯酚/氯仿法提取人類基因組DNA，并用乙醇純化。純化后的 DNA被稀釋到一定濃度，按實驗要求，所加DNA濃度通常為10 50ng/iU。所選取的寡核苷 酸引物位于AluY共同序列中。其中，"尾對尾"方向擴增的寡核苷酸引物位于AluY共同序列 的第182位到第200位，堿基為"5'-AGGCTGAGGCAGGAGAATG-3';"頭對頭"方向擴增的寡核苷 酸引物位于AluY共同序列的第66位到第86位，堿基為"5' -TGGTCTCGATCTCCTGACCTC-3'。 在inter-Alu PCR反應中， 一個具體實例為，每個PCR反應體系的總體積為20iU，包括 5xMastermix(10xPCR擴增緩沖液(500mM KCl，100mM Tris-Cl，15mM MgCl2) ， 50mM MgCl2，及 腦4種dNTP混合液)4iil，5iiM "尾對尾"或"頭對頭"方向擴增的寡核苷酸引物1 iU， 熱穩(wěn)定DNA聚合酶O. lyl，50ng/ul經(jīng)人類基因組DNA2iil，及去離子水12. 9iU。 PCR擴增 反應包括95t:變性5分鐘，而后35個擴增循環(huán)又包括95t:變性30秒，"頭對頭"擴增方向 的寡核苷酸引物需要66.3t:退火30秒("尾對尾"擴增方向的寡核苷酸引物需要66.8°C 退火30秒)，72t:延伸2分鐘；最后72t:延伸5分鐘終止反應。反應完畢后，取10 y L進行 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈下觀察擴增產(chǎn)物的形態(tài)及質(zhì)量。圖4為 經(jīng)紫外燈所觀察到的擴增后DNA復制子在瓊脂糖凝膠中的影像。擴增所產(chǎn)生的階梯狀影像 對比DNA分子標記(lkb)，顯示擴增條帶主要在300bp到2kb之間。選取兩個寡核苷酸引物 分別擴增人類基因組DNA，并通過切膠的方法分離出DNA復制子中的7個大小在450bp到 2kb之間的DNA復制子，最終獲得每個條帶的總質(zhì)量〉10iig。這些DNA復制子通過以新一 代測序技術(shù)為基礎的高通量測序儀器測出372Mb的DNA序列數(shù)據(jù)。此后，借助小片段寡核 苷酸分析軟件包(SOAPalinger)的組裝，形成長鏈DNA序列，并通過對比人類基因組序列確 定檢測出的各DNA序列的位置。另外，各序列通過BLAST及UCSC數(shù)據(jù)庫比對人類基因組序 列，明確各序列中的SNP及發(fā)現(xiàn)新SNP。 經(jīng)過測序及生物信息學處理，上述實例中inter-Alu PCR擴增產(chǎn)物包括DNA片段 374條，其中153條序列在基因區(qū)，占測序所得DNA序列的40X ;而整個基因區(qū)在整個基因 組中的比率只有25% ，這結(jié)果證明了 Alu主要集中于基因區(qū)，而通過inter-Alu PCR擴增的 兩個Alu之間的序列也多集中于基因區(qū)。此外，在整個基因組中基因數(shù)量約為25， 000個， 而現(xiàn)已知腫瘤相關(guān)基因數(shù)量為6522個，占整個基因總數(shù)的26%。在本實例中的所有基因 區(qū)序列所在的基因為128個，其中75個基因為腫瘤相關(guān)性基因，占總測序所涵蓋的基因數(shù) 量的58% 。通過BLAST及UCSC數(shù)據(jù)庫對比人類基因組序列，發(fā)現(xiàn)包括非基因區(qū)在內(nèi)的SNP 數(shù)量為262個，其中新SNP為42個。因此證明該方法可以提供更多量基因區(qū)SNP的信息。
實施例2 實施例2與實施例1相似，區(qū)別在于，此實施例主要集中于對多基因疾病相關(guān)性的 研究，利用該方法檢測基因區(qū)SNP、插入/缺失與疾病的關(guān)系，特別是通過"外顯子捕獲"對 基因區(qū)外顯子中的SNP、插入/缺失與疾病的關(guān)系進行分析。為獲得腫瘤基因組復制錯誤 (implication error)的表型特征及更多測序數(shù)據(jù)，選取將AluY共同序列中靠近"3'"端的 序列作為寡核苷酸引物，引物擴增方向為"尾對尾"。圖5顯示的是該寡核苷酸引物的序列 及所在AluY中的位置。寡核苷酸引物的位置在Alu共同序列中的第278位到第295位。堿 基為"5' -GAGCGAGACTCCGTCTCA-3'"。將此寡核苷酸引物與前述"頭對頭"方向擴增的寡核苷酸弓I物，堿基為"5' -TGGTCTCGATCTCCTGACCTC-3'"及Alu共同序列弓|物Rl2A/267，堿基為 "5'-AGCGAGACTCCG-3'"按照一定比例進行混合。在inter-Alu PCR中，通過熱穩(wěn)定DNA聚 合酶的作用，任何一個寡核苷酸引物便可以與被檢測的模板DNA在適當?shù)男蛄形恢没パa， 形成雜交的核酸結(jié)構(gòu)。然后，在此聚合條件下，以四種核苷酸(A、 G、 T、 C)延伸寡核苷酸引 物，以堿基互補原則，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下與需要擴增的模板鏈進行連接，從而達 到復制模板鏈的目的。圖6顯示的是3個寡核苷酸引物的擴增方向。依據(jù)Alu的方向性， 其中AluY共同序列的一條寡核苷酸引物和Alu共同序列寡核苷酸引物R12A/267可以擴增 一個Alu "3'"端與另一個Alu "3'"端之間的DNA序列("尾對尾"方向)，而另一條AluY 共同序列的寡核苷酸引物可以擴增一個Alu "5'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA序列 ("頭對頭"方向)?；旌瞎押塑账嵋镞€可以擴增一個Alu "5'"端與另一個Alu "3'"端 之間的DNA序列("頭對尾"方向)，以及一個Alu "3'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA 序列("尾對頭"方向)。單一AluY "尾對尾"方向擴增的寡核苷酸引物可通過inter-Alu PCR擴增腫瘤組織DNA和對照組織DNA，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示出兩組擴增產(chǎn)物中的 差異，即復制錯誤表型(r印licationerror)。多寡核苷酸引物的inter-Alu PCR擴增出的 這些DNA復制子經(jīng)過高通量測序儀器檢測，可獲得與腫瘤相關(guān)的基因SNP、點突變，插入/缺 失片段的信息。 —個具體實例為，第一步是用苯酚/氯仿法提取患者腫瘤組織和腫瘤對照 組織(包括外周血)DNA，并用乙醇純化。純化后的DNA被稀釋到一定濃度，按實驗要 求所加DNA濃度為50ng/iU。所選取的寡核苷酸引物位于AluY共同序列的尾部，其 位置與堿基序列如前所述，為AluY共同序列中的第278位到第295位。堿基序列為 "5' -GAGCGAGACTCCGTCTCA-3'"，"尾對尾"方向擴增。在inter-Alu PCR反應中，每個 PCR反應體系的總體積為20ii 1，包括5x Mastermix(10x PCR擴增緩沖液(500mM KCl， lOOmM Tris-Cl，15mM MgCl2) ， 50mM MgCl2，及10mM 4禾中dNTP混合液)4 ii 1， 5 ii M引物 AluYTl 1. 2iil，熱穩(wěn)定DNA聚合酶0. liil，50ng/iil經(jīng)人類基因組DNA 2iU，及去離子水 12. 7 ill 。 PCR擴增反應包括95。C變性5分鐘，而后35個擴增循環(huán)又包括95。C變性30秒， 寡核苷酸引物需要67t:退火30秒，72t:延伸2分鐘；最后72t:延伸5分鐘終止反應。反應 完畢后，20yL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈下觀察擴增產(chǎn)物的 形態(tài)及質(zhì)量。圖7為經(jīng)紫外燈所觀察到的擴增后腫瘤組織DNA復制子與對照外周血DNA復 制子在瓊脂糖凝膠中的影像，箭頭指出，復制錯誤表型出現(xiàn)在膠質(zhì)細胞瘤各亞型中。
進一步獲得豐富的腫瘤相關(guān)的基因區(qū)SNP、點突變，插入/缺失片段信息，需要多 Alu家族共同序列寡核苷酸引物參與的inter-Alu PCR反應，集中擴增基因組中基因區(qū)，所 得DNA復制子通過以新一代測序技術(shù)為基礎的高通量測序儀器檢測基因區(qū)SNP、點突變， 插入/缺失與腫瘤之間的關(guān)系。具體為，上述三個寡核苷酸引物，按5 : 3 : l混合后加 入PCR反應中。在inter-Alu PCR反應中，每個PCR反應體系的總體積為20 yl，包括5x Mastermix(10x PCR擴增緩沖液(500mM KCl，100mM Tris-Cl，15mM MgCl2) ， 50mM MgCl2， 及10mM 4種dNTP混合液)4iil，5iiM AluY共同序列"尾對尾"擴增方向寡核苷酸引物 1.5iil，5iiMAluY共同序列"頭對頭"擴增方向寡核苷酸引物0.9ia，5iiM Alu共同序列 "尾對尾"擴增方向寡核苷酸引物R12A/267 0. 3iU，熱穩(wěn)定DNA聚合酶0. liil，10ng/iil人 類基因組DNA lyl，及去離子水12. 2iU。 PCR擴增反應包括95。C變性5分鐘，而后20個擴增循環(huán)又包括95t:變性30秒，多寡核苷酸引物需要57.『C退火30秒，72。C延伸2分鐘； 最后72t:延伸5分鐘終止反應。反應完畢后，取5 ii L與50%甘油混合后進行1. 5%瓊脂糖 凝膠電泳，在紫外燈下觀察擴增產(chǎn)物的形態(tài)及質(zhì)量。圖8為經(jīng)紫外燈所觀察到的擴增后腫 瘤組織DNA復制子與對照外周血DNA復制子在瓊脂糖凝膠中的影像，為白色斑片狀影。該 實例中，僅需要750ng的模板DNA通過inter-Alu PCR反應及純化步驟，即可產(chǎn)生大于3 y g 的DNA復制子。該DNA復制子可滿足高通量測序儀器的檢測要求，生成比實例1更多的集 中于基因區(qū)的序列，用于分析腫瘤基因組基因區(qū)的SNP、點突變，插入/缺失與腫瘤的關(guān)系。 同樣可借助小片段寡核苷酸分析軟件包(SOAPalinger)的組裝，形成長鏈DNA序列，并通過 對比人類基因組序列確定檢測出的各DNA序列的位置。另外，各序列通過BLAST及UCSC數(shù) 據(jù)庫比對人類基因組序列，確定各序列中的SNP在腫瘤與對照基因組DNA中的差別，點突變 的位置，也可以確定腫瘤組織DNA插入/缺失的位置。 —個特殊實施例為，上述多寡核苷酸引物inter-Alu PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，利用"外 顯子捕獲"技術(shù)僅分析基因區(qū)外顯子中的SNP、點突變，插入/缺失與腫瘤之間的關(guān)系。具 體為，通過捕獲外顯子的載體pETV-SD是一種反轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體(shuttle vector)。 因為凡是有內(nèi)含子和外顯子的基因在轉(zhuǎn)錄后都要經(jīng)過RNA剪接，這就需要有剪接供體 (splicing donor， SD)位點和剪接受體(splicingacc印tor， SA)位點。DNA復制子被超聲 打斷成小片段后，克隆在載體位于"外顯子捕獲序列"下游的克隆位點上。而后，將這些重 組載體匯總后感染反轉(zhuǎn)錄病毒的專宿包裝細胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——V2細胞系。V2細胞提供蛋白質(zhì)產(chǎn)物使載體(自身不能合成病毒蛋白質(zhì))成 為反轉(zhuǎn)錄病毒在細胞里增殖。當反轉(zhuǎn)錄病毒在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄時，如果插入片段中包含有功 能的SA位點，則有可能發(fā)生RNA剪接反應而將IVS切除。已剪接和未剪接的病毒RNA都 包裝在病毒子(virion)中，從細胞培養(yǎng)液中收集后用來感染兼宿反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系 (卿hotropic retroviral packagingcell line)PA-317。這使反轉(zhuǎn)錄病毒再進行一輪復 制，并產(chǎn)生能感染猴腎細胞系COS細胞的高效價病毒原種。從第二個細胞系PA-317細胞中 分離得到的病毒，用來感染組成型產(chǎn)生SV40T(腫瘤)抗原的C0S細胞。病毒RNA基因組被 反轉(zhuǎn)錄，并在載體上的SV40復制起點作用下，以環(huán)狀DNA附加體形式進行復制。從C0S細胞 中回收復制的附加體DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dpn I酶切后轉(zhuǎn)化細菌。在含卡那霉素(Kn)和 5_氯_4-溴-3-吲哚-13 -D-半乳糖苷(X-gal)的培養(yǎng)基上挑選轉(zhuǎn)化子。盧_半乳糖苷酶 可水解X-gal而生成藍色產(chǎn)物。因此，不產(chǎn)生P-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化子菌落則呈白色。只挑 選出白色菌落作進一步研究的材料。準確的剪接反應可切除作為標記的IVS，使人口 -珠蛋 白基因的第l外顯子與落入了捕獲陷阱的插入片段中的外顯子序列連接。這樣通過高通量 測序技術(shù)可以檢測用于分析腫瘤基因組基因區(qū)外顯子中的SNP、點突變，插入/缺失與腫瘤 的關(guān)系。同樣可借助小片段寡核苷酸分析軟件包(S0APalinger)的組裝，形成長鏈DNA序 列，并通過對比人類基因組序列確定檢測出的各DNA序列的位置。另外，各序列通過BLAST 及UCSC數(shù)據(jù)庫比對人類基因組序列，確定各序列中的SNP在腫瘤與對照基因組DNA中的差 別，點突變的位置，也可以確定腫瘤組織DNA插入/缺失的位置。
實施例3 該實施例與實施例1及實施例2也有相似性。因為絕大多數(shù)的5-甲基胞嘧啶 (5mC)主要集中于富含CpG位點的重復序列Alu家族中，并且據(jù)估計，在整個人類基因組，
12Alu家族可包含多達33X的CpG位點。既往研究表明，在腫瘤基因組中，Alu序列中的某些 特殊CpG位點甲基化水平出現(xiàn)顯著性降低，這一現(xiàn)象在AluY亞家族中尤為突出。此外，在 精神分裂癥的相關(guān)研究中，我們發(fā)現(xiàn)，AluY序列內(nèi)及其周圍區(qū)域的某些CpG位點甲基化水 平亦出現(xiàn)顯著性改變。因此，在本實施例中，為研究各類疾病中基因區(qū)CpG位點甲基化水平 改變程度，需要對所選取的AluY寡核苷酸引物的位置進行調(diào)整。因為DNA在經(jīng)過亞硫酸氫 鹽預處理后，未被甲基化的CpG位點中的"C"會轉(zhuǎn)換成"T"，所以核苷酸引物不能包括CpG 位點，并且需要將所選取位置中的非CpG位點中的"C"轉(zhuǎn)換為"T"。另外，為了包含更多的 Alu區(qū)域序列，所選擇的AluY共同序列需更靠近共同序列的中間區(qū)域。如圖9中顯示，選取 AluY共同序列中靠近中間區(qū)域的兩段不含CpG位點的序列作為引物。命名其中一條寡核 苷酸引物為CH11，其擴增方向朝向"5'"，長度為llbp。該寡核苷酸引物可以進行"頭對頭" 方向擴增，即一個Alu "5'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA序列。命名另一條寡核苷 酸引物為CT11，其擴增方向朝向"3'"，長度為llbp。該寡核苷酸引物可以進行"尾對尾"方 向擴增，即一個Alu "3'"端與另一個Alu "3'"端之間的DNA序列。CH11和CT11兩個寡核 苷酸引物作用于同一個inter-Alu PCR反應，可以擴增一個Alu "5'"端與另一個Alu "3'" 端之間的DNA序列("頭對尾"方向)，以及一個Alu "3'"端與另一個Alu "5'"端之間的 DNA序列("尾對頭"方向)。 因為經(jīng)亞硫酸氫鹽預處理后的非甲基化"C"全部轉(zhuǎn)換成"T"。所以，將設計的2條 寡核苷酸引物CHll與CTll中的"C"全部轉(zhuǎn)換為"T"。圖10中所示的是2個AluY共同序 列寡核苷酸引物中"C"變"T"的具體位置。2個AluY共同序列寡核苷酸引物經(jīng)過將"C"轉(zhuǎn) 換成"T"后，它們的序列分別是CHll "5'TTTAATAAAAA 3'"，CT11 "5'AACATCAAAAT 3'"。 圖11與圖6顯示的3個寡核苷酸引物的inter-Alu PCR擴增方向相同，所得PCR產(chǎn)物依據(jù) Alu寡核苷酸引物擴增的方向性，可包括一個Alu "3'"端與另一個Alu "3'"端之間的DNA 序列("尾對尾"方向)， 一個Alu "5'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA序列("頭對頭" 方向)；一個Alu "5'"端與另一個Alu "3'"端之間的DNA序列("頭對尾"方向)以及一 個Alu "3'"端與另一個Alu "5'"端之間的DNA序列("尾對頭"方向)。所示實施例中，2 個不同方向的AluY共同序列寡核苷酸引物擴增經(jīng)亞硫酸氫鹽預處理后的腫瘤組織和對照 組織(包括外周血)基因組DNA，可產(chǎn)生上述4種不同的擴增產(chǎn)物。如圖ll所示，擴增產(chǎn)物 包括"頭對頭"、"尾對尾"、"頭對尾"及"尾對頭"4個方向的DNA復制子。經(jīng)DNA瓊脂糖凝 膠電泳檢測，擴增產(chǎn)物顯示為白色斑片影。具體為，取900ng基因組DNA加入0. 3M氫氧化 鈉(NaOH)并放置于42°C ，持續(xù)20分鐘。之后在95。C放置3分鐘，(TC放置1分鐘。此后，上 述樣品加入ra為5. 0的焦亞硫酸鈉(2. 0M)及對苯二酚(0. 5mM)，上層覆蓋礦物油，放置于 55°C ，持續(xù)16小時。經(jīng)亞硫酸氫鹽預處理后的DNA經(jīng)過純化，可通過inter-Alu PCR反應 進行擴增。每個PCR反應體系的總體積為20iU，包括5x Mastermix(10x PCR擴增緩沖液 (500mM KCl，100mM Tris-Cl，15mM MgCl2) ， 50mM MgCl2，及10mM 4種dNTP混合液)4 ii 1， 5uM 引物CHll liil，5uM引物CT11 lyl，熱穩(wěn)定DNA聚合酶O. 1 yl， 10ng/yl經(jīng)亞硫酸氫鹽預 處理后的基因組DNA 2iU，及去離子水11.9iU。 PCR擴增反應包括95t:變性5分鐘，而 后20個擴增循環(huán)又包括95。C變性30秒，52。C退火30秒，72。C延伸2分鐘；最后72。C延伸5 分鐘終止反應。因為經(jīng)過亞硫酸氫鹽預處理過的基因組DNA為單鏈DNA，所以在inter-Alu PCR反應中不容易擴增。因此需要重復進行上述inter-Alu PCR反應，以增加DNA復制子的質(zhì)量。反應完畢后，取5ii L與50%甘油混合后進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下 觀察擴增產(chǎn)物的質(zhì)量。所獲得的DNA復制子是集中于基因區(qū)Alu及Alu周圍區(qū)域的DNA片 段。在圖12中，新一代測序技術(shù)僅需要3ii gPCR產(chǎn)物，就可以檢測到經(jīng)亞硫酸氫鹽預處理 后的DNA序列，甲基化的"C"不會產(chǎn)生變化，而非甲基化的"C"會轉(zhuǎn)變成T。此后，經(jīng)過前述 小片段寡核苷酸分析軟件包(SOAPalinger)的組裝，形成長鏈DNA序列，并通過對比人類基 因組序列確定檢測出的各DNA序列的位置。另外，各序列通過BLAST及UCSC數(shù)據(jù)庫比對人 類基因組序列，確定各序列中基因區(qū)腫瘤與對照基因組DNA CpG位點中的"C"甲基化程度 是否存在差別。 上述實施例3亦可用于對其他疾病的甲基化水平改變的探索，也就是說，雖然在 實施例1中，高通量測序儀器的測序結(jié)果顯示，58%的基因區(qū)序列所屬基因為腫瘤相關(guān)基 因，但是所有的基因均存在與各類疾病相關(guān)的可能性，因此，該方法可以擴展到對其他疾病 基因區(qū)特征的研究中。
權(quán)利要求
以Alu間聚合酶鏈式反應為基礎的檢測基因區(qū)特征的方法，包括以下步驟(1)以Alu家族共同序列為主要寡核苷酸引物，利用單一或多寡核苷酸引物作為引物對樣本DNA進行inter-Alu PCR擴增；(2)采用循環(huán)陣列合成測序法為基礎的高通量測序儀器進行測序；(3)對測序結(jié)果進行基因組中基因區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)、點突變，插入/缺失及雙脫氧核苷酸分子(DNA)甲基化CpG位點的檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述被擴增的樣本DNA為多個兩Alu序列 間的DNA片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是所述步驟(1)的樣本DNA是利用苯酚/氯 仿法提取組織或外周血分離的白細胞中的DNA，提取后的DNA使用瓊脂糖凝膠電泳，通過溴 乙錠染色，在紫外燈下觀察DNA提取質(zhì)量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征是以AluY共同序列中的片段設計的寡核 苷酸引物，其序列為5' -GAGCGAGACTCCGTCTCA-3',5' -TGGTCTCGATCTCCTGACCTC-3或 5， -TGGTCTCGATCTCCTGACCTC-3，。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是以AluY共同序列寡核苷酸引物及Alu共同 序列引物R12A/267的混合物作為引物，以擴增更多基因區(qū)序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述inter-Alu PCR使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在進行DNA CpG位點甲基化水平的檢測時， DNA需要亞硫酸氫鹽的處理。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是inter-Alu PCR以AluY共同序列中靠 近中間區(qū)域的兩段不含CpG位點的序列作為引物，引物CHll朝向"5'"方向擴增，長度 為11bp，序列為"5' TTTAATAAAAA 3'" ;CTll朝向"3'"方向擴增，長度為llbp，序列為 "5' AACATCAAAAT 3"，。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是在進行DNA CpG位點甲基化水平的檢測時， 新一代測序技術(shù)檢測對比經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的腫瘤及非腫瘤基因組DNA甲基化水平差 異，主要檢測區(qū)域為富含CpG位點的基因組Alu區(qū)域及Alu旁區(qū)域。
10. 根據(jù)權(quán)利7所述的方法，其特征是以AluY或Alu共同序列中任意位置的不含CpG 位點的序列經(jīng)過"C"轉(zhuǎn)換為"T"后，作為寡核苷酸引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及集中擴增并檢測基因組DNA基因區(qū)的方法，目的在于探明基因組中基因區(qū)的特征。這些特征包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、點突變，序列插入/缺失及雙脫氧核苷酸分子(DNA)甲基化CpG位點的水平。該方法以Alu家族，特別是AluY亞家族共同序列為主要寡核苷酸引物，利用多寡核苷酸引物Alu間聚合酶鏈式反應(inter-Alu PCR)擴增基因組DNA，擴增DNA復制子多集中于基因組中各基因區(qū)。該方法的特點在于，通過inter-Alu PCR可過濾掉部分非基因區(qū)序列，使新一代測序技術(shù)集中檢測基因區(qū)的SNP、點突變，序列插入/缺失及DNA甲基化CpG位點的水平，并可節(jié)省測序所需基因組DNA用量。
文檔編號C12Q1/68GK101792808SQ20101013948
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者梅玲玲, 薛紅 申請人:廣州市香港科大霍英東研究院