專利名稱：用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體及應(yīng)用及控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在銅綠假單胞菌PAOl中czcCBA的表達(dá)受鋅、銅離子調(diào)控的現(xiàn)象，基于此調(diào)節(jié)機(jī)制構(gòu)建的用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體，以及應(yīng)用此表達(dá)載體在假單胞菌屬細(xì)菌中控制目的基因產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法。
背景技術(shù)：
假單胞菌屬細(xì)菌，在自然界中廣泛存在，對動、植物也具有一定的危害性，能引發(fā)多種疾病和農(nóng)作物病害(Microbiol Rev, 1996,60 :539-74. J Bacteriol, 2008,190(8) 2858-2870.)；但同時，假單胞菌屬細(xì)菌已經(jīng)被應(yīng)用于生物診斷、生物除污和蛋白工業(yè)化生產(chǎn)等領(lǐng)域(Biosensors&bioelectronics，2001，16 :337-353. J IndMicrobiol Biotrchnol, 2005,32(4) :148-154. Annu Rev Phytopathol，2005，43 :337-59.)。銅綠假單胞菌是假單胞菌屬的代表菌種，是一類機(jī)會致病菌，它對人類的危害，隨著其耐藥性的增強(qiáng)而日益嚴(yán)重， 細(xì)菌的多重耐藥性在全世界范圍內(nèi)擴(kuò)增，威脅著整個人類的健康以及生存。所以，對假單胞菌屬細(xì)菌，尤其是銅綠假單胞菌的研究，對了解其蛋白功能、耐藥性產(chǎn)生原因和指導(dǎo)用藥， 以及其他領(lǐng)域的應(yīng)用均有重要意義。傳統(tǒng)的蛋白表達(dá)載體，一般是在大腸桿菌中表達(dá)，并受到IPTG的誘導(dǎo)，如表達(dá)載體pPROEX HT(Invitrogen)、pMAL-PEA原核分泌型表達(dá)載體(解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2004， 29(2) :156-8.)等。還有一些表達(dá)載體在假單胞菌中可以表達(dá)，但是其表達(dá)式不可控的，如 ￥1^03(應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2008，14 0) :5觀_33)。因此，在自身環(huán)境下，研究一些蛋白功能還存在這一些不便，如持家基因的確定，融合蛋白的可控表達(dá)等。所以，構(gòu)建一種在銅綠假單胞菌中可控的表達(dá)載體，對解決這些問題有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有的蛋白表達(dá)載體只表達(dá)不可控的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用鋅、銅等金屬離子對銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域以及假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA表達(dá)有開關(guān)及調(diào)控作用，構(gòu)建了一套假單胞菌屬細(xì)菌中工作的表達(dá)載體，通過控制鋅、銅離子的濃度，達(dá)到控制目的基因表達(dá)量的目的，包括確定假單胞菌屬細(xì)菌的持家基因、mRNA表達(dá)、互補(bǔ)試驗等。本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體，其特殊之處在于所述載體采用以下方法制備1把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子，得到過渡載體4，從過渡載體4上取一段包含基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域和終止子的序列1 ；2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2 ；把序列1和中間片段2連接成中間載體3 ；3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pI^ROEX HTa中得到第一片段D1、從pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、 第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、pLY-C。上述把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子的方法是把銅綠假單胞菌 PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域連入質(zhì)粒PMS402或把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域連入質(zhì)粒 pHP45_omega0用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體在純化中的應(yīng)用。用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體在發(fā)酵或重金屬濃度檢測中的應(yīng)用。一種控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，其特殊之處在于其包括以下步驟1取銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域；2組建以銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl 基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域為核心組成元件的載體A;3把載體A轉(zhuǎn)入生長在培養(yǎng)基中的假單胞菌屬細(xì)菌或整合至生長在培養(yǎng)基中的假單胞菌屬細(xì)菌的染色體上；4在步驟3中所述的培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，控制目的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生。上述組建以銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌 PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域為核心組成元件的載體A的體步驟2. 1把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子，得到過渡載體4，從過渡載體4上取一段包含銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域和終止子的序列1 ；2. 2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2 ；把序列1和中間片段2連接成中間載體3 ；2. 3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pPROEX HTa中得到第一片段D1、從 pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；2. 4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、 pLY-C ；2. 5選取插入不含核糖體結(jié)合位點(RBS)的目的基因片段到多克隆位點后， 能夠使銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇 czcCBA同源基因起始密碼子到目的基因起始密碼子的堿基數(shù)是3的整數(shù)倍的可控表達(dá)載體(pLY-A、pLY-B、pLY-C)中的一個；把不含核糖體結(jié)合位點(RBQ的目的基因片段連入選取的該載體的多克隆位點，形成第二載體E ；上述在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生的具體步驟在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或 mRNA的產(chǎn)生；所述二價鋅離子濃度范圍為IOyM 7mM，二價銅離子濃度范圍為10 μ M 30mM。上述組建以銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌 PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域為核心組成元件的載體D的具體還可以包括以下步驟2. 1把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl 基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子，得到過渡載體4，從過渡載體4上取一段包含基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域和終止子的序列1 ；2. 2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2 ；把序列1和中間片段2連接成中間載體3 ；2. 3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pPROEX HTa中得到第一片段D1、從 pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；2. 4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、pLY-C ；2. 5任取可控表達(dá)載體pLY中的一個，把含有核糖體結(jié)合位點(RBQ的目的基因片段，連入該載體的多克隆位點，形成第三載體F ；上述在步驟3的培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生的具體步驟在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，通過加入離子濃度的不同，控制目的基因表達(dá)量的不同，進(jìn)而控制目的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生；所述二價鋅離子濃度范圍為10 μ M 7mM，二價銅離子濃度范圍為10 μ M 30mM。一種控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，其包括以下步驟1在銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA或假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域后，連入一段目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株；2在生長有重組菌株的培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生。上述步驟1是在銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA及假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域后，直接連入一段含有核糖體結(jié)合位點RBS的目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株F。上述步驟1是選取銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA或假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的起始密碼子到目的基因起始密碼子的堿基數(shù)是3的整數(shù)倍的位置連入不含核糖體結(jié)合位點(RBQ的目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株G。本發(fā)明所具有的有益效果本發(fā)明提供了一種利用鋅、銅等金屬離子對銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA表達(dá)有開關(guān)及調(diào)控作用， 構(gòu)建了一套假單胞菌屬細(xì)菌中工作的表達(dá)載體，通過控制鋅、銅離子的濃度，達(dá)到控制目的基因表達(dá)量的目的，實用性強(qiáng)。


圖1為β -半乳糖苷酶試驗的表達(dá)曲線，IacZ插入到銅綠假單胞菌PAOl染色體上，基因簇czcCBA的czcC中間，鋅離子在培養(yǎng)基中濃度為500 μ M(菱形)，400 μ M(星號)， 300 μ M(方塊)，200 μ M(十字)，100 μ Μ(圓形)和 ΟμΜ(三角)；圖2為銅綠假單胞菌PAOl (pKD-czc)在BHI培養(yǎng)基中含有不同濃度鋅離子時的表達(dá)曲線，鋅離子在培養(yǎng)基中濃度為500 μ M (菱形)，250 μ M (方塊)和0 μ M (三角)；圖3為可控表達(dá)載體pLY-A的圖譜，pLY-B在酶切位點BamHI前與pLY_A相比多了一個堿基g，pLY-C在酶切位點BamHI前與pLY_A相比多了兩個個堿基g ；圖4為銅綠假單胞菌PAOl (pLY-B-LuxAB⑶E)在含有不同鋅離子濃度的肉湯培養(yǎng)基(LB)固體平板上的發(fā)光情況a圖是白光圖片，b圖是化學(xué)發(fā)光片圖；圖5為銅綠假單胞菌PAOl (pLY-C-SacB)的生長情況照片腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基固體平板中均含有10%的蔗糖，a圖中固體平板中含有ΟμΜ鋅，b圖中固體平板中含有 200 μ M鋅，c圖中固體平板中含有400 μ M鋅。
具體實施例方式一種用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體，載體采用以下方法制備1把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前連入終止子，得到過渡載體4，從過渡載體4上取一段包含基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域和終止子的序列1 ；例如在銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域連入質(zhì)粒PMS402得到的是報告子pKD-czc，從其上得到的序列1含有基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域、卡納霉素抗性(KANR)基因和終止子。把惡臭假單胞菌KTM40中的基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域，連入質(zhì)粒pHP45-omega(Gene 29， 303-313，1984)上，得到過渡載體4，從過渡載體4上取一段包含基因簇czcCBA啟動子區(qū)域和終止子的序列1。2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2，把序列 1和中間片段2連接成中間載體3 ；3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pPROEX HTa中得到第一片段D1、從pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、 第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、pLY-C ；一種控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，有兩種方法
第一種方法，包括以下步驟1取銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域；2組建以銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl 基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域為核心組成元件的載體A，具體包括以下步驟2. 1把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域連入質(zhì)粒pMS402得到的是報告子pKD-czc，從報告子pKD-czc上取一段包含銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域、卡納霉素抗性(KANR)基因和終止子的序列1 ；2. 2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2 ；把序列1和中間片段2連接成中間載體3 ；2. 3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pPROEX HTa中得到第一片段D1、從 pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；2. 4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、 pLY-C ；2. 5選取把目的基因連入多克隆位點后，能夠使銅綠假單胞菌PAOl基因簇 czcCBA的起始密碼子到目的基因起始密碼子的堿基數(shù)是3的整數(shù)倍的可控表達(dá)載體 (pLY-A、pLY-B、pLY-C)中的一個；把不含核糖體結(jié)合位點(RBS)的目的基因片段連入選取的該載體的多克隆位點，形成第二載體E ；3把第二載體E轉(zhuǎn)入生長在培養(yǎng)基中的銅綠假單胞菌屬細(xì)菌；4在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA 的產(chǎn)生；所述二價鋅離子濃度范圍為10 μ M 7mM，二價銅離子濃度范圍為10 μ M 30mM。第二種方法1取銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域；2組建以銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl 基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域為核心組成元件的載體D ；具體包括以下步驟2. 1在銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl 基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子，得到過渡載體4，從過渡載體4上取一段包含基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域、卡納霉素抗性(KANR)基因和終止子的序列1 ；2. 2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2 ；把序列1和中間片段2連接成中間載體3 ；2. 3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pPROEX HTa中得到第一片段D1、從 pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；2. 4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、pLY-C ；2. 5任取可控表達(dá)載體pLY中的一個，把含有核糖體結(jié)合位點(RBQ的目的基因片段，連入該載體的多克隆位點，形成第三載體F ；3把第三載體F轉(zhuǎn)入生長在培養(yǎng)基中的假單胞菌屬細(xì)菌中。4所述在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或 mRNA的產(chǎn)生的具體步驟在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或銅離子，通過加入離子濃度的不同，控制目的基因表達(dá)量的不同，控制目的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生；所述二價鋅離子濃度范圍為 10 μ M 7mM, 二價銅離子濃度范圍為10 μ M 30mM。一種控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，包括以下步驟1在銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA或假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域后，連入一段目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株G ；對于步驟1有兩種情況一種是連入目的基因含有核糖體結(jié)合位點RBS 在銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA及假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域后，直接連入一段含有核糖體結(jié)合位點RBS的目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株F ；—種是連入目的基因不含有核糖體結(jié)合位點RBS 選取銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA或假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的起始密碼子到目的基因起始密碼子的堿基數(shù)是3的位置連入不含核糖體結(jié)合位點RBS的目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株G。2在生長有重組菌株F或G的培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生。銅綠假單胞菌中基因簇czcCBA是金屬離子抗性相關(guān)基因(J Bacteriol, 1997, 179 :6871-9 ；Gene, 1999, 238 :417-25 ;J Biol Chem，2004，279 :8761-8)。本發(fā)明通過把基因片段IacZ插入到銅綠假單胞菌PAOl基因czcC中，用β -半乳糖苷酶試驗證實，二價鋅離子對基因簇czcCBA的表達(dá)有著開關(guān)和調(diào)控作用(圖1)。隨后把基因簇czcCBA啟動子區(qū)域用PCR的方法擴(kuò)增出來，連入質(zhì)粒pMS402 (Mol Microbiol 2003,50 1477-91)，構(gòu)建成報告子pKD-czc，轉(zhuǎn)入到銅綠假單胞菌PAOl中后，也證實了這個調(diào)控機(jī)理(圖2)。從銅綠假單胞菌PAOl中基因簇czcCBA啟動子受鋅、銅離子調(diào)節(jié)現(xiàn)象這一點出發(fā)，利用質(zhì)粒pMS02、 PUCP26和pPROEX HT系統(tǒng)的部分結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了一套低背景、可控的、在假單胞菌屬細(xì)菌中工作的表達(dá)系統(tǒng)。從銅綠假單胞菌PAOl中基因簇czcCBA表達(dá)受鋅、銅等二價金屬離子嚴(yán)格調(diào)控的特點出發(fā)，利用質(zhì)粒PMS402、pUCP26和pPROEX HT構(gòu)建成了一組銅綠假單胞菌屬細(xì)菌可控蛋白表達(dá)載體pLY-A、pLY-B和pLY-C。通過PAOl在不同培養(yǎng)基中的生長情況，確定鋅離子在肉湯培養(yǎng)基LB中有效濃度是500 μ M且不影響生長，在BHI培養(yǎng)基中是600 μ M且不影響生長。如本發(fā)明應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)中的菌體裂解，可以加大鋅離子濃度。在肉湯培養(yǎng)基(LB)中不影響生長情況下的有效濃度范圍為50 μ M 500 μ Μ,其誘導(dǎo)效果在濃度為500士50 μ M時達(dá)到峰值，此為最佳抑制濃度；而50μ g/ml被定為可用的最低誘導(dǎo)濃度；在腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基中不影響生長情況下的有效濃度范圍100 μ M 600 μ Μ,其誘導(dǎo)效果在濃度為600士50 μ M時達(dá)到峰值，此為最佳抑制濃度；而100 μ g/ml被定為可用的最低誘導(dǎo)濃度。當(dāng)鋅離子濃度達(dá)到6 7mM時， 菌體能生長。以下為幾種設(shè)計過程(1)質(zhì)粒pMS402是帶有缺失啟動子的報道基因IuxCDABE的載體(MolMicrobiol， 2003,50 :1477-1491)?；虼豤zcCBA的啟動子區(qū)域包含RBS位點經(jīng)PCR擴(kuò)增，模板為PAOl 染色體DNA，引物根據(jù)PAOl基因組序列(Nature，2000，406 :959-964)設(shè)計?；虼豤zcCBA 啟動子，上游引物TCTCTCGAGGTTGCCGAAGTGTAAC ；下游引物CAGGATCCGAAGTATCGGCATG。下劃線為Xho I和BamHI用于克隆的內(nèi)切酶位點。DNA 聚合BK吏用高 呆真 Pfu DNA polymerase (Invitrogen) ο PCR^吏用 Eppendorf Mastercycler Gradient PCR 儀，反應(yīng)條件95°C，2 分鐘；95°C，40 秒；52°C，40 秒；72°C，1 分鐘；30 個循環(huán)；72°C，10分鐘。PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(2)上述PCR產(chǎn)物通過BioI和BamHI酶切位點克隆到質(zhì)粒pMS402上，得到報告子 pKD-czc，并轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌PAOl中。選用不同濃度鋅離子分別加入多孔板中，測量報告子pKD-czc發(fā)光的強(qiáng)度，檢測其活性，發(fā)現(xiàn)其發(fā)光強(qiáng)度隨鋅離子濃度升高而增大，沒有鋅離子，基因簇czcCBA啟動子不表達(dá)，如圖2所示，這個結(jié)果和圖1結(jié)果相吻合。(3)以報告子pKD-czc序列設(shè)計引物，上游引物TCCCGTGACAGGTCATTCAG ；下游引物 CAGGATCCGAAGTATCGGCATG。DNA 聚合酶使用高保真 Pfu DNA polymerase (Invitrogen)。反應(yīng)條件:95°C，2 分鐘；950C，40 秒；61°C，40 秒；72°C，2 分鐘；30 個循環(huán)；72°C，10 分鐘。PCR 產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。產(chǎn)物包括czcCBA基因啟動子和其上游的卡納霉素抗性基因和終止子。(4)質(zhì)粒 pUCP26 (J Bacteriol. 1982 Apr ； 150 (1) :60-9.)，用 SfiI 和 AflIII 酶切，用T4D A Polymerase(NEB)對產(chǎn)物末端進(jìn)行平滑化，得到產(chǎn)物與上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒用EcoRV驗證方向，構(gòu)成質(zhì)粒pUCP27。(5)以pPROEX序列設(shè)計引物，上游引物GAAACAGACCATGTCGTAC ；下游引物 GAGTAAACTTGGTCTGACAG。分別以 HTa、Η Ικ HiTc 為模板。DNA 聚合酶使用高保真 Pfu DNA polymerase (Invitrogen) 反應(yīng)條件95°C，2 分鐘；95°C，40 秒；61 °C，40 秒；72°C，2 分鐘； 30個循環(huán)；72°C，10分鐘。PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(6)對(4)中得到的質(zhì)粒PUCP27用BamHI酶切，末端平滑化。得到的產(chǎn)物分別和 (5)中得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，用EcoRV驗證方向。建成可控表達(dá)載體pLY-A、pLY-B和 pLY-C。pLY-A 圖譜見圖 3。用基因簇czcCBA啟動子的上游引物TCTCTCGAGGTTGCCGAAGTGTAAC引物對得到的產(chǎn)物分別測序。鋅離子濃度的確定為測量鋅離子的有效濃度范圍，在多孔板中做1/2濃度梯度測試，確定鋅離子的用量。兩個報道體系PAOl (pKD-czc)和PA01(pLY-B-LuxAB⑶E)，在不同培養(yǎng)基中測定鋅離子最小誘導(dǎo)濃度和最小抑制濃度。使用含合適抗生素的LB和BHI液體培養(yǎng)基，在底部透明的黑色的多孔板中進(jìn)行測試。報道體系PAOl (pKD-czc)和PAOl (pLY-B-LuxAB⑶Ε)過夜培養(yǎng)菌液，轉(zhuǎn)接、稀釋后接種至多孔板中。然后每孔加入不同濃度的鋅離子，并以無菌過濾后的礦物油或無菌透明塑料膜覆蓋。多孔板在多標(biāo)記分析儀Wallac Victor 1420上，間歇震蕩，每隔半小時測量其生長(0D600)和發(fā)光值(counts per second, CPQ。若對基因簇 czcCBA啟動子有誘導(dǎo)，發(fā)光值則會明顯升高。實施例1以報告子pKD-czc為例，以IOmM硫酸鋅為起始濃度作一系列梯度稀釋，得到不同濃度的鋅離子對基因簇czcCBA啟動子呈現(xiàn)出不同程度的誘導(dǎo)作用，在LB培養(yǎng)基中不影響生長情況下的有效濃度范圍為50 μ M 500 μ Μ,其誘導(dǎo)效果在濃度為500 μ M時達(dá)到峰值， 此為最佳抑制濃度；而50 μ g/ml被定為可用的最低抑制濃度；在BHI培養(yǎng)基中不影響生長情況下的有效濃度范圍為200 μ M 600 μ Μ，其誘導(dǎo)效果在濃度為600 μ M時達(dá)到峰值，此為最佳抑制濃度；而200 μ g/ml被定為可用的最低抑制濃度。用固體平板對所構(gòu)建篩選體系對表達(dá)目的蛋白的有效性檢驗用不含RBS位點IuxAB⑶E驗證表達(dá)載體pLY是否正常工作。用KpnI酶切質(zhì)粒pUCP-Not-LuxABCDE，得到?jīng)]有RBS位點的IuxABCDE片段；經(jīng)計算堿基數(shù)，選擇PLY-B，用相同酶切處理后，與IuxAB⑶E片段連接，得到產(chǎn)物用NotI驗證方向。構(gòu)建成的質(zhì)粒pLY-B-LuxABCDE。把上述質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入野生型銅綠假單胞菌PA01，使用含有四環(huán)素 (Tc, 100 μ g/ml)的LB固體平板篩選陽性克隆。蛋白表達(dá)量的可控性(化學(xué)發(fā)光)的驗證，使用LB固體培養(yǎng)基中四環(huán)素 (TclOO μ g/ml)，分別混合0 μ Μ、300 μ Μ、600 μ M硫酸鋅，搖勻倒平板。待平板凝固晾干后， 將平板分為6個相等的區(qū)域，用報道體系PAOKpLY-B-LuxABOTE)在每個區(qū)上劃線，37°C 下過夜培養(yǎng)。在熒光/化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)LAS-3000中成像，觀測記錄發(fā)光強(qiáng)度及其變化。圖5是不同濃度鋅離子在固體培養(yǎng)基上對報道體系PAOl (pLY-B-LuxAB⑶E)生長和發(fā)光的影響。在相同條件下，這些二價鋅離子濃度對PAOKpLY-B-LuxABOTE)生長基本沒有影響。但是，含0 μ M硫酸鋅平板上生長的細(xì)菌沒有發(fā)光，而在含300 μ M硫酸鋅和 600 μ M平板上生長的細(xì)菌有發(fā)光，但沒有明顯梯度增高。這一結(jié)果表明鋅離子調(diào)控質(zhì)粒 pLY-B-LuxAB⑶E上IuxAB⑶E的蛋白表達(dá)與否，但沒有明顯的調(diào)控作用。圖如是實驗組和對照組的白光照片；圖4b是化學(xué)發(fā)光照片。圖4表明pLY-B-LuxAB⑶E具有開關(guān)特性。含有鋅離子的平板上，報告體系發(fā)光量沒有明顯的梯度變化，說明這組報告體系沒有明顯的調(diào)控作用。但是，這個體系在液體培養(yǎng)基中，用多標(biāo)記分析儀Wallac Victor 1420不能檢測到發(fā)光，說明這個啟動子雖然受到鋅離子的調(diào)節(jié)，但是是一個弱啟動子。實施例2用含有RBS位點sacB驗證表達(dá)載體pLY是否能正常工作。用上游引物5，-CGCGGATCCGGAGACATGAACGATGAACA-3，(下劃線是BamHI 酶切位點) 和下游引物5，-CTGGAATTCGGCATTTTCTTTTGCG-3，(下劃線是EcoRI酶切位點)擴(kuò)增。DNA 聚合酶使用高保真 Pfu DNA polymerase (Invitrogen)，以質(zhì)粒 pEX18-Tc (Mol Microbiol, 1992，6 :1195-204)為模板。反應(yīng)條件95°C，2 分鐘；95°C，40 秒；58°C，40 秒；72°C，1 分鐘； 30個循環(huán)；72°C，10分鐘。PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增得到含有RBS位點的sacB片段，用BamHI和EcoRI進(jìn)行酶切，和用相同酶處理的pLY_C連接。構(gòu)建成的質(zhì)粒命名為 pLYC-SacB。把上述質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入野生型銅綠假單胞菌PA01，使用含有四環(huán)素 (Tc,100yg/ml)的LB固體平板篩選陽性克隆。蛋白表達(dá)量的可控性(生長狀況)的驗證，使用BHI固體培養(yǎng)基(含100 μ g/ml的Tc)，在培養(yǎng)基中分別加入硫酸鋅0 μ M，200 μ M 和400μΜ。搖勻倒平板。待平板凝固晾干后，將平板分為3個相等的區(qū)域，用報道菌株 PAOl (pLY-C-SacB)，野生型PAOl和對照菌株P(guān)AOl (pLY-C)在每個區(qū)上劃線，37°C下過夜培養(yǎng)。觀測其生長情況。若培養(yǎng)基中沒有鋅離子，報道菌株和對照菌株均生長，但野生型PAOl不生長；若培養(yǎng)基中有鋅離子，報道菌株不生長或長的不好，說明這組蛋白表達(dá)體系具有開關(guān)作用；如果菌體生長情況隨著鋅離子濃度升高而變壞，則說明這組蛋白表達(dá)系統(tǒng)是可控的。圖5表明pLY-C-SacB具有開關(guān)及調(diào)控特性。實施例3報告子PKD-CZC在銅綠假單胞菌中受鋅調(diào)節(jié)的現(xiàn)象(圖2)證明，利用這個啟動子，可以達(dá)到控制表達(dá)mRNA的特性，可用于基因沉默等試驗。同時，這個報告子在大腸桿菌中不表達(dá)，也不受鋅的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。所以，構(gòu)建的表達(dá)載體只能在銅綠假單胞菌及假單胞菌屬細(xì)菌中工作。實施例4基因IacZ插入到銅綠假單胞菌中基因簇czcCBA啟動子后，受鋅調(diào)節(jié)的現(xiàn)象(圖 1)證明，利用這個啟動子，可以達(dá)到控制表達(dá)mRNA的特性，可用于基因沉默等試驗。實施例5利用克隆有溶菌作用基因的此表達(dá)體系，在利用假單胞菌屬細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，菌體內(nèi)涵物的釋放環(huán)節(jié)，加入大量的鋅離子，促使溶菌基因的表達(dá)，達(dá)到釋放出細(xì)胞內(nèi)含物的目的。PLY表達(dá)系統(tǒng)，是一個嚴(yán)格控制的表達(dá)系統(tǒng)，鋅、銅離子的濃度對克隆入所述載體中的基因，在假單胞菌屬細(xì)菌中mRNA、蛋白的表達(dá)量過程中有著嚴(yán)格的調(diào)控作用。應(yīng)用對于將不含核糖體結(jié)合位點(RBS)的目的基因片段連入選取的本發(fā)明載體的多克隆位點，并保證連入后czcCBA的起始密碼子到目的基因起始密碼子之間的堿基數(shù)是3的整數(shù)倍，形成第二載體E。表達(dá)目的基因得到產(chǎn)物含有一個組氨酸標(biāo)簽，因此可以利用(鎳柱)蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化；也可以用于發(fā)酵，在載體中連入溶菌酶基因，轉(zhuǎn)入假單胞菌屬細(xì)菌中或整合到假單胞菌屬細(xì)菌的染色體上，在假單胞菌屬細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)后期，培養(yǎng)基中加入合適濃度鋅或銅離子，誘導(dǎo)溶菌酶基因表達(dá)，導(dǎo)致菌體裂解，釋放內(nèi)涵物；還可用在檢測中，也就是在載體中連入Iux基因或其他報道基因，轉(zhuǎn)入假單胞菌屬細(xì)菌中在含有合適比例環(huán)境樣品的培養(yǎng)基中生長，通過發(fā)光程度檢測環(huán)境中重金屬濃度，推算出環(huán)境中重金屬離子的濃度。對于含有核糖體結(jié)合位點(RBS)的目的基因片段，連入該載體的多克隆位點，形成第三載體F。這個可以用于發(fā)酵以及重金屬離子的濃度檢測。對于在銅綠假單胞菌PAOl的基因簇czcCBA啟動子后或在假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl的基因簇czcCBA同源的基因啟動子后連入一段含核糖體結(jié)合位點(RBS) 的目的基因，形成重組菌株F ；也可以在銅綠假單胞菌PAOl的基因簇czcCBA啟動子后或在假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl的基因簇czcCBA同源的基因啟動子后連入一段不含核糖體結(jié)合位點(RBS)的目的基因，并保證連入后czcCBA的起始密碼子到目的基因起始密碼子之間的堿基數(shù)是3的整數(shù)倍，形成的重組菌株G，均可以用于發(fā)酵和檢測。序列表<110>西北大學(xué)<120>用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體及應(yīng)用及控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA 產(chǎn)生的方法<160>3<210>1<211>7454<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(474). . . (1672)<223>四環(huán)素抗性基因<220><221>rep_origin<222X2497). .. (3085)<220><221>terminator<222> (3158)... (3289)<220><221>CDS<222>(4153). . . (3362)<223>卡那霉素抗性基因<220><221>Promoter<222>(4371). . . (4593)<223>銅綠假單胞菌PAOl中基因簇czcCBA啟動子區(qū)域<220><221>CDS<222>(5314). . . (6172)<223>氨芐青霉素抗性基因<220><221>rep_origin<222> (7445). .. (6211)<400>1agcttgagta ttctatagtg tcacctaaat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 60
權(quán)利要求
1.一種用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體，其特征在于所述載體采用以下方法制備1把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子，得到過渡載體4，從過渡載體 4上取一段包含基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域和終止子的序列1 ；2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2 ；把序列1和中間片段2連接成中間載體3;3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pPROEX HTa中得到第一片段Dl、從pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、 第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、pLY_C。
2.根據(jù)權(quán)1所述的用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體，其特征在于所述把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇 czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子的方法是把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA 的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域連入質(zhì)粒PMS402或把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域連入質(zhì)粒pHP45-0mega。
3.用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體在純化中的應(yīng)用。
4.用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體在發(fā)酵或重金屬濃度檢測中的應(yīng)用。
5.一種控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，其特征在于其包括以下步驟1取銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌 PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域；2組建以銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域為核心組成元件的載體A;3把載體A轉(zhuǎn)入生長在培養(yǎng)基中的假單胞菌屬細(xì)菌或整合至生長在培養(yǎng)基中的假單胞菌屬細(xì)菌的染色體上；4在步驟3中所述的培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，控制目的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，其特征在于 組建以銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域為核心組成元件的載體A的具體步驟·2. 1把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子，得到過渡載體4，從過渡載體 4上取一段包含銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域和終止子的序列1 ；·2. 2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2 ；把序列1 和中間片段2連接成中間載體3 ；·2. 3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pPROEX HTa中得到第一片段Dl、從pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；.2. 4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、pLY-C ； 2. 5選取插入不含核糖體結(jié)合位點(RBS)的目的基因片段到多克隆位點后，能夠使銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因起始密碼子到目的基因起始密碼子的堿基數(shù)是3的整數(shù)倍的可控表達(dá)載體(pLY-A、 pLY-B、pLY-C)中的一個；把不含核糖體結(jié)合位點(RBQ的目的基因片段連入選取的該載體的多克隆位點，形成第二載體E ；所述在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或 mRNA的產(chǎn)生的具體步驟在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA 的產(chǎn)生；所述二價鋅離子濃度范圍為10 μ M 7mM，二價銅離子濃度范圍為10 μ M 30mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，其特征在于 組建以銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域為核心組成元件的載體D的具體步驟.2. 1把銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA或假單胞菌屬中與銅綠假單胞菌PAOl基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域前加入終止子，得到過渡載體4，從過渡載體4上取一段包含基因簇czcCBA的啟動子區(qū)域和終止子的序列1 ；.2. 2去掉質(zhì)粒pUCP^中的多克隆位點和啟動子PLac區(qū)域，得到中間片段2 ；把序列1 和中間片段2連接成中間載體3 ；.2. 3用PCR擴(kuò)增，從表達(dá)載體pPROEX HT的pPROEX HTa中得到第一片段Dl、從pPROEX HTb中得到第二片段D2、從pPROEX HTc中得到第三片段D3，所述第一片段D1、第二片段D2、 第三片段D3分別包括多克隆位點和多聚組氨酸標(biāo)簽；.2. 4將所述第一片段D1、第二片段D2、第三片段D3分別連入中間載體3，得到用于假單胞菌屬的可控表達(dá)載體PLY，所述可控表達(dá)載體pLY相應(yīng)包括pLY-A、pLY-B、pLY-C ；.2. 5任取可控表達(dá)載體pLY中的一個，把含有核糖體結(jié)合位點(RBQ的目的基因片段， 連入該載體的多克隆位點，形成第三載體F ；所述在步驟3的培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生的具體步驟在培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或二價銅離子，通過加入離子濃度的不同，控制目的基因表達(dá)量的不同，進(jìn)而控制目的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生；所述二價鋅離子濃度范圍為 10 μ M 7mM, 二價銅離子濃度范圍為10 μ M 30mM。
8.—種控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，其特征在于其包括以下步驟1在銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA或假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌 PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域后，連入一段目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株；2在生長有重組菌株的培養(yǎng)基中加入二價鋅離子或銅離子，控制目的基因的蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生或mRNA的產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，其特征在于所述步驟1是在銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA及假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的啟動子區(qū)域后，直接連入一段含有核糖體結(jié)合位點RBS的目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株F。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，其特征在于所述步驟1是選取銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA或假單胞菌屬細(xì)菌中與銅綠假單胞菌PAOl染色體的基因簇czcCBA同源基因的起始密碼子到目的基因起始密碼子的堿基數(shù)是3的整數(shù)倍的位置連入不含核糖體結(jié)合位點(RBQ的目的基因，得到生長在培養(yǎng)基中的重組菌株G。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體及應(yīng)用及控制目的蛋白產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法，具體涉及在銅綠假單胞菌PAO1中czcCBA的表達(dá)受鋅、銅離子調(diào)控的現(xiàn)象，基于此調(diào)節(jié)機(jī)制構(gòu)建的用于假單胞菌屬細(xì)菌的可控表達(dá)載體，以及應(yīng)用此表達(dá)載體在假單胞菌屬細(xì)菌中控制目的基因產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)生的方法。解決了現(xiàn)有的蛋白表達(dá)載體只表達(dá)不可控的技術(shù)問題，實用性強(qiáng)。
文檔編號C12Q1/68GK102212544SQ20101014348
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者楊亮, 段康民 申請人:西北大學(xué)