專利名稱：：一種血管瘤病變型j亞群禽白血病突變體病毒株及其構(gòu)建方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及微生物
技術領域：
，具體涉及血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒研究領域，尤其涉及一種E元件(XSR)缺失血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株及其構(gòu)建方法。
背景技術：
：本發(fā)明人已經(jīng)從血管瘤病變型禽白血病海蘭褐蛋雞中分離得到血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株，并獲得了血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的全長基因組序列，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示。J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株與ALV-J原型株HPRS-103在LTR(長末端重復區(qū))有相似的特點，即與其它亞群禽白血病病毒相比，在其3’LTR區(qū)域存在一個具有被稱作E元件的發(fā)夾頸環(huán)結(jié)構(gòu)，該元件以前僅存在于急性轉(zhuǎn)化型Rous肉瘤病毒src基因上游或下游，長約150bp。E元件的功能目前還不十分清楚，但它含有轉(zhuǎn)錄因子c/EBP的黏著位點且可發(fā)揮增強子的功能。在對于自然分離的重組嵌合病毒ALV-J/A研究中發(fā)現(xiàn)，E元件與致瘤性有關，但這個研究是以自然分離株為研究對象的，自然分離株存在著眾多的序列突變與缺失，而這些突變或缺失可能都會對病毒的致病性產(chǎn)生影響，從而影響了E元件在病毒致病性及其致病機理的研究。本發(fā)明人根據(jù)血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列，構(gòu)建得到含有該基因序列的質(zhì)粒pSK-ALV-HN，其構(gòu)建步驟如下(1)根據(jù)血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列(其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示)設計六條特異性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:611所示；(2)利用核苷酸序列如SEQIDNO611所示的六條特異引物將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQIDNO5所示)分三段進行擴增，并分別克隆于PMD18-Tsimplevector載體，構(gòu)建得到三個質(zhì)粒，分別命名為pHN-A-T、pHN-B-T和pHN-C_T；以SEQIDNOl所示基因為模板，將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株病毒液接種雞胚成纖維細胞，7天后提取細胞總基因組DNA，做為模板，(3)將質(zhì)粒ρΗΝ-Α-Τ、ρΗΝ_Β_Τ分別用Sail和EcoRI雙酶切消化，回收目的片段，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后，挑取單一菌落鑒定克隆，將獲得的重組質(zhì)粒命名為pHN-(A+B)-T；(4)將pHN-(A+B)-T和pHN-C-T分別用KpnI和NotI雙酶消化，回收目的片段，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后，挑取單一菌落鑒定克隆，將最后獲得的重組質(zhì)粒命名為PMD18-ALV-HN，并測序驗證，結(jié)果證明重組質(zhì)粒PMD18-ALV-HN中含有血管瘤病變型ALV-JSCAU-HN06株前病毒全基因組序列；(5)將質(zhì)粒PMD18-ALV-HN中含有血管瘤病變型ALV-JSCAU-HN06株前病毒全基因組序列亞克隆到pBlueskriptSK(-)載體，得到含有血管瘤病變型ALV-JSCAU-HN06株病毒基因的質(zhì)粒，并命名為pSK-ALV-HN。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一株可用于E元件的病毒致病性及其致病機理研究的E元件缺失血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒株。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒株的構(gòu)建方法。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的一種血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株，該病毒株為J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06，已于2009年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNO:V200914。上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株是采用感染型克隆技術，通過對血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQIDN0:5所示)進行E元件缺失，構(gòu)建而得。上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構(gòu)建方法，具體包括如下步驟(1)特異性引物特異性引物一共四條，其核苷酸序列如SEQIDNO:14所示；(2)采用重疊PCR(OverlappingPCR)技術將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQIDNO5所示)CalI-NotI之間的E(XSR)序列缺失，并構(gòu)建為質(zhì)粒；將該質(zhì)粒用Call，NotI雙酶切消化得到的片段與pSK-ALV-HN中的相應片段進行替換，得到pSK-ALV-HN-ΔE質(zhì)粒；(3)將pSK-ALV-HN-ΔE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒宿主細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后，收獲含有拯救病毒的細胞培養(yǎng)上清，并用該上清感染另一空白宿主細胞，盲傳9代后得到拯救的J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06。上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構(gòu)建過程中，本發(fā)明人通過多次實驗設計以及對實驗結(jié)果的分析，確定選擇血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒上特異的單酶切位點CalI，以及作為載體的質(zhì)粒pSK-ALV-HN上特異的單酶切位點NotI，可以很好地實現(xiàn)序列替換，從而構(gòu)建并拯救出感染性克隆病毒。上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構(gòu)建過程中，將pSK-ALV-HN-ΔE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒宿主細胞，因為ALV不感染哺乳動物細胞，所以這里的病毒宿主細胞采用禽類細胞，采用本領域技術人員常用的禽類細胞均可實現(xiàn)本發(fā)明，如雞胚成纖維細胞(CEF)，或傳代成纖維細胞DF-I等。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明以單一起源的感染性克隆化病毒rSCAU-HN06為基礎，進行E元件缺失，避免了自然分離毒序列中的突變與缺失對研究結(jié)果造成的干擾；2.本發(fā)明設計特異引物，采用OverlappingPCR技術進行序列缺失，簡便易行3.本發(fā)明利用該病毒上特異的單酶切位點Call及載體上NotI位點進行序列替換，構(gòu)建并拯救出感染性克隆病毒4.本發(fā)明采用低拷貝質(zhì)粒pBlueskriptSK(-)為載體，使該質(zhì)粒在菌體中能穩(wěn)定的復制；5.本發(fā)明所構(gòu)建的含有前病毒基因組的質(zhì)粒以大腸桿菌為寄主，轉(zhuǎn)化率高。圖1為質(zhì)粒pSK-ALV-HN-ΔE的構(gòu)建流程圖；圖2為質(zhì)粒pSK-ALV-HN-ΔE的酶切鑒定電泳圖；其中，M為Marker，1為質(zhì)粒ρSK-ALV-HN-ΔE經(jīng)SalI、NotI雙酶切產(chǎn)物，2為質(zhì)粒pSK-ALV-HN經(jīng)Sail、NotI雙酶切產(chǎn)物；圖3為RT-PCR驗證結(jié)果電泳圖；其中，M為Marker，1為E元件缺失片段，2為未缺失片段，3為無模板對照；圖4為感染性病毒驗證結(jié)果熒光顯微電鏡圖。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1特異性引物設計本實施例根據(jù)血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列(其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示)，設計特異性引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:14所示，引物由上海英駿生物技術限公司合成。實施例2血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株1.實驗材料雞胚成纖維細胞、ALV-J亞群特異性單抗JE9由揚州大學獸醫(yī)學院秦愛建教授惠贈；FITC-羊抗鼠IgG為R0CLAND公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品；PrimeSTARHSDNAPolymerase為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶CalI、NotI為Fermentas公司產(chǎn)品；ALV-AgELISA試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品。2.血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構(gòu)建首先是采用OverlappingPCR技術將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQIDNO5所示)CalI-NotI之間的E(XSR)序列缺失，分別用SEQIDNO:1所示特異性引物和SEQIDNO:2所示特異性引物擴增E元件上游序列，用SEQIDNO:3所示特異性引物和SEQIDNO:4所示特異性引物擴增E元件下游序列，將上述兩擴增片段回收，按照等摩爾比混合作為模板，采用SEQIDNO:1所示特異性弓丨物和SEQIDNO:4所示特異性引物，利用融合PCR將兩片段融合，便得到E元件缺失片段，將該片段與PMD18-T載體鏈接，得到陽性質(zhì)粒ρΔΕ-Τ。將ρΔE-T用Call，NotI雙酶切消化，得到的目的片段與pSK-ALV-HN經(jīng)CalI-NotI雙酶切消化的載體片段連接，獲得含有缺失E元件的J亞群禽白血病病毒全長基因組質(zhì)粒pSK-ALV-HN-ΔE(構(gòu)建過程如圖1所示)。用SalI和NotI對質(zhì)粒pSK-ALV-HN-ΔE和pSK-ALV-HN分別進行雙酶切鑒定。如圖2所示，pSK-ALV-HN-ΔE經(jīng)酶切獲得前病毒基因組與載體兩條帶，分別為7496bp和2936bp；pSK-ALV-HN經(jīng)酶切獲得前病毒基因組與載體兩條帶，分別為7642bp和2936bp。證明獲得pSK-ALV-HN-ΔE質(zhì)粒。將pSK-ALV-HN-ΔE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后，收獲含有拯救病毒的細胞培養(yǎng)上清，并用該上清感染另一空白宿主細胞，盲傳9代后提取細胞總RNA為模板，進行RT-PCR驗證。上述RT-PCR驗證也就是以SEQIDNO:1和SEQIDNO:4為引物進行擴增，可以得到特異性條帶，E元件缺失片段大小為875bp，而未缺失的片段大小為1022bp(如圖3所示)，同時測序結(jié)果表明拯救病毒可穩(wěn)定傳代。上述試驗結(jié)果說明轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)上清中包含有本發(fā)明的血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株，該毒株中E元件缺失。實施例3感染型病毒的驗證利用IDEXXALV-AgELISA試劑盒對轉(zhuǎn)染及感然的宿主細胞培養(yǎng)上清進行檢測，轉(zhuǎn)染及感染后細胞培養(yǎng)上清ELISA檢測結(jié)果(表1所示)均為陽性。表IELISA檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>將感染的細胞用甲醇固定后，經(jīng)PBS洗滌，滴加特異性ALV-J單抗JE9，37°C孵育30min，用PBS洗滌，然后加入羊抗小鼠IgG熒光標記抗體，37°C孵育30min，并經(jīng)PBS洗滌，最后在熒光顯微鏡下觀察，感染細胞可觀察到明顯的綠色熒光，且為典型的細胞質(zhì)染色，陰性對照無反應，如圖4所示，圖4中，A為感染的雞胚成纖維細胞，B為空白雞胚成纖維細胞。上述結(jié)果證明成功獲得感染性缺失病毒毒株。權利要求一種血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株，該病毒株為J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06，已于2009年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOV200914。2.權利要求1所述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構(gòu)建方法，其特征在于該病毒株是采用核苷酸序列如SEQIDN0:14所示特異性引物，通過重疊PCR技術對J亞群禽白血病感染性病毒rSCAU-HN06進行E元件缺失，構(gòu)建而得。3.根據(jù)權利要求2所述構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)特異性引物特異性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示；(2)采用重疊PCR技術將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因Call-NotI之間的E序列缺失，并構(gòu)建為質(zhì)粒，所述血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示；(3)將步驟(2)中所得質(zhì)粒用Call，NotI雙酶切消化，所得片段與pSK-ALV-HN經(jīng)Call-NotI雙酶切消化的載體片段連接，得到pSK-ALV-HN-AE質(zhì)粒；(3)將pSK-ALV-HN-AE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒宿主細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后，收獲細胞培養(yǎng)上清，用該上清感染雞胚成纖維細胞后進行盲傳，從而得到所需血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株。4.根據(jù)權利要求3所述構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)中所述病毒宿主細胞為禽類細胞。全文摘要本發(fā)明公開一種血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株及其構(gòu)建方法，該病毒株為J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06，已于2009年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNoV200914。本發(fā)明以單一起源的感染性克隆化病毒rSCAU-HN06為基礎，進行E元件缺失，避免了自然分離毒序列中的突變與缺失對研究結(jié)果造成的干擾。本發(fā)明的構(gòu)建方法簡便易行，而且利用該病毒上特異的單酶切位點CalI及載體上NotI位點進行序列替換，構(gòu)建并拯救出感染性克隆病毒，轉(zhuǎn)化率高，能穩(wěn)定復制。文檔編號C12N7/08GK101831408SQ20101014019公開日2010年9月15日申請日期2010年3月30日優(yōu)先權日2010年3月30日發(fā)明者廖明,張賀楠,徐成剛,曹偉勝,羅開健,賴漢漳,辛朝安申請人:華南農(nóng)業(yè)大學