專利名稱：一種小環(huán)肽的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬環(huán)肽的制備領域，特別是涉及一種小環(huán)肽的制備方法。
背景技術：
天然存在的蛋白質大多是以線性結構存在的，但是已有多個實驗證實天然存在的 多肽中也有以環(huán)狀形式存在的。天然存在的環(huán)狀多肽有如下兩種形式1，在蛋白鏈內通過 二硫鍵實現的環(huán)化連接；2，肽鏈的兩端通過天然肽鍵或酰胺鍵相連接。往往后者的應用前 景要好于前者。研究發(fā)現，缺少了游離的羧基和氨基的環(huán)狀多肽相比線性形式的多肽在熱 力學穩(wěn)定性上提高了許多，例如，工業(yè)用酶催化，長時間記錄的NMR等，這些應用對功能蛋 白的熱穩(wěn)定性提出了很高的要求。與二硫鍵連接的環(huán)狀多肽相比，通過肽鍵末端相連的環(huán) 狀多肽可以防止蛋白末端酶(氨肽酶和羧肽酶)的消化，這使得通過這種方式相連的環(huán)化 多肽在體內進行蛋白藥物的供給和治療上具有廣闊的應用前景。現有的以肽鍵相連方式制備環(huán)狀多肽的方法又可以分為兩種化學合成和蛋白質 內含子介導的蛋白質環(huán)化。但是化學合成相比生物合成方法而言，其成本和得率都相對較 低，所以使得大力發(fā)展和研究生物法合成環(huán)肽顯得十分必要。蛋白質內含子(intein)是上世紀90年代發(fā)現的，它的發(fā)現給蛋白質工程帶來了 新的研究方法和思路。蛋白質內含子是位于蛋白質前體中的插入序列，其兩側的氨基酸序 列稱為蛋白質外顯子。在蛋白質前體翻譯后成熟過程中，蛋白質內含子通過四步親核置換 反應，精確地從蛋白前體中自我切除，同時催化兩側蛋白質外顯子以天然肽鍵相連產生成 熟蛋白，這一過程稱為蛋白質順式剪接(如圖1)。將標準蛋白質內含子的N端及N端蛋白 質外顯子和標準蛋白質內含子的C端及C端蛋白質外顯子分別在兩個開放閱讀框架中表 達，即構成了斷裂蛋白質內含子。斷裂蛋白質內含子通過兩端剪接活性區(qū)域相互識別，重建 催化活性中心，然后再按標準蛋白質內含子的四步親核置換反應完成兩端外顯子的連接， 這一過程稱之為反式剪接。斷裂蛋白質內含子的發(fā)現使其在蛋白質工程中有了更廣泛的應 用，其中一項重要的應用就是環(huán)化蛋白質。將目的環(huán)化蛋白(TP，target protein)插入到斷裂蛋白質內含子的C端剪接活性 區(qū)域(I。)和N端剪接活性區(qū)域(In)之間，形成Ic-TP-In的表達模式(如圖2)，在體內或體 外誘導蛋白質的環(huán)化反應。此反應與蛋白質的反式剪接反應類似，蛋白質的N端剪接活性 區(qū)域和C端剪接活性區(qū)域相互識別，構成剪接活性中心，然后按照蛋白質反式剪接的步驟 將目的蛋白兩端的游離氨基和羧基以肽鍵相連接。蛋白質內含子剪接反應的進行對C端外顯子的第一個氨基酸有著嚴格的要求，大 致可以分為三類Cys (C)型、SeHS)型以及Thr(T)型。其中，以C型斷裂蛋白質內含子居 多，但是天然蛋白質中Cys的數目相對較少且容易形成二硫鍵所以大大限制了其作為環(huán)化 蛋白質媒介的應用；T型的斷裂蛋白質內含子的剪接效率一般沒有前兩種高，所以這也限 制了其作為環(huán)化工具的應用。相對于C型和T型斷裂蛋白質內含子而言，S型則可作為最 理想的工具，因為Ser在目的蛋白中出現的頻率和其介導的剪接效率都很高。
當蛋白質內含子作為環(huán)化多肽工具時，由于斷裂蛋白質內含子剪接效率的限制以 及環(huán)化產物與線性產物在分子量和等電點(PI)等性質上的相似性，使得在體內和體外純 化環(huán)化產物的工藝比較復雜。這一難題已成為使用蛋白質內含子工業(yè)化大量制備環(huán)化多肽 的瓶頸?，F有的報道案例基本都只能得到一個線性和環(huán)化產物的混合物。Strep-tag技術開發(fā)的原理是眾所周知的生物素(biotin)和抗生物素蛋白鏈菌 素(sti^ptavidin)之間的結合反應。為了將這種牢固的相互作用用于蛋白質純化，研究者 們發(fā)現需要一個肽，該肽與重組蛋白質融合后，能夠結合在StMptavidin的生物素結合口 袋，從而作為純化tag。最后研究者們成功設計出一個只由8個氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-G In-Phe-Glu-Lys)構成的短序列并稱之為Str印-tag II。由于其在純化方面的緩沖液(如 PBS)比較溫和，且標簽中的8個氨基酸分布均勻偏于中性，對目的融合蛋白的性質不會造 成影響，所以將其作為一種強有力的純化工具應用于分子生物學。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種小環(huán)肽的制備方法，該方法簡單，成本低， 產率高，適合于工業(yè)化生產。本發(fā)明的一種小環(huán)肽的制備方法，包括(1)利用PCR技術，根據intein設計兩對引物并分別在兩端加上Ndel，AgeI和 AgeIXhoI酶切位點，對含有intein的基因組DNA進行PCR擴增，將PCR產物進行雙酶切， 載體pET-LIC利用同樣的兩個酶進行雙酶切，然后將intein片段和雙切后的載體按摩爾比 2 1進行連接，得到了質粒pE-INN*pE-INc(IN為蛋白質內含子)；(2)將質粒PE-INn和pE_INc作為模板，利用限制性內切酶進行雙酶切，分別回收含 有intein的片段后，按摩爾比1 2進行連接，轉化感受態(tài)細胞后得到質粒pE_IN。_INN(即 利用限制性內切酶將蛋白質內含子的N端剪接活性區(qū)域In和C端剪接活性區(qū)域Ie進行重 排)(3)將需環(huán)化的目的小肽利用inverse PCR插入到蛋白質內含子的剪接活 性區(qū)域之間，并在兩端加上斷裂的純化標簽，純化標簽從Ser處斷裂，構建成表達質粒 PE-INc-TP-INn ；PCR引物對序列如下上游引物5，-目的環(huán)化蛋白+斷裂純化標簽A+inteinN-3’ ；下游引物5’ -目的環(huán)化蛋白+inteinC端連接Ser的斷裂純化標簽 B+inteinC-3’ ；其中，斷裂純化標簽A+斷裂純化標簽B即為純化標簽；(4)將重組質粒轉化到蛋白表達系統(tǒng)中過夜培養(yǎng)，，挑取單克隆試管培養(yǎng)過夜作為 種子按1 5% (ν/ν)的接種量于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至0D_達到0. 5 0. 8，加入終濃度 為0. 4mM的IPTG進行目的蛋白的誘導表達過夜，離心收集菌體，重懸于與純化相匹配的緩 沖液進行超聲破碎菌體使目的蛋白得以釋放到胞外；(5)按照純化標簽使用說明對目的環(huán)化蛋白進行純化。所述步驟(2)中的雙酶切是指用限制性內切酶Pst I和Age I按摩爾比1 1混 合進行酶切重排；(由MBI公司提供)
所述步驟(3)中的純化標簽滿足以下兩個要求(1)標簽中必須含有一個Ser ； (2)標簽的氨基酸個數為8-10個。所述步驟(3)中的純化標簽的氨基酸序列為WSHPQFEK。所述步驟(3)中的引物的序列為上游引物5，-目的環(huán)化蛋白+W+inteinN-3，；下游引物5，-目的環(huán)化蛋白+SHPQFEK+inteinC-3，。
所述步驟(4)中的蛋白表達系統(tǒng)包括常規(guī)的原核表達系統(tǒng)(如大腸桿菌)或真核 表達系統(tǒng)(如酵母和昆蟲細胞)。所述步驟(4)中的wash buffer 為 IOOmM Tris-Cl, 150mM NaCl, ImM EDTA，pH8. 0。本發(fā)明利用Str印-tag標簽純化蛋白質內含子介導的環(huán)肽。在Str印-tag純化標 簽的Ser處進行斷裂，將斷開的兩部分分別加在需環(huán)化目的蛋白的兩端，構建成如圖3所示 的結構。未被環(huán)化的目的蛋白的純化標簽是不完整的，與生物素的結合能力降低，而環(huán)化 后的目的蛋白的純化標簽是拼接完整的。基于這一原理，環(huán)化的目的蛋白可以從體內或體 外得到純化，從而有效地區(qū)分線性目的蛋白、前體蛋白和環(huán)化的目的蛋白。有益效果(1)本發(fā)明的制備方法簡單，成本低，產率高，適合于工業(yè)化生產；(2)使用本發(fā)明方法能夠制備多種環(huán)化藥物蛋白或其它功能蛋白的環(huán)化產物。


圖1為蛋白質順式剪接示意圖；圖2為蛋白質內含子介導的蛋白環(huán)化反應；圖3為利用Str印-tag純化環(huán)肽示意圖(In表示N端剪接活性區(qū)域；IC表示C端 剪接活性區(qū)域)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。實施例1環(huán)化一個16個氨基酸小肽(SHPQFEK TLPAGEQRKDVYVQLY W,陰影部分為標簽 序列)(1)利用PCR技術，根據intein設計兩對引物并分別在兩端加上Ndel，AgeI和 AgeIXhoI酶切位點，對海洋藍細菌基因組DNA進行PCR擴增，將PCR產物進行雙酶切，載 體pET-LIC利用同樣的兩個酶進行雙酶切，然后將intein片段和雙切后的載體按摩爾比 2 l進行連接，得到了質粒pE-TE3N和pE-TE3c(TE3為蛋白質內含子)；C 端上游5，GGCCATATGGGTGGATCCGTAAAAATT-3，
下游5，--GCCCGCGAGGTTGGAAGCAATTAACCC-3，N 端上游5，-GGCACCGGTTGTTTAACTTATGAGACTGAA-3，下游5，-GGCCTCGAGTTCTAGTTCAAGAGTCCC-3，擴增后的產物Ter DnaE_3n Intein序列為C端序列ggc catatgtggatccgtaaaaattgtctctcacaaacttgccaaaacagaaaatgtttatgacattgg tgtaactaaagaccataattttgtattagcaaacgggttaattgcttccaacagc acctgc gcc ；N端序列ggc acctgc tgtttaacttatgagactgaaattatgactgtagaatatggtcctcttcctattggtaaa attgtagaatatcggattgaatgtacggtttatacggttgataaaaatggatatatttatactcagccaattgctca atggcataatcgaggtatgcaggaagtttatgaatatagccttgaagatggaacagttattcgggcaactccagaac ataagtttatgacagaagatggtcaaatgttgcctattgatgaaatttttgagcgtaatttggatttaaaatgttta gggactcttgaactagaagctagc ctcgag gcc ；(陰影部分為酶切位點)(2)將質粒pE-TE3dnpE-TE3dt為模板，利用限制性內切酶Pst I和Age I進行 雙酶切，分別回收4. 7kb片段(含有intein片段)和0. 7kb片段(含有intein片段)后 按摩爾比1 2進行連接，轉化感受態(tài)細胞后得到質粒pE-TE3。-TE3N;(3)將需環(huán)化的目的小肽利用inverse PCR插入到蛋白質內含子的剪接活性區(qū) 域之間，并在兩端加上斷裂的純化標簽(由IBA公司提供的Str印-tag)，構建成表達質粒 pE-TE3c-TP-TE3N；PCR引物對序列如下上游引物5'-CGTAAAGACGTTTACGTTCAGCTGTACCTGCAGCACCTG TGG tgtttaacttatgagactg-3 ‘；下游弓丨物5，-CTGTTCACCAGCCGGCAGGG.TTTTTTCGAACTGCGGGTGAGA
gttggaagcaattaacccgtt-3 ‘；其中，陰影部分為標簽序列，大寫部分(非陰影)為環(huán)化目的蛋白序列，小寫為 intein匹配序列；(4)將重組質粒轉化到大腸桿菌中過夜培養(yǎng)，挑取單克隆按1 % (v/v) d的接種量 于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至OD6tltl達到0. 6，加入終濃度為0. 4mM的IPTG進行目的蛋白的誘導表 達過夜，離心收集菌體，重懸于wash buffer (IOOmM Tris-Cl, 150mM NaCl, ImM EDTA，pH8.0) 進行超聲破碎菌體使目的蛋白得以釋放到胞外；(5)將破碎后的菌體離心12000g，時間30min，收集離心后上清過IOml的層析柱 (BIO-RAD, IOml柱子，填料為IBA公司str印-Tacin sepharose,依據培養(yǎng)規(guī)模和產物需 求量可對柱子和填料進行選擇)，并用5倍柱床體積的wash buffer進行漂洗，最后利用 elutionbuffer(IOOmM Tris-Cl,150mM NaCl,ImM EDTA,2. 5mM desthiobiotin, ρΗ8· 0)對 目的蛋白進行洗脫。環(huán)化的目的蛋白即可得到，產量可以達到2mg/L，純度可以達到80%以 上。本發(fā)明所涉及的酶切反應條件，請參見限制性內切酶的產品說明書；PCR擴增體系反應條件請參見Taq擴增酶的產品說明書；目的蛋白的純化條件依據所用純化標簽需 求，具體請參見純化標簽說明書。
權利要求
一種小環(huán)肽的制備方法，包括(1)利用PCR技術，根據intein設計兩對引物并分別在兩端加上NdeI，AgeI和AgeIXhoI酶切位點，對含有intein的基因組DNA進行PCR擴增，將PCR產物進行雙酶切，載體pET-LIL利用同樣的兩個酶進行雙酶切，然后將intein片段和雙切后的載體按摩爾比2∶1進行連接，得到了質粒pE-INN和pE-INC；(2)將質粒pE-INN和pE-INC作為模板，利用限制性內切酶進行雙酶切，分別回收含有intein的片段后，按摩爾比1∶2進行連接，轉化感受態(tài)細胞后得到質粒pE-INC-INN；(3)將需環(huán)化的目的小肽利用inverse PCR插入到蛋白質內含子的剪接活性區(qū)域之間，并在兩端加上斷裂的純化標簽，純化標簽從Ser處斷裂，構建成表達質粒pE-INC-TP-INN；PCR引物對序列如下上游引物5’-目的環(huán)化蛋白+斷裂純化標簽A+inteinN-3’；下游引物5’-目的環(huán)化蛋白+inteinC端連接Ser的斷裂純化標簽B+inteinC-3’；其中，斷裂純化標簽A+斷裂純化標簽B即為純化標簽；(4)將重組質粒轉化到蛋白表達系統(tǒng)中過夜培養(yǎng)，挑取單克隆試管培養(yǎng)過夜作為種子按1～5％(v/v)的接種量于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至OD600達到0.5～0.8，加入終濃度為0.4mM的IPTG進行目的蛋白的誘導表達過夜，離心收集菌體，重懸于與純化相匹配的緩沖液進行超聲破碎菌體使目的蛋白得以釋放到胞外；(5)按照純化標簽Strep-tag使用說明對目的環(huán)化蛋白進行純化。
2.根據權力要求1所述的一種小環(huán)肽的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的雙 酶切是指用限制性內切酶Pst I和Age I按摩爾比1 1混合進行酶切重排。
3.根據權力要求1所述的一種小環(huán)肽的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的純 化標簽滿足以下兩個要求(1)標簽中必須含有一個Ser ； (2)標簽的氨基酸個數為8_10 個。
4.根據權力要求3所述的一種小環(huán)肽的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的純 化標簽的氨基酸序列為WSHPQFEK。
5.根據權力要求1或4所述的一種小環(huán)肽的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中 的引物的序列為上游引物5’ -目的環(huán)化蛋白+純化標簽W+inteinN-3’ ；下游引物5，-目的環(huán)化蛋白+純化標簽SHPQFEK+inteinC-3，。
6.根據權力要求1所述的一種小環(huán)肽的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的蛋 白表達系統(tǒng)包括常規(guī)的原核表達系統(tǒng)或真核表達系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小環(huán)肽的制備方法，包括(1)用限制性內切酶分別對擴增出的含intein基因組DNA和載體pET-LIc進行酶切重組，得到質粒pE-INN和pE-INC；(2)利用限制性內切酶將蛋白質內含子的N端剪接活性區(qū)域IN和C端剪接活性區(qū)域IC進行重排；(3)將需環(huán)化目的蛋白插入到上述蛋白質內含子剪接活性區(qū)域中間并在兩端加上斷裂的純化標簽；(4)將上述處理后的目的蛋白誘導融合蛋白體內表達；(5)對目的環(huán)化蛋白進行純化，洗脫。本發(fā)明簡單，成本簡單，產率高，適合于工業(yè)化生產。
文檔編號C12N15/70GK101812449SQ20101013990
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權日2010年4月6日
發(fā)明者孟清, 施長華, 李夢夢 申請人:東華大學